社会实践活动

化能自养型微生物的分离与提纯 --------铁细菌的分离与提纯 第三组：贾祥娟，马小英，王浩华 设计： （一）什么是化能自养微生物。 根据微生物所需要的能源和碳素营养物质的不同, 人们将微生物分成化能自养型(又称化能无机营养型)、化能异养型(又称化能有机营养型)、光能自养型(又称光无机营养型)和光能异养型(又称光能有机营养型)四个类型。凡是能够利用某些无机物质氧化时所产生的化学能作为能源、利用无机的碳化合物作为碳素营养来合成其自身有机物质的微生物, 统称为化能自养微生物。这类微生物种类比较少, 只限于一些细菌, 而且都是需氧菌。由于它们可以氧化不同的无机物, 因而又可把它们分为氢氧化细菌、硫细菌、铁细菌和硝化细菌(包括氨氧化菌和亚硝酸氧化菌)等。化能自养微生物广泛地存在于土壤与水中, 对自然界的物质转化起着重要的作用。其中尤以硝化细菌和硫细菌与工农业和建筑业等生产实践有较密切的关系。 （二）微生物分离纯化的认识 从微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。 微生物的分离纯化有以下几种方法： ● 简单平板分离法 一般利用三只平皿进行分离，在第三个平皿中获得单菌落，此法具体操作如下： （1） 取三只固体试管培养基加热融化后，冷却至45~50摄氏度，并保温。 （2） 用接种环取一环含菌落样品于第一支试管中，之后将试管置于双手掌中，迅速搓动旋转使之均衡。然后用接种环取该试管中培养液一环于第二支试管，并搓旋均匀。再取一环于第三只试管中，搓旋均匀。 （3） 将三支有菌试管中的培养基分别倒入三个无菌培养皿中，做好标记，摇匀，凝固后，倒置于保温箱中培养。待单个菌落长出，移接于斜面培养基中 ● 稀释倾注分离法 （1） 取盛有无菌水的试管若干支（9ml/支），分别标记1、2、3…用无菌吸管取1ml样品悬浮液（或增值液）注入1号管内，用吸管吹吸三次均匀，记为10^-1。然后从一号管内取1ml于二号管内，通过吸管的吹吸混合均匀，记为10^-2。同样从二号管内取出1ml于三号管内，记为10^-30。以此类推。 （2） 用三支无菌吸管分别吸取后三个稀释度的稀释液各1ml于三个无菌培养皿中，然后加入融化后冷却至45~50摄氏度的固体培养基12~15ml，迅速摇匀，待凝固后，倒置于保温箱中培养，挑选单个菌落移接于斜面培养基上培养。 ● 毛细管分离法 分离能产生孢子的霉菌时，可采用毛细管法，其方法如下： （1） 将玻璃管烧熔拉成毛细管，置无菌搪瓷盘内。 （2） 取样品少许放入融化并冷却至45~50℃的琼脂培养基中，摇匀制成悬浮液，于45℃水浴中保温 （3） 将毛细管插入悬浮液中，吸取培养基。 （4） 将无菌载片放于显微镜的载物台上，取已装有菌悬液并将琼脂培养基包埋固定的毛细管于载片上，用低倍镜观察。当找到单个孢子较远时，用无菌镊子将此段毛细管折断。 （5） 将含有单个孢子的小段毛细管，用酒精作管外灭菌，然后置于斜面培养基上培养。待形成菌落，检查其纯度。 ● 小滴分离法 （1） 将长滴管的顶端经火焰融化后拉成毛细管，然后包扎灭菌备用 （2） 将欲分离的样品制成均匀的悬浮液，并作适当稀释。 （3） 用无菌毛细管吸取悬浮液，在无菌的盖玻片上以纵横成行的方法滴数个小滴。 （4） 倒置盖玻片于凹载片上，用显微镜检查。 （5） 当发现某一小滴内只有单个细胞或孢子时，用另一支无菌毛细管将此小滴移入新鲜培养基内，经培养后则得到由单个细胞发育的菌落。 我们选择的样品是铁细菌，对比以上方法，我们觉得硅胶平板分离法最具有优势。下面使我们这次试验的具体步骤。 ● 实验名称：铁细菌的分离与提纯 ● 实验目的：（1）学习并掌握从土壤中分离出铁细菌的方法 （2）了解铁细菌的分离纯化原理 （3）掌握硅胶平板分离法的基本操作技术 ● 实验原理： 铁细菌是一类生活在含有高浓度二价铁离子的池塘、湖泊、温泉等水域中，能将二价铁盐氧化成三价铁化合物，并能利用此氧化过程中产生的能量来同化二氧化碳进行生长的细菌的总称。这些微生物分别属于不同类群，有的是兼性自养型，如纤发菌（Leptothrix）、泉发菌（Crenothrix），为成串的杆状细胞互相连成丝状，外面包有共同的鞘套，在细胞内或鞘套上常有 铁 等金属积累。有的是严格化能自养型，并只能在强酸性条件下生活，如氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillus fer-rooxidans），通常生活在pH4以下的环境中，这类菌在细菌浸矿中具有重要作用。铁细菌长期产生氢氧化铁，可积累成褐铁矿，在铁制水管中的生长繁殖会缩短水管的使用寿命。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。硅胶平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 ● 实验： 样品：生锈水管旁边的土壤 试剂：柠檬酸铁铵10g，含结晶水的硫酸镁0.5g，硫酸亚铁铵0.5g，磷酸氢钾0.5g，氯化钙0.2g，硝酸钠0.5g，琼脂20g，蒸馏水 器材：无菌吸管和无菌平皿、白瓷比色板、无菌水、接种环、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、酒精灯等。 ● 方法与步骤： （一）培养基的配制 称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。 1. 向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取柠檬酸铁铵10g，含结晶水的硫酸镁0.5g，硫酸亚铁铵0.5g，磷酸氢钾0.5g，氯化钙0.2g，硝酸钠0.5g，依次加入使其溶解，最后补足所需水分至1升。加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。配制固体培养基时，先将上述已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂20g加入，继续加热至完全融化。并不断搅拌，以免琼脂糊底烧焦。 2. 用pH试纸（或pH电位计、氢离子浓度比色计）测试培养基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH进行调节，直到调节到配方要求的pH值6.8～7为止。 3. 用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。 4. 已过滤的培养基应进行分装于锥形瓶内。分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。装入试管的培养基量，视锥形瓶的大小及需要而定。 5. 分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与姆指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞作成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。 6. 灭菌采用高压蒸汽灭菌法，蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。打开排气口(也叫放气阀)。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。 7. 培养基灭菌后，须趁培养基未凝固时,制作硅胶平板培养基。 （二）硅胶平板法分离 1. 制取硅胶平板 取等体积的盐酸(HCl比重1.09)和硅酸钠（比重1.10溶液），徐徐加入，缓慢混合，均匀搅拌，分装于100～200ml的透析袋中，蒸馏水中透析48h，期间换蒸馏水6～8次，待透析袋内的硅酸钠溶液无色透明后，高压蒸汽灭菌或过滤除菌。灌浇硅胶平板时，注意无菌操作技术，分别吸取预先制备并灭好菌的铁细菌分离培养基1ml、硅酸钠溶液10ml于无菌培养皿内，静置片刻，待凝固后即可使用。 2. 硅胶平板分离 采用涂布分离法。取0.1～0.2ml铁细菌培养液于5～10个铁细菌分离培养基硅胶平板上，涂布分离。然后将硅胶平板放在盛有少量水的干燥器里（防止水分蒸发，避免硅胶平板干裂），于28℃恒温下培养3～4天。 （三）纯种的鉴定 当硅胶平板上出现铁细菌极小的菌落后（多数菌落小于100μm），挑取10～20个单菌落，分别接种到铁细菌增值培养液中，28℃恒温下培养3～4天。如果有黄白色菌落即是。镜检时，会发现铁细菌为丝状，盖氏铁柄杆菌则纠结在一起。