【doc】维拉帕米增强猴肾上皮细胞低密度脂蛋白受体活性

【doc】维拉帕米增强猴肾上皮细胞低密度脂蛋白受体活性 维拉帕米增强猴肾上皮细胞低密度脂蛋白 受体活性 一t B1B]I『):IS.SN02539756ActaPhatmaco[ogieaSinica中国蒋理 维拉帕米增强猴肾上皮细胞低密度脂蛋白受体活性 刘乃丰(南京铁道医学院心血管病研究室,南京210009,中国) ——, A? Enhanceme?to?expr~ionofLDLreceptorsinKEYWORDSverapamil;LDLlipoproteins culturedrhesusrenalepithelialcellsbyverapamilLDLreceptors;culturedcells;iodineradio isotopes;radioligandassay LIUNai—Feng(CardiovascularDivision,Nawing RaitvoayMedicalCollege,Nanfing210009tChina) ABSTRACTInordertoinvestigatetheanti— atherogenicpropertiesofcalciumantagonists, humanserum1owdensity1ipoproteins(LDL) wereisolatedbydensitygradientuhraeen— trifugationandiodinatedwith1byiodine monochloridemethod.Effectsofverapami1 onactivityofLDLreceptorsinculturedrhesus rena1epithelia1cellswereexaminedbyradio— ligandanalysis.Thereceptor—mediatedbind ing.internalization,anddegradationofcul turedcellspretreatedwithverapami144mmo1 ? L一for24handcellspretreatedfor24h andincubatedfor10hwithverapamilwere increasedcomparedwithcontro1group(61士 ll,52?82O土3.5,1006?106.579-Z-_124 s253士78.630土43,541?46vs374?53 ..jl-LDL/vg?gcellprotein.Inverapamil— treatedcellswithoutverapamilpretreatment, increasedinternalizationanddegradationwere notsignificant,andbindingwasnotin— creased.Whenthecellswerepretreatedwith verapamiI22mmoI?L—for24handthenin— cubatedwith5+20,50.l-LDL/mg?L. bindingandinternalizationwereincreased. increaseddegradationwasseenonlywith50 I—LDL/mg?L.Theresultsindicated thattheverapamilenhancesexpressionofLDI receptorinculturedrhesusrenaIepitheliaI cells.whichmightcontributetotheprotective effectsofcalciumantagonistsinexperimenta1 andhumanatheroselerosis. R…d1992—0623Accepted199.t-I1-08 摘要本文用放射配体法观察了维拉帕米 (Ver)对恒河猴肾上皮细胞LDL受体活性的影 响,发现Ver以浓度和时间依赖的方式明显增 强受体介导的结合和内移过程,对降解的影响 不显着.Ver作用浓度为44mmol?L效应最 明显. 关键词维垃生白; 白受体;培养细胞; 低密度脂蛋白;低密度脂蛋 核素碘;放射配基测定 钙蠡骥动物和人的早期动脉钙拈扰剂延缓及阻止动物和人的早期动脉 粥样硬化发展,主要与保护内皮完整性,抑制 动脉平滑肌细胞增殖及动脉壁基质合成,减少 细胞钙离子过度负荷及改善细胞脂质代谢有 关"..Ver可明显减少饲胆固醇家免胸主动 脉中胆固醇含量,但对血脂水平无明显影响', 这可能涉及到细胞水平低密度脂蛋白(LDL)受 体途径代谢的变化.尤其是LDL受体介导的 入咆及从动脉壁间质清除胆固醇酯的过程增 强.以放射配体法探讨Ver对恒河猴肾上皮 细胞(MA细胞)LDL受体活性的影响,尚未 见报道.本文旨在阐明钙拈抗剂抗动脉粥样 硬化的机制. MATERIALSANDMETHODS 2多 人血清脂蛋白的分离和纯度鉴定",取空愎12h 的正常人混合血清.用固体KBr调密度.形成单个不 连续的密度梯度.用RPV一50T型垂直转头,日立 SCP一85H型超建离心机,10C.206800×g.离心150 min.分部收集各层脂蛋白并经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴 定纯度,证实为单一区带,无脂蛋白间的混杂.再经 BIBI,ID:LSSN0253—9756ActaPharnmcoLog[casln8中国药理t994MarI】5(2) 透析,浓缩,涮脂蛋白含量及除菌过滤后4c保存备用. 细胞培养恒河冁胚肾上皮细胞(rhesusrenM epithelialcells)由本校微生物学教研室惠赠.实验用40 — 50代.常规单层培养于含10小牛血清的Eagle MEM培养液中. LDL接素标记和鉴定用IC1法将LDI标记 成;l—LDL,透析和凝瞳过巷柱屠析法纯化标记物,放 射性活度z.55—6.66GBq/gLDL,游离碘含量0.43— 1.9%.脂质标记率{1,受体结合试验绦留生 物活性. LDL受体着性刹定接Goldstein的I舶L受体活 性测定法进行.每次实验均取细胞代次及生长状态 相同的细胞随机分组,每培养瓶含MA细胞约5×1 个,接近忙合时开始实验,实验组加Vet(上海天丰药 厂产品,为pH4—6的盐酸无菌水溶液)22—44mmo[ ? L,,对照组加入相同容量的pH4—6无菌生理盐水. 每次实验均取4复管+用平行管加过量非标记LDL的 方法谢算受体特异性结合,摄入和降解值.LDL结果 以g?g细胞蛋白示,F检验显着性,Q检验进行 各组均数间的相互比鞍. RESULTS 猴肾上皮细胞LDL放射受体细胞 与浓度递增的放射性配体共同培育进行饱和试 验,可测得细胞LDL受体特异性结合LDL的 浓度效应曲线,呈可饱和性指数曲线图形.用 Wool{法和最小二乘法直线回归处理受体特异 性结合数据可得一直线方程.一0.4161+ 0.o234X.由此可测算出该受体37C时最大 高亲和性结合(B,)LDL为43~tgtg细咆蛋 白,表观亲合常数()为17.8mg?L,. Ver影响LDL受体活性浓度在11—44 mmol?L的浓度范围内.Vet的作用随浓度增 加而增加,呈浓度依赖性,浓度为44mmo1 .L时作用显着,此后浓度增加作用反而减弱 (Fig1). Ver温育不同时间对LDL受体活性影响 Ver44mmol?L预温育细胞24h能显着增 加受体特异性结合,内移和降解值(P<0.05), ll站"BB176 Vm~d/mmol-L_' Fig1.Effectofverapamilonassociationof I-LDLbyMAcells 但预温育细胞24h后再以相同浓度Ver继续温 育10h,结合,内移和降解值不仅无继续增加, 反比仅预温育组有所减少,但仍明显高于对照 组(P<0.05).仅用Vet温育10h而无预温育, 对结合过程几乎无影响,内移和降解过程与对 照组相比无显着增加(P>o.05+Tab1). Tab1.EffectofVeroDbinding,internalizattou,and dregradationof'"I-LDLbyrhesusrenalepithelial cellspretremtedwithVer44mmol?L一for24hand/ orincubatedwithVerl"mmol'L一for10h? >0.05,<0.05drug—freegrotJp Pretreated]ncubated withVetwithVerBinding for24,hforlOh Ver对不同放射配体浓度LDL受体活性 的影响先与Vet22rnmol?L温育24h后, 分别用5,2O和50mg"I-LDL?L三种放射 配体浓度测定LDL受体活性,结合和内移值 明显增加,对降解过程影响不显着(Fig2). 44萑I【0I, .口00.?d? 囊 Bl~:m.ISSN0253—9756ActaPharmacologicaSinica中国药理1994Mar:15(2)'185 ml-LDL/mg?L-' Fig2一Effectofverapmmtl(?)onI-LDLbinding internaLization,anddegradaUonorI-LDLMA cellspretrKtedwithVer22mmI?L一andthenlncu— I~med'hI-LDL.P>0-05,.P<0.05, P<0.O1vscontrolgrmlp(0). DISCUSS10N Ver可明显减慢动脉粥样硬化的进展速度 和减少新动脉粥样硬化病灶的出现,较多病例 出现病变的消退".其作用机制包括许多方 面,增强LDL受体活性是钙拮抗剂抗动脉 粥样硬化作用机制之一.Ver增强LDL受体 介导的LDL入胞作用,缩短LDI在细胞外间 质停留的时间,减少LDL被修饰为致动脉粥 样硬化作用较强的修饰脂蛋白的机会.另一 方面有助于将细胞外胆固醇酯转移至细胞内降 懈,增强其清除过程". Ver增强LDL受体活性的机制尚未最后 阐明.不同钙拈抗剂的作用也不相同,钙拈 抗剂共有的阻断电压依赖性钙通道作用在此不 起作用.Vet增强LDL受体活性主要是受体 数目增加,而不是亲台力增加.Ver50一100 mmol?L可使[s]甲硫氨酸参入人皮肤成纤 维细胞LDL受体蛋白的量增加2.5倍,但不影 响整个细胞蛋白的合成及LDL受体的半寿 期,.进一步研究表明,Ver可增加lDL受 体mRNA的含量从而增加受体蛋白合成及受 体的数目..从LDL受体mRNA的增加直 至受体数目增加并表达生物活性需要一定的时 48h,效应才较 间过程,一般Ver需作用24— 明显,而预处理24h后,既使不用Ver继续处 理,仍有很明显的上调LDL受体活性的作 用",这可解释本文Vet预处理和未经预处 理组作用的明显差别,至于Ver何以增加 LDL受体mRNA的表达有待探讨. REFERENCES 1WeinsteinDB,HeiderJG.Amiatherc~enkpropertiesof calciumamagonists- AmJCardioIl987;59:l63B一7ZB. 2SchmitzG.HankowitzJK~vac*EM.CeLLuLarprocess esinatherogenesis:potentm[targetsofCa?channel blockers.Atherosclerosisl99l;髓:109—32 3~enderS,RavnH.H丑gEaardMtKjeldsenK.Effect ofverapamllop_aceumlationoffreeandesterifiedchok— steFollnthethoractieaort&ofcholesterol—fedrabbits. Atherosctersis】986{61:l5—23. 41AnNF.IsolationbydensitygradientuLtracentrifugadon andradioiodination0fhumanseTumwdensitylipopro 鲁_????杰_?,?? {IlIv_\,.}_ 86?BIB1ID:ISSN0Z53—9756ActaPharmacologicaSinJca中国药理1994Mar:15t2) AmJHyperter~l991;4:5j2S一8S. 8Filipovic1.BuddeckeE.Ca[ciumchanne【blockersstim ulateI_DI,receptorymheslinhumanskinlibrnh[astH BiochemBiophysResCommunI986;136845—50 9EckardtH.I?cLC~lcluma吡at……ethe amountofmRNAforthelowdensity[ipoprotelttreceptor Lnskialibrnblasts.Arterv】9gl;J8168—8. 0Stein0.IeltersdoE.SteinYVerapamilenhances receptormediatedendocytosisoflowdenMtY[ipoprotcins byaorticce儿s1nculture. Ayterinsclerosisl985;5:35—44 易一,86年 BIBIID;ISSN02539756ActaPharmaco[ogicaSinlca中国药理1994Mar;15(2):186—188 美西律对大鼠背根神经节细胞钠电流的抑制作用 ,,张莉北柿神经外科研究?'中国 . 2 Inhibitinnofmexiletintonsodium~11rl~nt indorsalrootganglionneL1POn$ofrats ZHANGXu-Feng.WANGTian—You,ZHANGLi (BeifingNeurosurgicalInstitute,Beifingj00050, China) ABSTRACTUsingwhole—cellconfigurationof patchclamptechniquewefoundthatmexilet— ine(Mex)reversiblyinhibitedthesodiumcur— rentinavoltage—andusedependentmannerin cultureddorsalrootganglion(DRG)neurons. ThethresholdconcentrationofMexwas5 p.mol?L一.Theinhibitoryactionheightened withincreasingconcentrationsofMex.Com— pleteinhibitionwasachievedatl50#mo卜L-J andthe50inhihitinnconcentrationwas31 t~mol?L一-Itissuggestedthattheinhibition 0fMexonsodiumcurrentinneuronsmaybe oneofthemechanismsofitsanti—ischemicand anti—anoxiceffectsontheneuron. KEYWORDSmexiletine;sodiumchannels ReCeived199208—06Accepted199304一】5 ,Thisworkwaslimshedintkl~&watoryofN…'pj tdogy,DepammentBiologicalS~iencesandBiot~-hno&,gy. TsinghuaUniv.*try,Bet~ing100084,China spinalganglia;culturedcells 一摘要应用膜片钳技术,全细胞钳位方式可见 Mex对大鼠背根神经节细胞Na电流有明显 的抑制作用.其临界作用浓度为5~tmol?I一, 50抑制浓度为31p.mol?L.完全抑制浓度 为150ttmol?I.其抑制作用具有电压和频 率依赖性.抑制剂量与小鼠抗脑缺血缺氧作 用量相近.提示Mex抗脑缺血缺氧作用的机 制之一可能是通过对Na电流的抑制. 关键词耋疋律;;盘;培养的 细胞, 美西律(mexiletine,Mex)系1B类抗心律 失常药,并有止痛":和抗惊厥的作用.对小 鼠脑缺血缺氧还有保护作用L33.Mex对心肌及 外周神经作用的共同特点是抑制Na内流,增 加膜稳定性:,但尚未见到对神经细胞作用的 报道.本实验旨在研究Mex对神经细胞Na通 道的作用,了懈其抗脑缺血缺氧作用的机制. MATERIALSANDMETHoDS 药物盐酸美西律.常州第三制药厂.批号 , 一,一一刚_莹_童一,娶一