[doc] 活卡介苗对家兔肺沧巨噬细胞溶酶体杀伤和消化酵母...

[doc] 活卡介苗对家兔肺沧巨噬细胞溶酶体杀伤和消化酵母... 活卡介苗对家兔肺沧巨噬细胞溶酶体杀伤 和消化酵母... 第22卷第1期 1991年1月 解剖 ACTAANATOMICASINICA V01.22.No.r Jan】991 活卡介苗对家兔肺泡巨噬细胞 溶酶体杀伤和消化酵母菌 的实验研究 赵强遇铭 (华北煤炭医学院组织学睫胎学教研室,唐山063000) 墒要本实验用吖啶橙标记藩酶体,用荧光显微镜观察肺泡巨噬细胞吞噬活酵母菌的细胞内 杀伤和消化过程根据细胞的形态学改变,将此过程分为融合前期融合与杀伤期和捎化期结 果明,活卡介苗活化家兔离体肺泡巨噬细胞的吞噬率,吞噬指数融合率和融合指数,均鞍对 照组提高(P<O.01),本研究从形态学角度证实,活化细胞溶酶体的 细胞内杀伤和消化作用有提 高. 关键词肺泡巨噬细胞吞噬作用吖啶橙卡介苗荧光显搬镜 吞噬体一溶酶体融合(phagosome--lysosomefusion)是溶酶体参与细胞内杀伤和消化 过程的重要环节.有关单核吞噬细胞系统(MNP)的形态学研究,多局限于吞噬率,吞噬 指数的测定,以及溶酶体酶化学的光镜和电镜显示等】,而基础和临床医学的研究证明, 吞噬率,吞噬指数与细胞内杀伤,消化能力并非均呈平行关系l.因此,研究卡介苗(BCO) 活化和未活化肺抱巨噬细胞(alveolarmaerophage)吞噬体一溶酶体融合的融合率和融合指 数,会使单核吞噬细胞系统杀伤和消化功能的细胞形态学研究引向深入,同时也为单核吞噬 细胞系统活他剂的临床应用提供一些理论依据. 材料和方法 (一)实验材料:1.用纯系新西兰家兔2O只,雌雄各半,体重1.5,2.5kg,随机分为 空白对照和BCG实验组,每组1O只2?BCG系北京生物制品研究所生产(批号8710— 2),活菌单位276万/ml.3.用PBS(pH7.2)配制活酵母菌悬渡,离心洗涤 3次,使用时 配制.4.吖啶橙(acridineorange)染色贮备液用PBS配制,浓度100[~g/ml,4~C避光保 存,使用前稀释1O倍作为工作液. (二)BCG实验组模型制备;经动物耳缘静脉注射活BCG两次,剂量依次是0.5mg, 15mg,间隔2周在末次注射2周时处死动物.一 (三)肺抱巨噬细胞获取与爬片制备t用PBS行原位支气管一肺灌洗,以台盼蓝染色检查 经灌洗所得细胞存活率,并用无血清的RPM]一1640培养液调整细胞浓度为2,6x10s个/ml. 将上述细胞悬液分装于无蘸有盖片的青霉素小瓶中(3ml/瓶),置37~C恒温培养箱中培养, 制成单层细胞爬片. (四)吖啶橙标记溶酶体及吞噬体一溶酶体融合观察:在细胞培养1小肘后,以吖啶橙 工作液用稍加改良的Hart和Kielian例法,标记肺泡巨噬细胞溶酶体30分钟(37.C),再 一,…一一lI 1期赵强等活卡介苗对家兔肺抱巨噬细胞溶酶体杀伤和消化酵母菌的实验研究 以PBS替换吖啶攫液继续培养10分钟.按肺泡巨噬细胞数:活酵母菌数=1:10的比例加人 括酵母菌液后,继续培养,分别在培养1,2和3小时,取出爬片,PBS冲洗,封片.甩 OlympusBHz荧光显微镜观察,激发和阻断滤片分别是BG.和O?,拍摄荧光照片.在照 片上计数以下各值.1.吞噬率:吞噬酵母菌的肺泡巨噬细胞数占肺泡巨噬细胞总数的百分 比;2-融合率:含有非绿色酵母菌的肺泡巨噬细胞数占全部计数肺泡巨噬细胞数的百分比 3.吞噬指数:平均每个肺泡巨噬细胞吞噬酵母菌的个数;4.融合指数:平均每个肺泡巨噬 细胞含有非绿色酵母菌的个数.对实验结果进行统计学分析. 结果 吖啶橙标记后,肺泡巨噬细胞溶酶体和核分别发橙红和淡绿色荧光(图1).连续观察发 现,刚被摄人胞体的活酵母菌发绿色荧光,逐渐在其周围有发橙红色荧光的溶酶体聚集(图 2),继而在酵母菌周围形成一个亮的荧光环(图1),随后吞噬体所发荧光由绿色经淡黄色, 粉红色变为橙红色(图2),最终荧光完垒消褪,呈现与酵母菌颗粒大小类似的无荧光结构 f图3).在荧光显微镜下观察,活化肺泡巨噬细胞体积较对照组增大.经荧光照片铡试, BCG组肺泡巨噬细胞的吞噬率,吞噬指数,融合率和融合指数均较对照组的相应值增高(P <0.01).在计时2,3小时,对照组的上述值无明显改变,且吞噬率和融合率,吞噬指数与 融合指数差别均较大;而BCG组的吞噬率和吞噬指数升高不明显,但融合率和融合指数有较 明显的升高,几乎分别接近吞噬率和融合率(图4,5). 图1吞噬活酵母苗的肺泡巨噬细胞.宁.示发红色荧光的溶酶俸颗粒,t.示炭淡绿色荧光的肺泡巨 啦细胞棱,?.示酵母菌周边部出琨荧光环吖啶橙婆色×330(下同) 图2吞啦活酵母菌的肺袍巨噬细胞.千.录炭绿色荧光的酵母菌吞噬体-t示发红色荧光的酵母菌 吞噬俸,t.录卫星溶酶俸” 图3t示酵母菌吞啦体荧光消褪,呈现为与酵母苗颗粒大小相似的无荧光结构 讨论 溶酶体是吞噬细胞实观细胞内杀伤和消化功能的重要结构之一,可借助于静电同碱性物 一,一…一…—一 解剖22卷 酉4BCG话化巨啦细胞与正常巨噬细 胞吞噬串与融台率的比较 (=100,<0.01) 口.Bc0活化巨噬细胞 .正常吞噬细胞 —— . 吞噬宰…一.融台率 图5BC~3话化巨噬细胞与正常巨噬细胞 吞噬指数与融合指数的比较 (–1oo.<0.01) 口.BC~3活化巨噬细胞 .正常吞噬细胞 —— .吞噬指数一一.融合指数 Y,c.酵母菌数/巨噬细胞数 霸结合.吖啶橙是人工合成的碱性荧光染料,可在溶酶体内形成多聚 体,吖啶橙也可同棱 内DNA形成疏松的单价化合物;在紫外线照射下,溶酶体和核分gq 发橙红色和淡绿色荧 光. 通常情况下,只有吞噬体一溶酶体融合时,溶酶体的细胞内杀伤和消化过程才能进行】 通过在荧光显微镜下的活体细胞连续观察,我们认为,在吞噬体外周出现荧光环表明吞噬体 一 溶酶俸融合过程即将开始.随后,吞噬体荧光色泽的改变,反映了溶酶体酶注入及消化酵 母菌吞噬体的垒部形态学过程.其中,橙红色荧光的出现,标虑融合过程达到高峰,有人把它 看成是细菌披杀死的标志”,Harris把它作为计数融合率的依据.根据本次实验结果,可 以从形态学角度把吖啶橙标记溶酶体显示细胞内杀伤和消化过程,大致分为以下3期,即1. 融合前期;发绿色荧光的酵母菌吞噬体逐渐被溶酶体环绕,即”卫星溶酶体出现2.融合与 杀伤期:在酵母菌吞噬俸周边出现亮环,吞噬体本身由发绿色荧光渐变成红色荧光;3.消化 期:酵母菌吞噬体荧光消褪,呈现大小与酵母菌颗粒类似的无荧光结构.由此可见,吞噬体 形成和吞噬体一溶酶体融合是细胞内消化的两个既连续又不周的阶段,具有不周的生物学意 义. 卡介苗是较理想的单核吞噬细胞系统非特异性澈活剂”.分析实验组和对照组的吞噬 率吞噬捂数,融合率和融合指数可知,实验组肺泡巨噬细胞的细胞内消化和杀伤过程进展 较快,同时证明细胞吞噬率与吞噬指数同细胞内溶酶体的杀伤,消化力并非均呈平行关系, 话化肺泡巨噬细胞在单位时间内杀伤和消化酵母菌的数量增多,许多临床和基础研究也有类 似佐证】.故吞噬体一溶酶体融合速度的检测,是形态学铡定吞噬细胞细胞内杀伤和消化功 能的更完善的方法.Kielian[I.的实验证明,细胞内溶酶体数目或体积的改变不影响吞噬体 一 溶酶体融合速度,而溶酶体膜稳定性下降可能是引起吞噬体一溶酶体融合速度升高的主要 原因之一.活化细胞的溶酶体骥稳定性下降,酸性磷酸酶——溶酶体的标志酶活性增强, 后者提示可能存在活化细胞溶酶体数目的增多或体积的增大,但前者可能是活化细胞吞噬体 一 溶酶体融合速度升高的主要原因. 1989年H月收藕l99O年5月修回 疆 1期赵强等.活卡介苗对家兔肺泡巨噬细胞溶酶体杀伤和消化酵母菌 的实验研究107 参考文献 [L]$te[nmanRM,ctalEt]docytosisandtherecyclingofplasm2membrae1Cel1Bioll983:96.1. [2]郭晓芳.肺袍巨噬细胞体外培养厦其在环境医学方面的应用医学 研究通讯l986{l5:133. [S]ThompsonB,Myrvik0NCharacter[zatienandmalurationofalveolarmaerophageprocuredfro?1 BCo-indueedpulmonarygranulornas.ExpLungResl985;9:237. []Ha? 【s10Gonzalez-RothiRT.Abnerrealphagolysosomefusioninpul~ot]aTYalveolar?1acTophageof ratexposedehrot]icallytocigaretsmokeAmRevRespiTDis1984t130:467. [5]DAreyHP,Yout]gMRlnterferencewith? omalphagosomelyso$omefusioninmacrophage.using jn6estedcellsandsuramineNature1975{256:47. [6]KielianMC,CohnZAPhages0mlysosomefusionJCellBio]198O{85:754. [7]AllisoilAC.YoungMRUptakedyesanddrugsbylivingcellsjucuItureLife Science1964;3:1407. [B]KielingH.VitalstainingoflysosomebyacridineorangeJCellBiol1963t19:870. [0]AnnaOS,CohnZATheaiveolarmacrophageJApplPhysiol1986t6O:353. [10-PantazlsCG,Knik盯 wTAssessmentofbloodIeukocyte:microbtealkillingbyusingauewfluoro- chromemicroaSSay.1RetieuloendotheI$oc1070}26:155. [113Ede]Sot]RJBiochemicalandfunctionalcharaeterist]csoftheplasmamembraneofmacrophagefrom 丑Co-inducedmiee1Ilitmunol1978’120:1532. [12]KielianMC,CohnZAMononuclearPhagocytesPartIILondon:MartinusNijhoff.1980:1077-1094. [13]Ml】 erK,etalTheinvivoeffectsofasbestosDnmacrophagetilembratieAscanningelectronmicro一 $copestudyJReticuIoeudothelSoe1079{20:l29. ANEXPERIMENTALSTUDY0FLIVING. BCGSEFFECT0NTHEKILLINGAND DIGESTIVEABILITIESOFRABBIT ALVE0LARMACR0PHAGE LYS0S0MET0LIVING—YEAST ZhaoOiang,YuMillg Deparlraenl.,Iti~lologyandEmbryology,NorthChinaCoalMinin~zMediea College,Tangshan.Hebe) Bymeansoftheobservationofacridineorange—stainedlysosomeswithfluo res— ceneemicroscope.westudiedtheintracellularkillinganddigestiveprocessafter alveolarmacrophage(AM)ingestedliving—yeast.Based0nthemorphologi calchanges ofthecells,wedividedtheprocessintothreestages:thepre-phagosome—lyso some fusio11stage,thephagosome—lysosomefusionandkillingstage,andthedig estive stage.Theresultsrevealedthatallthevaluesofphagocyticindex,phagocyticrate. fusionindexandfusionrateoftheisolatedAMofrabbitsinfeetedwith1ivi11E— BCGwerehighertha11thoseofnormalrabbits(P<0.01),whichshowedtheinfected AMhadahigherintracellularkillinganddigestiveabilitiesoflysosome. KEYWORDSAlseolarmacrophage;Endocytosis;Acridineorange;BCG; FluOr0scencemicroscope ll