光谱紫红质

光谱紫红质 , 无论是理,工,农,医学和药物学等学术界还是业务界,任何一个部门,在使用有机化合物时,都需知道原料,产物,副产物,代谢物,分解产物(成分),添加物和杂质等各种有机化合物的结构. , 我们是进行药物学研究的,对药物成分结构的了解尤为重要。 ,提高产品质量，制定药品质量控制标准 ,鉴定中药真伪; ,为炮制加工、栽培、贮存药材提供依据; ,开发药源; ,为合成新药，改造药物提供依据; ,例如，中药材黄芩的炮制质量要求 ,例如，由吗啡导致哌替啶(度冷丁)的发现。 ,例如，由五味子丙素到联苯双酯的发现 , 过去有机化合物的结构鉴定 ,经典方法， ,颜色反应， ,元素分析， ,化学降解 ,合成等 , 例如吗啡(morphine) ,1803年鸦片中分离得到纯品 ,1847年确定分子式 ,1881年从其锌粉蒸馏物中得到菲， ,1925年在大量工作的基础上，Gulland和Rlbinson才有可能提出吗啡的结构式。 ,1952年完成吗啡的全合成 ,第二次世界大战结束以后，有机化合物的结构测定经历了巨大的变化，这归功于科学家将物理学的成就应用于化学的结果经典的化学方法己让位于现代谱学分析。这就是实验室较常用的“四谱”。 紫外 (Ultra-violet Absorption Spectrometry UV) 红外 (Infrared Absorption Spectroscopy IR) 质谱 (Mass Spectrometry MS) 核磁共振 (Nuclear Megnetic Resonance Spectroscopy NMR). 一、化合物的纯度测定和判断 ,结晶型化合物 ,晶形、色泽一致 o,熔点明显和熔距(1,2C) ,液体化合物 o,沸点恒定、沸距应1C左右 ,薄层检查:三种展开条件均一个斑点(Rf值:0.3-0.7) ,气相层析 ,高压液相层析 ,均显示一个峰。 结构研究的主要程序 (一) (注意观察样品在提取、分离过程中的现象。 1 2(测定有关理化性质，如不同pH、不同溶剂中的溶解度及层析行为、灼烧试验、化学定性反 应等。 3.结合文献调研。 (二) 1(分子式测定可采用下列某种方法: ,元素定量分析，分子量测定; ,同位素峰法; ,高分辨质谱(HR,MS) ,计算不饱和度。 不饱和度的计算: CHO342 (三) 1(官能团定性及定量分析。 1132(测定并解析化合物的有关光谱，如UV、IR、MS、HNMR及CNMR。 3. 结合文献调研。 (四) 1(综合分析光谱解析及官能团定性、定量分析结果。 2(与己知化合物进行比较或化学沟通(化学降解、衍生物制备或人工合成)。 3. 进行文献调研。 (五) 1(测定CD或ORD谱。 2(测定NOE谱或2D,NMR谱。 3(进行X,线衍射分析。 4. 进行人工合成 第一章 质谱(MS) o,质谱是记录分析样品在质谱仪中经高温(300C)气化，气态分子受一定能量冲击，失去电子后生成带正电的阳离子，在稳定的磁场中按质荷比(m/z)顺序进行分离，通过检测器记录而得到质谱图。图谱中每个峰代表一个质量数。 ,质谱两个突出的优点: •质谱的灵敏度远远超过其它方法，样品用量不断降低; •质谱是唯一可以确定分子式的方法，而分子式对推测结构至关重要。为推测结构若无分子式，一般至少也需知道未知物的分子量。 , 在质谱测试中，根据所采用的离子源的不同将所得质谱分为: 1.电子轰击质谱(EI,MS) 样品加热气化，在一定能量的电子冲击下，分子发生电离和裂解而产生各种阳离子。容易发生热分解的化合物，如醇、糖甙、等，往往测不到分子离子峰，只能看到碎片离子峰。 ,样品不经气化与载体表面形成一个薄层，再与电极接触，在强电场的作用下电离为阳离子，本法无须将样品加热气化即可使化合物电离，故对难挥发、极性强和热不稳定的化合物。检出,11灵敏度高(可达10g)，谱图也比较单纯)。 ,通常将样品与甘油混合由载体引入，分子经快速原子氩轰击后进入质谱仪。这种方法适用于分析高分子、热不稳定及强极性化合物如肽、糖、维生素、甙等。 a. EI离子化 b. CI离子化 d. FD离子化 二、有机质谱中的各种离子 1、分子离子(molicular ion) 分子离子是由样品分子电离而产生的，标为 。 2、准分子离子(quasi-molicular ion) 、 称为准分子离子。 3、碎片离子(fragment ion) 广义的碎片离子包含由分子离子碎裂而产生的一切离子。狭义的碎片离子指由简单断裂产生的离子。 4、重排离子(rearrangement ion) 它是经重排反应产生的离子，其结构并非原来分子的结构单元。 5、亚稳离子(metastable ion) 亚稳离子是介于稳定离子与不稳定离子之间的一种离子，是从离子源出口到检测器之间产生的离子。 1(简单开裂 , 2(麦氏重排 , 3(逆狄尔斯-阿耳德开裂(retro Diels Alder fragmentation, RDA) ,4(醇类脱水重排 ,5(其它开裂 ,在鉴定有机化合物时，可与标准图对照，进行检索，核定该化合物是否为己知物，如为未知物，可按下列程序进行解析。 1)确定分子离子峰，并注意分子离子峰对基峰的相对强度比，以判断分子离子的稳定性。 2)确定分子式，即利用同位素峰的丰度比确定有否含硫、氯、溴等元素及确定分子式。 3)高分辨质谱测定分子式。计算出未知物的不饱和度。 4)可根据分子离子丢失的碎片大小或由碎片离子的质荷比以及裂解特征推定出可能的分子结构。 ,从分子离子峰的强度，整个谱图碎片离子的多少、低质量端的碎片离子系列可对未知物的结构类型作出一定的推断。如芳香族化合物分子离子峰较强、碎片峰较少，低质量端有相应的碎片(m/z 39,51,65,77) 气质联用技术(GC/MS) ,色谱法及新近发展起来的高效毛细管电泳法(HPCE)，对于混合物分离是非常有效的手段，但由于(通常所有)检测器的限制，它们对于分离出来的化合物却很难进行明确鉴定。气质联用法却可以给出纯化合物的分子结构信息。将这两种方法结合使用，不仅能充分发挥其各自的优点，而且可以弥补相互的不足。 ,在GC/MS联用仪中，一般用质谱的总离子流(TIC)作为色谱的检测信号。总离子流检测信号与质谱同步，便于质谱测定，而且它能检测任何有机化合物分子。 ,GC/MS分析方法是根据总离子流色谱图，在各色谱峰的峰顶或峰的上半部，用快速扫描记录它们的质谱图。再通过计算机检索或人工检索确定化合物结构。并根据峰面积来计算各分子在总成分中所占百分数。 高效液相质谱联用技术(LC/MS) ,在生物及药学研究领域，通常所分析的样品绝大多数极性较大，热稳定性差且不能气化，故不适于用气相色谱来分析，只能用液相色谱来分离这些样品。因此，HPLC-MS技术一出现，就引起大家的重视。 ,质谱与高压液相色联用，要比GC-MS联用困难得多。 ,质谱:高真空、高温、低流速及气态 ,HPLC:高压、高流速、低温及液态 ,一种热喷雾技术(Thermospray Ionization,TSI)使HPLC-MS成为可能。 ,电喷雾电离为软电离方式，可在大气压下直接从样品溶液中生成离子，而且能很好地与高效液相色谱条件匹配，故它非常适合与HPLC直接联用。 ,HPLC-TSI-MS限于分子量200-1000的化合物，而且较强的加热蒸发会使热稳定性差的化合物分解。 第二章 紫外光谱法( UV) (Ultraviolet-visible Absorption Spectra) ,分子吸收紫外-可见光区200-800nm(纳米)的电磁波而产生的吸收光谱称紫外可见吸收光谱简称紫外光谱。 ,紫外光谱图是吸收的波长或频率对吸收强度(吸光度A或摩尔吸收系数ε)作图所得吸收曲线。 ,可以观察到吸收在短波段非常强，而吸收带在长波段吸收很弱。 一(基本原理 ,当可见光或紫外线照射在分子上时，电子就从基态向能量升高的激发态跃迁。此时，吸收相当于激发能波长的光。其吸收频率决定于分子的能级差，计算式为 ,电子跃迁具有σ-σ*，n-σ*,π-π*,n-π*等形式。然而，一般所用分光光度计由于波长在200纳米(nm)以上的区域内，故只能观察到跃迁能量小的π,π*和n,π*的吸收带，吸收光谱将出现在紫外区域(200,400nm)。 ,共轭体系越长，其最大吸收移往长波方向，甚至到可见光部分。 ,实际上紫外光谱法的应用主要限于共轭体系，但不能表达整个分子结构情况。 ,相同的化合物应有相同的紫外光谱图。相同的紫外光谱图并不一定相同的化合物。 ,因此，对于分子中含有共轭双键、α，β,不饱和羰基(醛、酮、酸、酯)的结构的化合物以及芳香化合物的结构鉴定来说紫外是一种较重要的手段。常常用于推断化合物的骨架类型; ,生色团(chromophore):产生紫外(可见光)吸收的不饱和共轭体系。 ,助色团(auxochrome):一个饱和基团，当与生色团相连时，改变其最大吸收的波长及强度(变长或变强)，如-OH、-NH等。 2 ,浅色位移(hypsochromic shift):以上相反，亦称蓝位移(blue shift)。 ,增色效应(hyperchromic effect):使吸收强度增加的效应 ,减色效应(hypochromic effect):与上相反 三. 吸收带 ,电子跃迁对应于确定的电子能级变化，因而产生原紫外吸收光谱似乎应呈现一些很窄的吸收谱线，为什么实际观测到的却常是一些很宽的吸收带呢, ,其原因是因为分子在发生电子能级的跃迁过程中常伴有振动和转动能级的跃迁。转动能级间隔小于振动能级，在紫外光谱上区分不出其光谱的精细结构，吸收带的峰形主要由振动能级变化所产生。 ,当研究一个结构复杂的化合物时，由于仅是其中共轭体系或羰基等有紫外吸收，因此，可选择结构上大为简化的模型化合物来估计该化合物的紫外吸收。 共轭双烯吸收的计算值 ,链状二烯基准值 217(nm) ,烷基取代 (，5)×2 ,计算值 227 ,实测值 226 ,同环二烯基准值 253(nm) ,延伸一个双轭双键 ，30 ,环外双键 ，5 ,烷基及环的取代 (，5)×3 ,计算值 303 ,实测值 304 ,异环二烯基准值 214(nm) ,环外双键 ，5 ,烷基及环的取代 (，5)×4 ,计算值 239 ,实测值 238 共轭醛、酮吸收的计算值 ,六员环αβ,不饱和酮基准值 215(nm) ,延伸一个共轭双键 ，30 ,烷基或环的取代 α位 ，12 β位 ，18 ,计算值 280 ,实测值 284 1. 隔离效应与加和规律 ,设A为生色团，B为生色团或助色团。当A与B相连生成A-B时，若B为生色团，二者形成更大共轭体系;若B为助色团，助色团的孤电子对与A形成共轭，相比于A，A-B出现新的吸收(一般均为强化了的吸收)。 ,设C为不含杂原子的饱和基团，在A-C-B结构中，C阻止了A与B之间的共轭作用，亦即C具有隔离效应。从另一方面来看，A-C-B的紫外吸收就是A、B紫外吸收之加和。这称为“加合规律”。 ,紫外谱图提供的主要信息是有关该化合物的共轭体系或某些羰基等的存在的信息。现作以下归纳: 1(化合物在200,800nm内无紫外吸收，说明该化合物是脂肪烃、脂环烃或它的简单衍生物(氯化物、醇、醚、羧酸等)、甚至可能是非共轭烯。 2(220,250nm内显示强的吸收(近10000或更大)，这表明共轭体系吸收带的存在，即存在共轭的两个不饱和键(共轭二烯或α，β,不饱和醛、酮)。 5(300nm以上的高强度吸收，说明该化合物具有较大的共轭体系。若主强度吸收具有明显的精细结构，说明稠环芳烃、稠环杂芳烃或其衍生物的存在。 3.解析紫外谱图的方法 1、解析谱图方法 吸收带的位置、强度和形状三个方面; ,吸收带位置:可估计产生该吸收的共轭体系的大小; ,吸收强度:有助于K带、B带和R带的识别; ,形状:可帮助判断产生紫外吸收的基团。 ,Sadlter紫外光谱手册(Sadlter Hanadbook of Ultraviolet Spectra, Heyden, London)。 六、紫外光谱用于结构推断应用举例 ,从一中药中分离得到的一萜类化合物甲，可能为A和B二种异构体之一，试用紫外光谱进行确证。 经测定其紫外吸收光谱，有三个吸收峰，分别为211nm(4.1)、240nm(3.5)、和314nm(2.7)。 ,例1. 一般情况下顺式异构体的λmax比反式异构体的λmax要短，且ε亦较小。 λmax 288nm, 224nm λmax 295.5nm 228nm ε 10500 24000 ε 29000 16500 ,针对香豆素、黄酮类和蒽醌类等化合物，可采用加入某种诊断试剂来了解分子结构中取代基的类型、数目及排列方式，借此来推断化合物的精细结构。 ,用紫外吸收光谱对物质鉴定时，主要根据光谱上的一些特征吸收，包括最大吸收波长、肩峰、吸收系数、吸收度比等。 ,两个化合物若相同，其吸收光谱应完全一致。在鉴定时，试样和标准品以相同溶配制成相同浓度，分别测定吸收光谱，比较光谱图是否一致，如果没有标准品，也可以和现成的标准光谱图相比较。 第三章 红外光谱(IR) ,红外光谱法广泛应用基于如下 优点: ,任何气态、液态、固态样品均可进行红外光谱测定。这是NMR、UV和MS所不及的。 ,每种化合物均有红外吸收，结构信息丰富。 ,样品用量少。 ,常规红外光谱仪价格低廉，易于购置。 ,当一束红外光照射物质时，被照射物质的分子将吸收一部分相应的光能，转变为分子的振动和转动能量，使分子固有的振动和转动跃迁到较高的能级，光谱上即出现吸收谱带，称红外吸 -1收光谱。通常以波数(cm)为横座标，吸收度(A)或百分透过率为纵座标作图得吸收曲线。 一( 红外光谱的基本原理 1.波长和波数 电磁波的传播可用下式描述; C= υλ 即 λ=C/υ 10 式中C为电磁波传播的速度，即光速2.997910 cm/s υ为频率，周秒 cps或赫兹Hz; λ以厘米为单位，叫做波数，它表示电磁波在单位距离中振动的次数。 -14也可 υ(cm)=1/λ(μm)×10 2(分子振动与红外吸收频率: , 由原子质量和组成的双原子分子，其振动频率可由方程表示; 其中C为光速，f为力常数 ,由上式可以看出;吸收带的位置决定于键强以及键相连结的原子质量。如果键比较强，原子质量比较小，则其键的振动频率较高，即键振动时所需的能量较高。 ,如果与键相连结的原子质量相同，则键强愈高吸收频率也愈高，在类似情况下，如果与键相-1连结的是重原子，则吸收频率降低，如，O,H键的伸缩振动在3600cm，而O,D键则降至-12630cm，此时键强相同，所不同的仅为原子质量增加，同样，弯曲振动频率的差别，其解释也是如此。 3.基团振动 基团振动可分为伸缩振动与变角振动二种，并可进一步划分，现以次甲基(-CH-)振动2为例: 非对称 对称 剪式 非平面 扭曲式 平面 伸缩振动 伸缩振动 摇摆式 摇摆式 摇摆式 摇摆式 (符号 +，-，表示垂直于纸平面的振动方向) ,官能团具有特征吸收频率 对官能团的识别需同时顾及吸收峰的位置(频率)、强度及峰形，但频率是第一个重要因素，因此应对有关影响吸收频率的因素进行讨论。 以羰基为例。 1(电子效应 ?(诱导效应(Inductive Effect, I ) -1,脂肪酮羰基的正常吸收频率为1715cm，卤原子取代一则烷基则使吸收频率上升，这是因为卤素原子吸引电子使羰基的双键性增加 -1,中介效应即共振效应。最典型的例子是酰胺的羰基吸收。该羰基吸收频率为1690cm，低于 -1一般羰基吸收频率1715cm。这是因为存在中介效应。降低了羰基的双键性，因而吸收频率移向低波数。 ,羰基与别的双键共轭，其电子的离域增大，从而减小了双键的键级，使其双键性降低，亦即振动频率降低。 ,跨环效应是一种特殊的，通过空间发生的电子效应。 1(环的张力 ,一般而言，环的张力加大时，环上有关官能团的吸收频率逐渐上升。 ,张力与频率成正比。然而环烯烃中的双键吸收频率则与之相反: ,共轭体系具有共平面的性质，当共轭体系的共平面性被偏离或被破坏时，共轭体系亦受到影响或破坏，吸收频率移向高波数方向(与形成共轭体系时吸收频率移向较低波数方向相反)。 ,无论是分子间氢键的形成还是分子内氢键的形成，都使参与形成氢键的原化学键的键力常数降低，吸收频率移向低波数方向;但与之同时，振动时偶极矩的变化加大，因而吸收强度增加。 分子内氢键(与浓度无关) 1. ,例如羟基与羰基形成分子内氢键时，及都向低频区移动。 -1-1 (缔合)1622cm(游离) 1676cm -1-1 (游离) 1675cm1673cm -1-1 (缔合) 2843cm (游离) 3615-3605cm 2.分子间氢键(与浓度有关) ,以醇的羟基为例: ,游离态 二聚体 多聚体 -1,羧酸分子能形成强烈的氢键，使其羟基的吸收频率移至2500,3000cm，形成一个宽谱带，这是羧酸红外谱图的明显特征。 ,一般样品均采用固相作图(溴化钾压片，石蜡油调糊)重复性较好，用于鉴定最可靠。样品晶粒大小，结晶方法等有时对谱图有些影响。 ,因此，当把未知物红外谱图与己知样品或标准谱图对比时，应注意作图条件，最好能以同样条件下作的图进行对比。 样品的准备 ,大约1mg的固体用液体石蜡(Kaydol)磨细，然后这个糊被压在两片氯化钠平板之间。 ,另一种方法是固体与10,100倍的纯溴化钾(KBr磨成混合物，然后用一个特殊的塑型和液压机压成片(注意水峰) 1(红外吸收波数 ,红外谱图波数可分为以下六个区，结合最常见的基团讨论如下: -1?(4000,2500cm ,这是X,H(X包括C、N、O、S等)伸缩振动区。 ?(羟基(醇和酚的羟基): ,游离羟基吸收在较高波数，峰形尖锐; ,缔合羟基吸收在较低波数，峰形宽而钝; -1,KBr晶体含有微量水时，会在3300cm附近出现吸收峰。与羟基区别察看指纹区内是否有羟 基的吸收峰，或进行石蜡油调糊作图。 ?(胺基: ,胺基的红外吸收与羟基相类似。 -1-1,游离胺基在3300,3500cm范围，缔合者降低100cm。 ,伯胺有两个吸收峰，易于与羟基相区别。 ,仲胺只有一个吸收峰，且尖锐。 ,叔胺在此区域无吸收。 ?(烃基: -1,C,H键振动的分界线是3000cm。 -1,不饱和碳,氢伸缩振动频率,3000cm -1,饱和碳,氢伸缩振动频率,3000cm。 -1-1,醛类化合物在~2820cm及时720cm处有两个吸收峰，这是由和倍频率间的费米共振所致。 -1?(2500,2000cm ,是叁键和累积双键等的伸缩振动区。 -1?(2000,1500cm是双键的伸缩振动区，这是红外谱图中最重要的区域。 -1,νC=O 1650,1900cm，峰尖或稍宽，强度大，一般为图中最强峰或次强峰。 -1,νC=C 1600,1670cm, 强度中等或较低 -1,νC6H6 1450，1500，1580，1600cm, 杂芳环和苯环相似吸收。 -1?(1500,1300cm ,该区域主要提供了C,H弯曲振动的信息。 -1, νCH3 ~1380,~1460cm同时有吸收。前一峰分叉示有偕二甲基的存在。 -1,νCH2 ~1470cm -1?(1300,910cm ,所有单键的伸缩振动频率，分子骨架振动频率都在这个区域，信息十分丰富。 -1?(910cm以下 -1,苯环因取代而产生的吸收(900,650cm)是这个区域很重要的内容。是判断苯环取代位置的主要依据(吸收源于苯环C,H的弯曲振动)。 -1,烯的碳,氢弯曲振动频率处于本区及前一区(1300,900cm) ,(红外谱解析要点及注意事项 ?(红外吸收谱的三要素[位置(波数)、强度、峰形] ,在解析红外谱时，吸收峰的位置(波数)无疑是最重要的特点，然而，在确定化合物分子结构时，必须将吸收峰的位置辅以吸收峰强度和峰形来综合分析。 ?(同一基团的几种振动的吸收峰是同时存在的 ,对任意一个官能团来说，由于存在伸缩振动(某些官能团同时存在对称和反对称伸缩振动)和多种弯曲振动，因此任何一种官能团会在红外图的不同区域显示出几个吸收峰。 ,所以，只有当几处应该出现吸收峰的地方都显示吸收峰时，方能得出官能团存在的结论。如; ,-1 -CH:2960，2870，1460，1380cm3 -1, :1710,1050~1300cm (C-O-C) ?先特征，后指纹; ?先最强，后次强; ?先粗查，后细找 ?先否定，后肯定; ?一抓一组相关峰 4.标准红外谱图的应用 ,萨特勒(sadtler)红外谱图集 ,谱图收集丰富 该谱图中己收集有七万多张红外谱 ,备有多种索引，检索方便 化合物名称字顺索引、化合物分类索引、分子式索引、分子量索引、波长索引等。