壳聚糖

http://www.hxtb.org 化学通报 2005年 第 68卷 w018 壳聚糖——一种新型基因载体 何乃普 1,2 王荣民 1* 宋鹏飞 1 王云普 1 (1 西北师范大学甘肃省高分子重点实验室 兰州 730070 2 兰州交通大学化学与生物工程学院 兰州 730070) 摘 要 介绍了壳聚糖及其衍生物作为新型基因载体的壳聚糖-DNA复合物、壳聚糖-DNA纳米 微球和壳聚糖-DNA自聚体等三种主要形态和类型。 关键词 壳聚糖 DNA 基因载体 Chitosan——A Novel of Gene Vectors He Naipu1,2, Wang Rongmin1*, Song Pengfei1, Wang Yunpu1 (1 Gansu Key Laboratory of Polymer Materials, Northwest Normal University, Lanzhou 730070; 2 College of Chemical and Biological Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070) Abstract The applications of chitosan and its derivatives as novel gene vectors including chitosan- DNA complexes, chitosan-DNA nanospheres and Chitosan-DNA self-aggregates are introduced. Keywords Chitosan, DNA, Gene vectors 基因治疗是近十几年来随着现代医学与分子生物学相结合而诞生的，它是指在基因水平上 将正常有功能的基因或其它基因通过基因转移方式将治疗基因导入到患者体内，并使之达功 能正常的基因，或表达患者原来不存在或表达很低的外源基因，赋予患者新的抗病能力[1]。这 里，关键在于有效的基因表达和基因转移，如何有效地把目标基因转入病人体内并稳定的表达， 显得尤为重要。这就要求在载体的改造、外源基因的表达等诸多方面进行深入的研究[2]。基因 治疗中所用载体大体可分为两类，一类是毒性小、安全性高的非病毒载体；另一类是基因转移 效率高的病毒性载体，但其安全性问题需要重视。 由于非病毒载体在毒性、安全方面的优点，得到了飞速发展。特别是，用多聚氨酸或阳离 子脂质体包裹 DNA 的方法得到了化学家和生物化学家的高度重视。自从 20 世纪 80 年代聚赖 氨酸(Poly-L-lysine)[3]被用作非病毒载体后，许多阳离子聚合物，包括聚 1,2-亚甲基亚胺(PEI)[4]、 Poly(amidoamine)(PAMAM)dendrimers[5]、明胶(gelatin)[6]等，已被用作基因治疗研究的非病毒载 体。但这些聚合物的转染率(Transfection effciency，转染即为将外源 DNA引入动物细胞的过程[7]) 相对较低，并具有一定毒性。作为非病毒性载体使用的聚合物必须满足下列条件：(1)具有生物 相容性，无细胞毒性、无基因免疫性和具有生物可降解性；(2)能形成较小的 DNA 复合物颗粒； (3)能保护 DNA 复合物在通过血液时不被降解；(4)能高效的输送 DNA 到达靶组织；(5)更理想 的是这种 DNA复合物能够对特定的细胞具有靶向性。其对细胞的转染过程如图 1所示[8]。 何乃普 男，硕士生，助教，从事高分子化合物生物活性研究和高分子化学及实验、有机化学及实验教学工作。*联系人，Email: wangrm@nwnu.edu.cn 国家自然科学基金资助项目(20274034) 2004-03-31收稿，2004-09-20接受 http://www.hxtb.org 化学通报 2005年 第 68卷 w018 2 + DNA 2 1 3 45 6 载体 细胞 细胞核 内吞噬体 图 1 载体-DNA复合物对细胞的转染过程 Fig.1 Transfection of the vector/DNA complex to cell 1质粒 DNA对靶细胞的转染依靠合适的 DNA载体；2载体-DNA复合物与靶细胞特异性结合； 3复合物在细胞中吞噬体内的吸收；4从内吞噬体内成功释放；5转入细胞内和 DNA的核定域作用；6 DNA与载体分离 Mumper 等[9]首先研究了壳聚糖作为非病毒性载体在基因治疗中的应用。壳聚糖作为一种天 然阳离子聚合物，通过与 DNA 以静电方式作用使壳聚糖-DNA 体系不被降解，完全进入细胞。 作为基因载体，它具有细胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和转染效率较高等特点，引 起了大家的重视[10~15]。为了使壳聚糖成为一种良好的非病毒性基因载体，人们对壳聚糖-DNA 复合物的制备及其生物活性进行了大量的研究。从壳聚糖-DNA 的制备方法来讲，主要集中在 壳聚糖及其衍生物的 DNA复合物、壳聚糖-DNA纳米微球和壳聚糖自聚体-DNA三个方面。 1 壳聚糖-DNA复合物 Simon 等[16]用 4mol/L HCl 将壳聚糖降解，制得了不同脱乙酰度(DDA)和不同分子量的低聚 壳聚糖(表 1)及其 DNA复合物，考察了不同分子量的壳聚糖-DNA复合物的稳定性、细胞毒性、 表 1 不同壳聚糖的分子量和脱乙酰度(DDA) Tab.1 Molecular molecular weight and DDA of the chitosan 壳聚糖 脱乙酰度/% 分子量/Da N1 65.4 小于 5000 N2 55.3 5000～10000 N3 55.3 大于 10000 溶血性、动物体内分布、与 DNA 的复合能力和壳聚糖-DNA 复合物保护 DNA 不被核酸酶降解 的能力。研究表明，静电作用和氢键的存在是形成壳聚糖-DNA 复合物的重要因素；随着壳聚 糖分子量的升高，其细胞毒性也在逐渐升高，并当分子量较小时，对人类肺细胞胚胎 L132 无 细胞毒性；核酸酶 II降解壳聚糖-DNA复合物的程度明显降低，在 60min内，当电荷比(－/+)为 1/1时，没有发现壳聚糖-DNA复合物被降解的现象，而当其为 1/0.05时，降解程度约为 20%。 在用 125I 跟踪壳聚糖-DNA 复合物在动物体内分布的研究中发现，静脉注射 N2-DNA、N3-DNA 5min后，少于药剂总量的 15%被发现在血液中，而多于 50%的则已在肝中，60min时，N1-DNA 复合物在血液中发现 30%，在肝中仅发现 30%，而其它复合物则在循环体系中已不能发现。以 http://www.hxtb.org 化学通报 2005年 第 68卷 w018 3 上实验结果表明，当壳聚糖分子量大于 5000Da 时，壳聚糖-DNA 复合物对肝具有明显的特异性 输送功能，而当壳聚糖分子量小于 5000Da 时，壳聚糖-DNA 复合物对肝不具有明显的特异性输 送功能。 Fiona 等[17]把壳聚糖在亚硝酸钠和 6%的醋酸溶液中 25℃降解 1h，随加入的亚硝酸钠量不 同，制得了 102～7kDa 的低聚壳聚糖，并用这些低聚糖与质粒 DNA 反应制备壳聚糖-DNA 复 合物，通过考察反应时质粒 DNA 的浓度、壳聚糖的分子量和电荷比等对所形成的壳聚糖-DNA 颗粒大小的影响，发现通过对上述影响因素的合理控制，可以得到在 100～500nm 范围内特定 大小的壳聚糖-DNA 复合物颗粒。在考察壳聚糖-DNA 复合物颗粒于盐和血清中的稳定性时发 现，质粒 DNA 的浓度、壳聚糖的分子量和电荷比等对壳聚糖-DNA 颗粒的稳定性有不同程度的 影响，当壳聚糖分子量较高时，其 DNA 复合物颗粒在盐和血清中则更稳定，且电荷比(－/+)为 1/2时最稳定。因此，在体外实验中选用电荷比(－/+)为 1/2的壳聚糖-DNA复合物，考察了其在 COS-1细胞中的表达水平，在无血清时，分子量 102kDa的壳聚糖与 DNA形成的复合物具有相 对最高的表达水平，而分子量 540kDa 的壳聚糖与 DNA 形成的复合物则仅有很低的表达水平； 然而，在 10%的血清溶液中，分子量 540kDa 的壳聚糖与 DNA 形成的复合物在 COS-1 细胞中 具有相对最高的表达水平，并且表达水平随着壳聚糖分子量的降低而降低。继而用兔子进行了 质粒在肠内组织的表达实验，表明壳聚糖可以作为粘膜性上皮细胞的基因传输载体。 Ishii 等[18]对壳聚糖作为非病毒载体在基因治疗中的应用进行了进一步研究，并提出了可能 的机理。他们考察了电荷比 N/P=5时，分子量 1～110kDa的壳聚糖与 DNA形成的壳聚糖-DNA 复合物的转染效率，结果表明，分子量 40kDa 和 84kDa 的壳聚糖与 DNA 形成的 DNA 复合物 具有高的转染效率，而分子量 1kDa 和 110kDa 的壳聚糖与 DNA 形成的 DNA 复合物几乎没有 发现转染，但分子量为 1kDa 的壳聚糖与 DNA 形成的 DNA 复合物很容易与细胞缔合。用分子 量为 40kDa的壳聚糖与 DNA形成 N/P=5的壳聚糖-DNA复合物，研究了质粒 DNA浓度对其转 染效率的影响，随着质粒 DNA 浓度的增大，复合物的转染效率也增大，而其细胞摄入量随着 质粒 DNA 的浓度增大到 4µg/mL 而增大，在 4～10µg/mL 的范围内则无规律性。实验发现，影 响壳聚糖-DNA复合物的转染效率的主要因素包括形成壳聚糖-DNA复合物的壳聚糖的分子量、 电荷比、血清浓度和介质的 pH等。对于壳聚糖分子量为 40kDa和 84kDa、N/P=5、pH=7的 10% 血清溶液，壳聚糖-DNA 复合物具有最高的转染效率。在对其与细胞作用的机理研究中发现， 壳聚糖-DNA 复合物可能凝聚，从而形成一个大的聚集体吸附在细胞表面，它还具有高的核酸 堆积作用和抑制细胞和核酸酶降解作用。 壳聚糖的分子量、DNA 复合物的 N/P 等因素对壳聚糖-DNA 复合物的转染效率具有至关重 要的作用。为了使壳聚糖-DNA 复合物颗粒作为非病毒载体具有更大的优势，有人对壳聚糖进 行了进一步的改性，并对形成壳聚糖衍生物-DNA复合物后的各个参数进行了研究。 Thanou 等[19]用结构单元小于 20 的低聚壳聚糖制成三甲基低聚壳聚糖季铵盐(TMO)，使其 与 DNA 形成壳聚糖 -DNA 复合物 (TMO-DNA)。两种季铵化程度不同的壳聚糖衍生物 40%(TMO-40)和 50%(TMO-50)，能溶于不同 pH 的水溶液中，且在 DNA/TMO 为 2/100 和 2/10 时，季铵化的壳聚糖与 DNA 形成的复合物颗粒大小与未改性的壳聚糖与 DNA 形成的复合物颗 http://www.hxtb.org 化学通报 2005年 第 68卷 w018 4 粒大小相比小一些。这说明低聚壳聚糖季铵化后使其对 DNA的凝聚作用明显增强，从而与 DNA 混合后迅速形成 DNA 复合物；且在中性条件下，季铵化的壳聚糖衍生物与 DNA 的键合作用明 显强于未进行改性的低聚壳聚糖。同时还发现，壳聚糖的正电性对凝聚和保护 DNA 具有重要 作用。在研究季铵化壳聚糖-DNA复合物在细胞中的转染率和对细胞的毒性时发现，TMO-50在 COS-1细胞中的转染率从5倍(DNA/TMO-50=1/6)到52倍(DNA/TMO-50=1/14)连续增大，TMO-40 在 COS-1 细胞中的转染率则更高，即从 26 倍(DNA/TMO-40=1/6)到 131 倍(DNA/TMO-40=1/14) 连续增大。与壳聚糖-DNA 复合物相比，TMO-DNA 系列复合物在 COS-1 细胞中的转染率远高 于低聚壳聚糖-DNA复合物；TMO-DNA系列复合物在 COS-1细胞中的转染率高于在 Caco-2细 胞中的转染率，且对 COS-1和 Caco-2细胞均无细胞毒性。这表明，该类 DNA复合物可以用作 上皮细胞系的基因转移载体。但这类 DNA复合物无细胞特异识别能力。 Murata 等合成了一系列含有半乳糖的季铵化壳聚糖衍生物，并对其细胞毒性和识别能力进 行了研究。季铵化壳聚糖-DNA 复合物对 Hela 细胞的体外实验中表现出较小的细胞毒性，含有 半乳糖的季铵化壳聚糖(TC-Gal15)-DNA 复合物由于半乳糖的引入使其对 APA 外源凝集素具有 识别能力，但不是太高[20]。相对于季铵化壳聚糖(TM-壳聚糖)-DNA 复合物对 RCA120 外源凝集 素具有低的表观亲合常数，半乳糖的季铵化壳聚糖(TC-Gal15 和 C-Gal20)-DNA 的复合物对 RCA120外源凝集素具有较高的表观亲合常数，TC-Gal14A20 与 DNA 形成的复合物则具有最高 的表观亲合常数，并随着半乳糖化程度的增大其表观亲合常数也增大，这表明这类半乳糖化的 壳聚糖衍生物-DNA复合物可用于对肝素细胞具有特异识别性能的基因输送载体[21]。 为了提高半乳糖化壳聚糖 GC-DNA复合物在水中的稳定性，Park等在半乳糖化壳聚糖上接 枝了不同的亲水基团，并制备了多种壳聚糖衍生物-DNA 复合物，如接枝了葡聚糖(Dextran)的 半乳糖化壳聚糖 GCD-DNA复合物(GCD-DNA)[22]、接枝了聚乙二醇的半乳糖化壳聚糖 GCP-DNA 复合物(GCP-DNA)[23]和接枝了聚乙烯基吡咯烷酮半乳糖化壳聚糖 GCPVP-DNA 复合物(GCPVP- DNA)[24]。研究结果表明，GCD-DNA和 GCP-DNA复合物颗粒的大小随着 GCD/DNA比值的增 大而减小，当 GCD/DNA=5 时达到最大(200nm)，GCP/DNA=5 时达到最小(27nm)。由于电荷的 排斥作用和复合物中引入了亲水基团葡聚糖，从而防止了 DNA的自聚集行为，也使 GCD-DNA 复合物在水中的稳定性强于 GC-DNA，并且这种 DNA 复合物仅对带有 ASGR 受体的 Chang 肝 细胞转染。GCP-DNA 对 HepG2、Hela 和 CT-26 细胞均无细胞毒性，并不被核酸酶降解，这种 DNA 复合物在较小尺寸(小于 100nm)时对肝细胞具有特异性的有效转染。GCPVP/DNA=3 时， GCPVP-DNA复合物颗粒达到最小 40nm，壳聚糖分子量为 10kDa的衍生物GCPVP10kDa与DNA 的键合能力强于 GCPVP50kDa，但对防止核酸酶的降解却弱于后者。GCPVP-DNA 复合物在体 内的分布和生物有效性主要依靠复合物的物理化学性质，如壳聚糖的分子量、复合物电荷特性、 与血清蛋白和细胞表面的作用。他们对上述几种 DNA 复合物用圆二色谱考察了 DNA 与壳聚糖 衍生物复合后二级结构的变化，发现 DNA 二级结构与未进行复合前没有变化。通过这些研究 可以得出结论，即亲水基团的引入和壳聚糖具有较小的分子量对于增强壳聚糖衍生物与 DNA 的键合能力和防止 DNA 的凝聚是必要的，又由于对肝细胞具有特异的转染能力，故这类壳聚 糖衍生物可作为对肝细胞靶向传送的 DNA载体。 http://www.hxtb.org 化学通报 2005年 第 68卷 w018 5 最近 Gao 等[25]对半乳糖的壳聚糖衍生物与 DNA 形成的复合物进行了较为详细的研究。对 分子量为 145kDa的壳聚糖(HMWC)用 4mol/L的 HCl溶液进行降解，得到了分子量 21kDa的低 聚壳聚糖(LMWC)，并用 LMWC 与半乳糖反应制得半乳糖化的壳聚糖衍生物(Gal-LMWC)。在 制备过程中发现，随着 LA(半乳糖酸)/LMWC 比值的升高，Gal-LMWC 半乳糖化程度呈线性增 长趋势，当 LA/LMWC 大于 0.5 后，Gal-LMWC 半乳糖化程度保持不变。在制备壳聚糖-DNA 复合物(HMWC/DNA、LMWC/DNA、Gal-LMWC/DNA)中发现，通过控制壳聚糖的分子量、复 合过程中的 N/P比值以及 DNA和壳聚糖的浓度等参数，可以制得特定颗粒大小的 DNA复合物， 并且随着壳聚糖半乳糖程度的提高，其颗粒大小由 314nm 增大到 341nm。在研究三种壳聚糖衍 生物对 HepG2 和 Hela 两种细胞的毒性时发现，三种衍生物对这两种细胞的毒性均小于市售的 Lipofectin 和 CaP 试剂，甚至在浓度为 100 和 150µg/mL 时能够提高 HepG2 细胞的繁殖能力， 这说明 Gal-LMWC 是一种无毒性、生物相容性好和安全的载体。在研究 Gal-LMWC-DNA 复合 物对 HepG2细胞的转染效率时发现，随着 DNA复合物的 N/P值从 0.94/1增大到 5.6/1，其转染 效率也在增大，在 N/P=5.6/1 时达到最大，最后又呈下降趋势，并且保护 DNA 不被细胞中的酶 降解。由于半乳糖的引入，Gal-LMWC-DNA 复合物对肝细胞具有特异的选择性转染，并随着 半乳糖化程度的提高，其转染率也在提高。这表明 DNA 复合物的 N/P 值和半乳糖化程度是影 响其对细胞的转染效率的主要因素。 上述一系列研究结果表明，壳聚糖及其衍生物作为在基因治疗中的载体是有很大应用前景 的。壳聚糖的分子量、DNA 复合物的 N/P 值、DNA 复合物颗粒大小和对壳聚糖的改性及其改 性程度是影响这类 DNA复合物对细胞的转染效率和是否对特定细胞具有靶向性的主要因素。 2 壳聚糖-DNA纳米微球(Chitosan-DNA nanospheres) 虽然壳聚糖-DNA 复合物易于制备，但其转染效率明显低于阳离子性脂质体，除了 N/P 值 和壳聚糖分子量的影响外，从合成的角度没有其它参数能够有效地控制壳聚糖-DNA 复合物的 转染效率。从而人们开展了壳聚糖-DNA 纳米微球的研究[26]。Mao 等[27]首先制备了壳聚糖-DNA 纳米微球，并得到了较好的基因转染数据。壳聚糖-DNA 纳米微球的制备一般需要增大混合速 度和升高温度，用无机盐(Na2SO4)作为沉降剂，制得 200～500nm 的壳聚糖-DNA 纳米微球。这 种壳聚糖-DNA复合物较上述提到的壳聚糖-DNA复合物在形态上有很大的不同，结构上也较为 紧凑。对壳聚糖-DNA纳米微球通过口服后体内分布和转移的研究发现，壳聚糖-DNA纳米微球 作为基因载体是可以肯定的，并能提高 DNA的转染效率[28,29]。 Roy等[30]的研究结果表明，简单的壳聚糖-DNA纳米微球(plain Chitosan-DNA nanospheres， 化合物 1)虽然能够转染 HEK293、IB3 和 THE 细胞，但其转染效率低于市售 Lipofectin 试剂。 为此，进行了必要的改性，以提高转染效率。Mao用复合凝聚法制备了壳聚糖(MW＝390000)-DNA 纳米微球，为了防止其发生聚集行为，用 PEG(MW＝5000)对壳聚糖-DNA 纳米微球进行改性， 在反应温度为 55℃、pH=5.5、Na2SO4浓度 50mmol/L、壳聚糖浓度 0.005～0.02(w/V)%和 DNA 浓度0.004%～0.008%时制得了较为理想的壳聚糖-DNA纳米微球(图2)。连接转铁蛋白(transferrin) 与壳聚糖-DNA纳米微球后对提高其表面性质和转染率有一定的影响。这种壳聚糖-DNA纳米微 球表现出下列优点：(1)配体连接于纳米微球的表面对受体细胞的内吞噬具有靶向性和刺激性；(2) http://www.hxtb.org 化学通报 2005年 第 68卷 w018 6 其它生物活性试剂或者复合脂粒也能被共封入(co-encapsulated)；(3)由于保护 DNA 不被酶降解， DNA的生物利用性有所提高；(4)冷冻保存纳米微球其生物活性不丧失。 化合物 1 图 2 转铁蛋白和 PEG5000与纳米微球结合示意图 Fig.2 Chemical scheme for conjugating transferrin and PEG5000 to the nanospheres 随后 Mao 等进一步对制备壳聚糖-DNA 纳米微球时几个重要参数的影响及其性能进行了研 究[31]。在制备壳聚糖-DNA 纳米微球时其最优化条件为：N/P=3～8、壳聚糖浓度为 100µg/mL、 颗粒尺寸为 100～250nm 和具有较窄的分布、DNA 和壳聚糖的质量百分含量分别为 35.6%和 64.4%，并具有一定的疏水性，这种疏水性使纳米颗粒较为稳定而不致交联、使 DNA 完全被封 入而不被核酸酶降解。壳聚糖-DNA 纳米微球对细胞的转染效率因不同的细胞类型而异，在 HEK293 和 IB-3-1 细胞较在 9HTEo 和 HeLa 细胞中具有较高的基因表达水平。转铁蛋白与壳聚 糖-DNA纳米微球在 HEK293和 HeLa细胞中的转染效率提高了 4倍；壳聚糖-DNA纳米微球的 表面 PEG 化提高了壳聚糖-DNA 纳米微球的物理化学稳定性和贮存稳定性，阻止了它在水溶液 中的聚集行为和在冷冻干燥后的自由聚集行为，更为重要的是在贮存一个月后并不影响它们的 转染效率。在静脉注射 15min后，在肾和肝中有较高的沉积，壳聚糖-DNA纳米微球的表面 PEG 化其清除速度稍慢于未改性的壳聚糖-DNA纳米微球。 Cui 等[32]将壳聚糖经羧甲基纤维素化(CMC)改性后制成壳聚糖-DNA 和 CMC-DNA 纳米微 球，将这些 DNA 纳米微球应用于老鼠局部皮肤，24h 后具有较好的基因表达。在 Roy 等的一 项专利[33]中将具有靶向性的配体交联于壳聚糖-DNA 纳米微球表面，从而得到具有特异靶向性 的壳聚糖-DNA 纳米微球，用作基因输送载体，这些具有靶向性的配体可以以任意摩尔数交联 于壳聚糖-DNA 纳米微球表面，其中包括抗体、激素以及其它对细胞具有特异性的配体。这些 研究结果表明，壳聚糖是一种可以将细胞毒性降到最低、应用广泛的基因载体，通过对壳聚糖- http://www.hxtb.org 化学通报 2005年 第 68卷 w018 7 DNA纳米颗粒表面进行改性来提高其稳定性是可取的。 黄伟等[34]用复合凝聚法制备了壳聚糖-DNA纳米微球，初步研究了壳聚糖-DNA纳米微球的 性质和转染活性。纳米微球多呈球形，平均粒径为 218.9nm，分散度为 0.276，DNA 封入率为 99.6%，几乎全部被包裹在纳米粒内部，表面吸附很少，体外基因转染实验表明，壳聚糖-DNA 纳米微球能够转染人胚胎肾细胞 HEK293和肝癌细胞 HepG2，并能够在这两种细胞中表达。 3壳聚糖自聚体-DNA复合物(Chitosan self-aggregates-DNA complexes) 最近对嵌段共聚物胶束和疏水性水溶性高分子化合物的研究表明，这种既有疏水基团又有 亲水基团的高分子化合物能在水溶液中形成具有疏水核和亲水外壳的胶束，被大量应用于药物 输送体系[35]，其中也用于基因载体。Lee 等将壳聚糖用脱氧胆酸改性后，形成壳聚糖自聚体， 作为 DNA 输送载体[36]。壳聚糖经过疏水基的改性后，在水溶液中形成了稳定的自聚体，具有 单一的大小分布(160nm)，并与 DNA形成壳聚糖自聚体-DNA复合物，这种 DNA复合物能够输 送 DNA 进入哺乳动物细胞。DNA 复合物在 COS-1 细胞中的转染效率高于单独的 DNA，但低 于市售的 Lipofectamine 试剂，其转染率受阳离子聚合物的化学结构、DNA 复合物的大小及组 成和与细胞间的相互作用等因素的影响。 4结束语 壳聚糖及其衍生物由于良好的物理化学性质和医药功能，在药物研究领域中得到了广泛的 应用。特别通过口服和鼻粘膜等各种给药方式对大分子药物如蛋白质、多肽以及疫苗进行有效 的输送具有良好的效果[37~39]。在基因治疗中作为基因载体使其在药物研究中的应用更加全面， 它们对质粒 DNA 有效的凝聚作用和保护 DNA 不被核酸酶降解以及生物安全性是其它高分子化 合物无法比拟的，特别是可以通过对壳聚糖-DNA 纳米微球制备条件的优化来得到特定尺寸大 小的 DNA 纳米微球。大量的体内和体外实验证明，壳聚糖及其衍生物作为基因载体是一种合 适、有效的高分子材料。当然，壳聚糖作为基因载体的研究还不到 20年，对其与靶细胞的作用 和转染机理目前尚不太清楚，故用于临床还需进一步努力。 参考文献 [1] 卢大儒, 邱信芳, 薛京伦. 生物工程进展, 1996, 16(2): 5~10, 39. [2] 许晓楠, 张红梅, 安利佳. 医学新知杂志, 2001,11(4): 199~201. [3] G Wu, C Wu. J. Biol. Chem., 1987, 262: 4429~4432. [4] J S Remy, B Abdallah, M A Zanta et al. Adv Drug Deliver Rev., 1998, 30: 85~95. [5] M X Tang, C T Redemann, F C Szoka. Bioconjugate Chem.，1996, 7: 703~714. [6] K W Leong, H Q Mao, V L Truong-Le et al. J Control. Release., 1998, 53: 183~193. [7] 瞿礼嘉, 顾红雅, 胡苹 等. 现代生物技术导论. 北京: 高等教育出版社/施普林出版社, 1998: 15~18. [8] G Borchard. Adv Drug Deliv. Rev., 2001, 52: 145~150. [9] R J Mumper, J J Wang, J M Claspell et al. Proc. Int Symp. Control .Release Bioact. Mater., 1995, l 22: 178~179. [9] P Erbacher, S Zou, T Bettinger et al. Pharm Res., 1998, 15: 1332~1339. [11] S C Richardson, H V Kolbe, R Duncan. Int. J. Pharm, 1999, 178: 231~243. [12] M Koping-Hoggard, G Ocklind, H Guan et al. Proc. Int Symp Control. Release Bioact. Mater., 1999, 26: 795~796. [13] T Sato, T Ishii, Y Okahata. Proc. Int. Symp. Control. Release Bioact. Mater., 1999, 26: 803~804. [14] W G Liu, K D Yao. J Control. Rel., 2002, 83: 1~11. [15] L Illum, I Jabbal-Gill, M Hinchcliffe et al. Adv. Drug Deliver. Rev., 2001, 51: 81~96. [16] C W Simon, A Richardson, V J Hanno et al. Int. J Pharm., 1999, 178: 231~243. http://www.hxtb.org 化学通报 2005年 第 68卷 w018 8 [17] C Fiona, R J MacLaughlin. J W Mumper et al. J Control. Release., 1998, 56: 259~272. [18] T Ishii, Y Okahata , T Sato. Biochim. Biophys. Acta, 2001, 1514: 51~64. [19] M Thanou, B I Florea, M Geldof et al. Biomater., 2002, 23: 153~159. [20] J Murata, Y Ohya, T Ouchi. Carbohyd. Polym., 1996, 29(1): 69~74. [21] J Murata,Y Ohya, T Ouchi. Carbohyd. Polym., 1997, 32: 105~109. [22] Y K Park, Y H Park, B A Shin et al. J Control. Release., 2000, 69: 97~108. [23] I K Park, T H Kim, Y H Park et al. J Control. Release., 2001, 76: 349~362. [24] I K Park, J E Ihm, Y H Park et al. J Control Release., 2003, 86: 349~359. [25] S Y Gao, J N Chen, X R Xu et al. Int. J Pharm., 2003, 255: 57~68 [26] K N Janes, P Calvo, M J Alonso. Adv. Drug Deliver. Rev., 2001, 47: 83~97. [27] H Q Mao, K Roy, S M Walsh et al. Proc. Int. Symp Control. Release. Bioact. Mater., 1996, 23: 401~402. [28] K Roy, W Chu, J McGrath et al. Proc. Int. Symp. Control. Release. Bioact. Mater., 1999, 26: 161~162. [29] K Roy, H Q Mao, S K Huang et al. Nat Med (N. Y.), 1999, 5(4): 387~391. [30] K Roy, H Q Mao, K W Leong. Proc. Int. Symp. Control. Release. Bioact. Mater., 1997, 24: 673~674. [31] H Q Mao, K Roy, V L Troung-Le et al. J Control. Release., 2001, 70: 399~421. [32] Z R Cui, R J Mumper. J Control. Release., 2001, 75: 409~419. [33] K Roy, H Q Mao, V L Troung-Le et al. USP: 5972707. [34] 黄伟, 崔光华, 贺俊峰 等. 药学学报, 2002, 37(12): 981~985. [35] T Ouchi, H Nishizawa, Y Ohya. Polymer, 1998, 39(21): 5171~5175. [36] K Y Lee, I C Kwon, Y H Kim et al. J. Control. Release., 1998, 51: 213~220. [37] 曹健, 陆锦芳. 中国医药工业杂志, 2002, 33(7): 353~357. [38] H Takeuchi, H Yamamoto, Y Kawashima. Adv. Drug Deliver. Rev., 2001, 47: 39~54. [39] I M Van der Lubben, J C Verhoef, G Borchard et al. Adv. Drug Deliver. Rev., 2001, 52: 139~144.