生化分析4层析法

null 第四章 层析法 第四章 层析法null层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在固定相和流动相中的分布程度不同，从而以不同的速度移动，达到分离的目的。null层析法的分类按层析过程的机理分类：nullnull第一节 凝胶层析法 gel filtration chromatography，GFC null 凝胶层析在众多分离中被广泛采用，不同的文献中 采用了多种不同的称谓： 凝胶过滤 凝胶色谱 分子筛层析 分子排阻层析 定义： 以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各 组分进行分离的液相层析方法。1. 凝胶过滤层析的基本原理1. 凝胶过滤层析的基本原理 凝胶颗粒具有三维网状结构，可对大小不同 的分子流动产生不同的阻滞作用。 颗粒粒径：几十~几百µm 间隙：几~几十µm 孔隙的孔径：nm级固定相（凝胶）固定相（凝胶）三维空间网状结构分子筛效应： 按分子大小不同，在凝胶受到的阻滞作用有差异，从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。null蛋白质混合物上柱； 开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在颗粒外； 小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的分子开始分开； 大小不同的分子完全分开； 大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。基本概念基本概念外水体积（Vo）：凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶 颗粒间液体流动相的体积。 内水体积（Vi）：凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中固定相 的体积。 基质体积（Vg）：凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积（Vt）：凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积（Ve）：将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积分配系数（Kd） 样品中各组分的流出顺序，可用分配系数Kd来量度： 凝胶内部溶质的浓度 凝胶外部溶质的浓度 0≤Kd≤l Kd = 分配系数（Kd）null每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数 Ve=Vo+KdVi（1） Kd=0，Ve=Vo 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相中 最先流出（2）Kd=1，Ve=Vo+Vi 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1，最后流出（3） 0＜Kd＜1，Ve=Vo+KdVi， 溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散特点：与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关null要分离的分子分为三类： A类：比孔径大的分子，全排出 凝胶，无阻滞，最早流出； C类：较小的分子，能进入全部 孔隙区，阻滞最大，流速最慢， 最晚流出； B类： dC﹤dB﹤dA ，在流动中 部分渗透，渗透程度取决于分子 的大小，流出时间介于两者之间null二、凝胶过滤层析的基本操作（1）凝胶的选择 凝胶必须具备的条件： 必须是惰性载体， 即与欲分离的溶质分子不发生任何作用 化学性质必须稳定 尽可能是低电荷，避免离子交换反应 颗粒大小均匀 机械强度尽可能高null常用的凝胶种类 葡聚糖凝胶： 商品名称：Sephadex 型号：G10~200 型号含义：每克干凝胶吸水量×10；数字越小的介质交联度 越大，分级范围越小，凝胶吸收水越少，溶胀时间越短；而 数字越大的介质交联度越小，分级范围越大，凝胶吸收水越 多，溶胀时间越长。 特点：理化性质稳定，耐热耐碱不耐酸，网孔小葡聚糖凝胶（G类）的规格葡聚糖凝胶（G类）的规格null聚丙烯酰胺凝胶： 并非天然产物，是通过化学方法合成的。 商品名：Bio-Gel P 商品型号：P-2至-300 型号含义：排阻限度，×1000相当于允许进入凝胶内部蛋白 质的最大分子量。数字越大表示交联度越小，可分离的分子 量越大；而数字越小则交联度越大，可分离的分子量越小。 特点：理化性质稳定，抗微生物侵袭能力较大，适用于配基 和亲和物之间亲和力比较弱的系统，应避免在pH2-11以外的 溶液中长期使用。聚丙烯酰胺凝胶的性质聚丙烯酰胺凝胶的性质nullnull琼脂糖凝胶： 商品名称：Sepharose（瑞典，pharmacia） Bio-Gel-A（美国，Bio-Rad） 型号：2B，4B，6B; Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M，150M。 型号含义：琼脂糖浓度为2%，4%，6%; 阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。 特点：亲水性强，理化性质稳定，网孔大，非专一性吸附 小，只能以湿态保存，经不起有机溶剂处理。温度稳定范围 较窄，低于0℃会使颗粒结构遭受不可逆的破坏，而高于40℃ 凝胶会熔解。因此不能用高温灭菌，可采用化学方灭菌。适 合于组分分子量差异较大的混合物的分离。nullnull生物样品常见的两种分离形式生物样品常见的两种分离形式分组分离：将样品混合物按相对分子质量大小分成两组，一组较大，一组较小，使大分子完全排阻而小分子完全渗透。 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。即大分子的分配系数Kd= 0，小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。null分级分离：将一组相对分子质量比较接近的组分分开。 选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。（2）凝胶的预处理（2）凝胶的预处理使用前须溶胀，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平衡。 室温下干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。 热法溶胀：将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100℃，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。 纯化、排除气泡葡聚糖凝胶（G类）的规格葡聚糖凝胶（G类）的规格（3）层析柱的选择（3）层析柱的选择柱比：层析柱长度与直径的比值 对于分组分离，柱床体积一般为样品溶液体积的5倍，柱比5:1到10:1即可。 对于分级分离，要求柱床体积大于样品体积25倍以上，甚至多达100倍。柱比在25:1至100:1。（4）洗脱液的选择（4）洗脱液的选择洗脱液的作用：消除组分与固定相的吸附等相互作用，并不改善分辨率。 洗脱液的选择：主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶过滤。 常用0.02-0.15mol/L离子强度的缓冲盐溶液null（5）凝胶柱的装填除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致，装柱过程中温度也要恒定。 应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。 将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直。 先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要排除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15％。 null柱子接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注入柱内。注意避免产生气泡。 柱装好后，静置10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。 柱内胶面上部保留2～3cm洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍柱体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来。 调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。检查流体静力压，不要超过规定数值。 检查柱装得是否均匀: 蓝色葡聚糖-2000（6）加样（6）加样加样要尽量快速、均匀。 分级分离：加样体积一般为柱床体积的1-5% 分组分离：加样体积一般为柱床体积的10-25% （7）洗脱速度 要恒定而且合适。 凝胶的线流速一般为2~10cm/h（8）凝胶的保存（8）凝胶的保存保存：反复洗涤去除蛋白等杂质后，加入抗菌剂（常用0.02%的叠氮化钠），4℃保存。 长时间保存：水洗后滤干，依次用50、70、90、95% 乙醇脱水，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。不能将溶胀的凝胶直接高温烘干！凝胶过滤层析凝胶过滤层析优点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、不改变样品生物活性； 缺点：分辨率较低，尤其是相对分子质量相近的分子之间。 应用：蛋白质（酶）、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化，高分子溶液的浓缩，脱盐，测定高分子物质的分子量。 第二节 亲和层析 （affinity chromatography，AC) 第二节 亲和层析 （affinity chromatography，AC)1.亲和层析的基本原理1.亲和层析的基本原理null 将具有亲和力的两个 分子中的一个（配体）固 定在不溶性基质（载体） 上，利用分子间亲和力的 特异性和可逆性，对另一 个分子进行分离纯化。 亲和层析是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异 的生物亲和力而达到分离纯化目的的层析方法。nullnullnullnullnullnull2. 理想的亲和层析介质的基质的特征2. 理想的亲和层析介质的基质的特征较好的理化稳定性，不易受pH、离子强度、温度、变性剂和去污剂等的影响； 较多的化学活性基团，能与配体稳定的共价结合，且结合后不改变基质和配体的基本性质； 多孔的立体网状结构，能使被吸附的大分子自由通过而增加配体的有效浓度； 高度亲水，使生物分子易于接近并与配体作用； 惰性载体，尽量减少非特异性吸附； 有良好的机械性能，利于控制层析流速，最好是大小均一的珠状颗粒。3.理想的配体应具有的性质3.理想的配体应具有的性质配体与待分离物质有适当的亲和力，亲和力过弱或过强都不利于亲和层析分离； 配体与待分离物质之间的亲和力要有较强的特异性，这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素； 配体要能与基质稳定地共价结合，在层析过程中不易脱落，且与基质偶联后，其结构没有明显改变；尤其是偶联过程不涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明显影响； 配体自身有较好的稳定性，能耐受操作条件的影响，可多次重复使用。null特异性配体：只与一种或很少几种生物大分子结合的配体，如生物素-亲和素、抗原-抗体、酶-抑制剂、激素-受体等； 通用性配体：特异性不是很强，能与某一类生物大分子结合的配体，如各种凝集素-各种糖蛋白等null4. 基质的活化 通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一 些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 琼脂糖用溴化氰、环氧氯丙烷活化；聚丙烯酰胺凝胶 的活化是通过对甲酰胺基的修饰；多孔玻璃珠采用与硅烷 化试剂反应引入氨基。 null5. 配体与基质的偶联 活化基质可以在温和的条件下，经过与配体表面残基的 氨基、羧基、醛基、酮基、羟基、硫醇基等反应，将配体偶 联于基质上。 偶联后，必须反复洗涤，去除未偶联的配体，还要用适 当方法封闭基质中未偶联上配体的活性基团，也就是使基质 失活。null6. 亲和层析的基本操作 （1）上样 样品液的浓度不易过高，上样时流速应比较慢 生物分子间的亲和力是受温度影响的，通常亲和力随温度的升高而下降。低温上样，高温洗脱。 上样后用平衡缓冲液尽可能多的洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。null（2）洗脱 采用降低目标产物与配体之间亲和力的方式进行洗脱。 非特异性洗脱：是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、 浓度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待 分离物质洗脱下来。 注意：尽量不影响待分离物质的活性，而且洗脱后应注意中 和酸碱，透析去除离子，以免待分离物质失活。 null特异性洗脱：是指利用洗脱液中的物质与待分离物质 或与配体的亲和特性，而将待分离物质从亲和吸附剂 上洗脱下来。 选择与配体有亲和力的物质进行洗脱； 选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。 特异性洗脱特异性洗脱优点： 特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而 得到较高的分辨率；洗脱条件温和，大分子物质不易变性。 缺点： 平衡比较慢，往往需要较长的时间和较大的洗脱条件； 价格昂贵。null（3）亲和吸附剂的再生和保存 亲和吸附剂的再生：指使用过的亲和吸附剂，通过适当的方法去除吸附在基质和配体上结合的杂质，使之恢复亲和吸附能力。 一般处理方法：用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡即可再次使用。 强烈的处理方法：使用高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶。 亲和吸附剂的保存：一般是加入0.01%的叠氮化钠，4℃下保存。也可以加入0.5%的醋酸洗必泰或0.05%的苯甲酸。注意不要使亲和吸附剂冰冻。亲和层析亲和层析优点: 1.纯化过程简单，迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和 缺点: 1.针对某一分离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的实验条件 2.配体的选择及其与基质的共价结合需要烦琐的操作步骤 第三节 离子交换层析第三节 离子交换层析（ion-exchange chromatography, IEC）1. 离子交换层析的基本原理1. 离子交换层析的基本原理离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流 动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可 逆交换时的结合力大小的差别，将混合物中不同离子进行分离的一种层析方法。 离子交换层析的主要依据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力。离子交换剂的组成离子交换剂的组成基质（载体）：不溶性的惰性高分子聚合物，呈三维骨架结构，内有许多孔隙； 活性基团（功能基团）：共价键合于载体上的不能移动的荷电基团； 活性离子（平衡离子、反离子）：与活性基团以离子键连接的，带有与活性基团相反电荷的离子 离子交换剂的分类离子交换剂的分类阳离子交换剂：活性基团是酸性基团，活性离子是阳离子，可以溶液中的其他阳离子发生交换 阴离子交换剂：活性基团是碱性基团，活性离子是阴离子，可以溶液中的其他阴离子发生交换离子交换反应离子交换反应 假设以RA代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为： RA+B+=RB+A+null离子交换的原则 离子交换的原则 在稀溶液中，离子交换剂和各种水合离子的结合力与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。 所以，离子价数越高，结合力越大。在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力亦越大。因此在稀溶液中离子发生水化时，各种阴离子和阳离子结合力大小的排列序次如下：null不同价阳离子： Na+17%时，其结合力很小； 粒度：粒度小，则分离效果很好 （2）活化：将硅胶在110℃烘烤0.5~1h，其吸附力增强。活化后立即使用，或短期贮存于干燥器中。（三）洗脱剂（三）洗脱剂纯度较高 稳定性好 黏度小 能较完全的洗脱下被分离的成分 易和所需的成分分开 选择洗脱剂的顺序应从极性小 大 一般蛋白质或核酸被极性强的HAP吸附后，要用含有盐梯度的缓冲液洗脱；而甾体或色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱。null（四）吸附层析的操作（1）吸附剂的用量 一般吸附剂的用量为被分离样品的30~50倍。若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于样品的100倍。 null（2）装柱 1.干法装柱：将干净的柱子与桌面垂直固定，在柱子底部用一小团棉花塞住下段开口处，将需用的固定相倒入柱体后用橡皮锤轻轻敲打柱壁，最后用水泵抽实。然后倒入溶剂。 此法不易将气泡排尽，容易导致层析不均匀null2.湿法装柱： a. 先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气； b. 然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将 此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的 1/4~1/3时打开柱下端口，让溶剂慢慢流出，使柱上 端悬浮液徐徐下降至需要的高度。并用2~3倍量的 洗脱剂流过层析柱，使其达到平衡。null（3）上样和洗脱null（4）绘制工作曲线吸附层析的应用吸附层析的应用纯化蛋白、核酸、脂类等 分离蛋白质的亚基 浓缩溶液 null第五节 分配层析null一、定义分配层析是利用各组分的分配系数不同而进行分离的方法。分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，溶质在两相中的浓度比值：null当样品中含有多种分配系数各不相同的组分时，分配系数越小的组分，随流动相迁移的越快。两个组分的分配系数差别越大，在两相中分配的次数越多，越容易被彻底分离。 分配层析分配层析固定相：常用多孔性固体支持物如滤纸、硅胶等吸附着一种溶剂 流动相：另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂，沿固定相流动（一）纸层析原理（一）纸层析原理 纸层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂（与水不相混溶或部分混溶）作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离的目的。 null溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示： Rf值取决于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，可以根据Rf值的大小对物质进行定性

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。（二）影响Rf值的主要因素（二）影响Rf值的主要因素1. 物质的结构和极性 极性较大的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小。 2. 滤纸 不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的 水量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不 同型号的滤纸上进行层析时，所得到Rf值也不相同。 null3. 层析所用的溶剂 溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理 后才能使用。 同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，Rf 值不同。所以溶剂的配制和使用必须严格，才能使 Rf值的重现性好。在好的溶剂系统中，被分离物质 的Rf值应在0.05-0.85之间，样品中被分离组分的Rf 之差最好大于0.05。null4.pH值 溶剂和样品的pH值会影响物质的解离，从而影响物质 的极性和溶解度，使Rf值改变。可以用缓冲溶液调节溶剂 或样品溶液的pH值，使之保持恒定。 5. 温度 温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系 数；也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积； 还能显著影响多元溶剂系统的含水量，即影响流动相的组 分比例。层析必须在恒温条件下进行。6. 展开方式6. 展开方式上行法 将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因毛细管引力的作用从下向上流动。上行法操作简单，重现性好，是最常用的展开方法，但展开时间较长。 下行法 在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。下行法展开速度快，但Rf值的重现性较差，斑点易扩散。 环行法 又称水平法，样品点于圆形滤纸距圆心1cm左右的环形线(原线)上。滤纸水平放置，溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向流动。由于溶剂向圆周方向扩散，所以展开的图谱呈弧形。null用上行法展开时， Rf值较小； 用下行法展开时， Rf值较大； 用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小， 限制了溶剂的流动， Rf值也较小。（三）操作方法 （三）操作方法 1. 样品处理 除杂纯化、调节pH、调整浓度 2. 点样null3. 平衡 点样以后展开以前将滤纸和层析缸用配好的溶 液系统的蒸汽来饱和，这个过程为平衡。 若不经平衡，在层析过程中，滤纸会从溶剂中 吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，从而改变溶 剂系统的组成，严重时纸上会出现不同水平的溶剂 前沿，严重影响层析效果。null4. 展开 按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和 环行三种方式。 5. 显色 （1）显色剂显示：被分离物质与显色 剂生成有颜色的化合物，显示斑点位 置。常用喷雾法、浸渍法或涂刷法。 （2）紫外光显示：有些物质有紫外光 吸收性质，如核苷酸类物质。有些物 质受紫外光照射会发出荧光，如维生 素B1、B2等。null6. 定性分析 计算各斑点的Rf值，对物质进行定性。 7. 定量分析 （1）剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后，通 过分光光度计进行比色定量。 （2）直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸上斑 点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积求出待测 物的含量。 （3）面积测量法：圆形或椭圆形斑点的面积与物质含量的 对数成正比。可用测量斑点面积的方法求得物质的含量。