土霉素的生产工艺

null土霉素生产工艺流程土霉素生产工艺流程null第一章：绪论 1.1 土霉素化学式及性状 1.2 作用机理 1.3 土霉素的应用 1.4 土霉素的生产null1.1 土霉素化学性质及性状 土霉素(Terramycin)又称地霉素、氧四环素(Oxytetracycline)，化学名：(4s,4аR,5S,5аR,6S,12аS)-N-4-二甲胺基-1,4,4а,5,5а,6,11,12а-八氢,5, 6,10,12,12а-六羟基-6-甲基-1,11-二氧代并四苯-2-甲酰胺，是四环素类抗生素的一种，因结构上含有四并苯基的母核而得名。化学式如下： 本品为灰白色至黄色的结晶粉末，无臭，味苦，熔点是180℃，在空气中性质稳定，在日光下颜色变暗在碱性溶液中易破坏失效。土霉素的盐酸盐为黄色结晶，味苦，熔点190～194℃，有吸湿性，但水分和光线不影响其效价，在室温下长期保存不变质，不失效。盐酸盐易溶于水，溶于甲醇，微溶于无水乙醇，不溶于三氯甲烷和乙醚，在酸性条件下不稳定。添加到饲料中，在室温下保存四个月，效价下降4%～9%，制粒时效价下降5%～7%。 null1.2 作用机理 本品为广谱抑菌剂，能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成，能抑制动物肠道内的有害微生物，激活大肠中有利于营养物质合成的微生物。可使动物肠壁变薄，更有利于营养物质的吸收和利用，从而提高肠道吸收效率。许多立克次体属、支原体属、衣原体属、螺旋体、阿米巴原虫和某些疟原虫也对本品敏感。肠球菌属对其耐药。其他如放线菌属、炭疽杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、梭状芽孢杆菌、奴卡菌属、弧菌、布鲁菌属、弯曲杆菌、耶尔森菌等对本品敏感。null1.3 土霉素的应用 土霉素为四环类抗生素，生产工艺简单、生产成本较低，可作为生产其它新型抗生素的原料。 土霉素价格低廉，可以作为饲料添加剂用于养殖业。实践表明：土霉素用于饲料添加剂，可以改善饲料转化效率，促进畜禽生长，提高畜禽抗疾病能力。 土霉素对多数革兰氏阳性菌(如肺炎球菌，溶血性链球菌，草绿色链球菌以及部分葡萄糖球菌，炭疽杆菌)和革兰氏阴性菌(如大肠杆菌，产气杆菌，破伤风，肺炎杆菌，流感杆菌，百日咳杆菌等)均有抗菌作用。临床上主要用于肺炎、败血症、斑疹、伤寒、淋巴肉芽肿、沙眼及其他细菌性感染等。对伤寒有效，也可用于阿米巴痢疾和阴道滴虫病患者。此外还能抑制立克次体和沙眼病毒及淋巴肉芽肿病毒 。 作为抗生素，上世纪六七十年代时，土霉素曾在抗菌药市场上占重要地位，但伴随着其它多种高效抗生素的诞生与发展，土霉素市场快速走向衰落。目前，土霉素已经极少用于临床了。null1.4 土霉素的生产 土霉素通常由龟裂链丝菌(streptomyces rimosus)发酵得到，目前国内提取工艺一般以草酸(或部分盐酸替代草酸)作酸化剂调节发酵液pH值，利用黄血盐钠和硫酸锌作净化剂生成普鲁士蓝沉淀协同去除Fe3+及高分子杂质，再经122-2树脂脱色，调节pH至4.6，干燥得到土霉素成品[1]。null第二章：工艺流程 2.1 土霉素发酵工艺流程 2.2 土霉素提取生产工艺流程及单 元操作null2.1 土霉素发酵工艺流程 2.1.1 菌种介绍 龟裂链丝菌(streptomyces rimosus)属放线菌，孢子丝初旋至螺旋形。孢子长圆形至柱形，表面光滑。 蔗糖硝酸盐琼脂：气丝白色，斑片状，在边缘。基丝薄，乳脂色，后较丰厚，红褐色至橙色。可溶色素略微黄色。葡糖天冬素琼脂：气丝白色，基丝初乳脂色，后变微褐色至橙褐色。可溶色素微黄色至金色。淀粉琼脂：无气丝。基丝乳脂色，中心褐色。甘油天冬素琼脂(ISP)、无机盐淀粉琼脂(ISP)、酵母精麦芽精琼脂 (ISP)、燕麦粉琼脂(ISP)：气丝白色或淡黄色、淡橙黄色、灰黄粉色。基丝反面灰黄色，在第一和第三种培养基上略加红色(橙黄色至暗橙黄色)。基丝色对pH不敏感。可溶色素迹量黄色，对pH不敏感。营养琼脂：气丝白色或无。基丝少，乳脂色至黄褐色、鼠灰色。可溶色素无或微黄色。葡萄糖酵母精琼脂：气丝初白色，后变鼠灰色。基丝较好，乳脂色至微褐色。可溶色素微黄至金色。马铃薯块：气丝白色至灰色、暗褐色。基丝乳脂色至红褐色。可溶色素黄褐色。 明胶液化慢。牛奶胨化，不凝固。淀粉水解有限。纤维素上不生长。硝酸盐还原。不产生类黑色素、酪氨酸酶和H2S。利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、鼠李糖、肌醇、D-甘露醇；对D-木糖利用可疑；不利用蔗糖、棉子糖。产生对革兰氏阳性和阴性细菌、原虫都有作用的土霉素(oxytetracycline)和抑制丝状真菌、酵母的龟裂杀菌素(rimocidin)。null2.1.2 菌种保藏 菌种的保藏方法有：斜面菌种低温保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷冻干燥法。 斜面菌种低温保藏法：利用低温对微生物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液等，直接放入4～5℃冰箱中。保藏时间一般不超过3个月，到时必须进行移接传代，再放回冰箱。 砂土管保藏法：将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土管，然后接种保藏。若把砂土管放在低温或抽气后密封，效果更佳。此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。保藏期1～10年。 甘油封藏法：向培养好的菌种斜面上，加入灭菌甘油，高出斜面1cm，然后蜡封管口，放入冰箱。该法既可防止培养基水分蒸发，又能使菌种与空气隔绝。保藏期1～2年。 真空冷冻干燥法：是目前比较理想的一种方法。在低于-15℃下，快速将细胞冻结，并保持细胞完整，然后 在真空中使水分升华致干。在此环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异，故可长时间保存，一般为5～10年，最多可达15年之久。此法兼备了 低温、干燥及缺氧几方面条件，使微生物可以保存较长时间，但过程较麻烦，需要一定的设备。null2.1.3 孢子的制备 这是发酵工序的开端，是一个重要环节。抗生素产量和成品质量同菌种性能以及同孢子和种子的情况有密切关系。生产用的孢子需经过纯种和生产能力的检验，符合规定的才能用来制备种子。保藏在砂土管或冷冻干燥管仲的菌种经无菌手续接入又麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.5-36.8℃、50%相对湿度的条件下培养4-5天，挑选菌落正常的孢子作为种子。在孢子制备的过程中，蒸馏水中可适当添加0.005%MgSO4、0.01%KH2PO4及0.015%(NH4)2HPO4，避免水质波动对孢子质量的影响，还可以缩短孢子的成熟期。 2.1.4 种子的制备 种子制备是指孢子接入种子罐后，在罐中繁殖成大量菌丝的过程，其目的是使孢子发芽、繁殖和获得足够数量的菌丝，以便接种到发酵罐当中去。种子制备所使用的培养基及其它工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。种子培养基的成分基本与发酵培养基近似，培养30℃、30小时左右培养液趋于浓厚并转为黄色。pH一般在6.0-6.4时可以移入下一级罐。移入发酵罐时pH>6.0，效价在800u/ml左右。种子罐级数是在指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。土霉素种子制备一般为二级种子罐扩大培养。null2.1.5 发酵培养基介绍 培养基是供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量等。土霉素的发酵培养基由碳源、氮源、无机盐及金属离子、添加前体、消泡剂五部分组成。 碳源的主要作用是：为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分；为合成目的产物提供所需的碳成分。生产上曾以单糖—葡萄糖、双糖—饴糖、及多糖—籼米粉、玉米粉及淀粉的解酶液作为碳源。本设计采用淀粉作为碳源，发酵相对容易控制。 氮源的作用是供应菌体合成氨基酸的原料。主要有机氮源为黄豆粉饼、花生粉饼、蛋白胨、酵母粉、玉米浆等，通常使用黄豆粉饼。无机氮如氨水、硫酸铵等可适量使用。 由于在发酵过程中二氧化碳的不断产生，加上培养基中有很多有机氮源含有蛋白质，因此在发酵罐内会产生大量泡沫，如不严加控制，就会产生发酵液逃液，导致染菌的后果。采用植物油消沫仍旧是个好方法，一方面作为消沫剂，另一方面还可以起到碳源作用，但现在已普遍采用泡敌代替豆油。 无机盐：磷酸盐浓度对放线菌的生长和抗生素的合成影响很大，故应该严格控制磷酸盐的浓度。null2.1.6 灭菌及染菌处理 灭菌指的是用化学或物理的方法杀灭或除去物料及设备中所有的有生命物质的技术或工艺流程。灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象。工业上常用的方法有：干热灭菌、湿热灭菌、化学药剂灭菌、射线灭菌和介质过滤除菌等几种。 在土霉素的生产中，对培养基和发酵罐主要采用的是湿热蒸汽灭菌和空气过滤除菌的方法。 染菌的处理方法： 1. 加强人员操作的检查，各种操作环节； 2. 加强人员劳动纪律、培训及责任心的教育，精心操作，强化管理； 3. 加强车间内环境卫生的处理，定期喷洒消毒剂，特别注意排污口一楼地沟处的清理； 4. 控制合理的空气压力，在不影响生产的情况下尽可能降低风压； 5. 对风机冷却器、加热器定期打压试漏，保证设备完好； 6. 对风机跨线要定期排污，防止积存杂质及灰尘； 7. 操作过程中要注意避免风压急剧波动，要缓慢开关，特别是放罐操作、调风操作及消毒吹扫操作。 null 8. 加强空气过滤器的吹扫、泡点测试、安装、消毒（压力提升至1.2公斤）、降温及预过滤的位置固定操作，注意蒸汽过滤器安装质量（特别是预滤筒）及相关操作事项； 9. 对于消泡剂罐及消泡剂管道要定期打压、消毒，确保无菌、无渗漏，对于隔膜阀垫片要保证完好、耐用，对于小排气阀门要特别注意消毒冷却后的防内漏问； 10. 对染菌罐要加强处理，清洗、碱煮、试漏、去除死角、甲醛熏蒸、过滤器吹扫消毒、蛇管打压等； 11. 定期对移种管道要吹扫、清理、打压试漏，保证移种管道及附属阀门、垫片的严密度及清洁度，注意移种靠罐阀不要堵塞； 12. 对于发酵岗位操作人员注意冲视镜、取样、消沫操作的规范，要注意防止顶罐、逃液现象的发生； 13. 种子罐总空气过滤器要注意定期吹扫、清理； 14. 空气入罐阀两端小辫子要注意操作细节，消毒时要开启，消毒结束后要注意关闭的顺序； 15. 消毒操作过程中要规范操作，消毒过程中要注意各路管道的蒸汽流通情况，消毒结束时要注意各阀门的操作顺序，特别是空气阀的开启时机的把握； 16. 注意平衡好蒸汽的使用，避免重叠作业及蒸汽的大幅度波动； 17. 对空气管道的排污、排水要进行统一规范管理； null 18. 对于连续染菌罐可以考虑处理后稀料考察； 19. 各罐大排气法兰的垫片要大小适中，法兰垫片不要有泄漏及存料现象； 20. 消泡剂罐的单独空气过滤器要制定相应的消毒及消毒记录，定期消毒； 21. 可以考虑空气过滤器吹扫后再进行进罐作业，保证空气过滤器及相应管道、阀门的无菌度； 22. 注意染菌罐压力表的处理，防止压力表中有杂菌存在； 23. 定期对无菌空气进行肉汤跟踪检验； 24. 消毒时注意防止淀粉等原有结块及消不透现象的发生，注意原材料质量，清洗罐时注意罐底存料现象； 25. 各罐灭菌时要注意蛇管内冷却水要彻底排除干净，防止低温死角； 26. 种子罐注意要定期碱煮、甲醛熏蒸，消毒时接种帽处要做排气处理； 无菌室取样时要规范，防止假样； 28. 注意特殊杂菌要做耐热试验； 29. 注意烧碱的质量，防止堵塞碱管道； 30. 注意旋风处不要堵塞； 31. 注意各无菌设备、管道、阀门，不要有渗漏现象； 32. 注意各罐机封处的清洁、严密； 33. 灭菌柜要用好，注意消毒时的温度、压力是否正常，注意消毒时防止蒸汽带水null2.1.7 发酵及参数控制 这一过程的目的主要是为了使微生物分泌大量的抗生素。发酵开始前，有关设备和培养基必须先经过灭菌，后接入种子。接种量一般为20%。发酵周期一般为194小时。发酵全程30-31℃分段培养，通气量为2.0v/v/M。当接种后发酵pH低于6.4时开始通氨，培养20-40小时，每4小时补一次，每次10-15L，控氨水平在45mg/100ml以上。根据发酵液残糖值补入总糖，一般在100小时前残糖控制4.0%-5.0%，100小时-150小时控制3.5%-4.0%，150小时至放罐前6小时控制在3.0%。在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，并隔一段时间取样进行生化和无菌试验，观察代谢变化、抗生素产生情况和有无杂菌污染。null2.2 土霉素提取生产流程及单元操作 2.2.1 发酵液的预处理 土霉素因能和钙、镁等金属离子，某些季铵盐、碱等形成复合物而沉淀，在发酵过程中，这些复合物聚集在菌丝中，而在液体中浓度不高，因此，应对发酵液进行酸化的预处理使之释放出来，以保证沉淀的收率和质量。通常采用草酸作为酸化剂，其去钙较完全，析出的草酸钙还能促进蛋白质的凝结，提高滤液质量，草酸属于弱酸，比盐酸、硫酸等对设备的腐蚀性小。但其价格较贵，并促使差向土霉素等异构物的产生，因此在草酸做酸化剂时，温度必须在15℃以下，且尽量缩短操作时间。通常在考虑土霉素稳定性和成品质量及成本的前提下，pH控制在1.6-1.9。 null2.2.2 发酵液的纯化 发酵液中同时存在着许多有机和无机的杂质，为了进一步提高滤液质量，为直接沉淀创造有利条件，可加入黄血盐进而硫酸锌协同作用除去蛋白质，同时除去铁离子(黄血盐和铁离子生成普鲁士蓝沉淀)，并加入硼砂，以提高滤液质量。 2.2.3 滤液脱色 进一步除去滤液中的色素和有机杂质以提高滤液质量，将滤液通过122-2树脂进行脱色，该树脂在酸性滤液中氢离子不活波，不能发生电离及离子交换作用，但能生成氢键，其生成的氢键能吸附溶液中的带正电的铁离子、色素及其他有机杂质，故能使土霉素滤液的色泽和质量有所提高。树脂在氢氧化钠溶液中又氢型变成纳型，失去氢键的活性，能使其吸附的色素和杂质解离出来，再经酸作用仍能回复活性，可重复使用。现多采用板框式过滤机。null2.2.4 沉淀结晶 经预处理过的滤液加入碱化剂调pH至等电点，使之沉淀继而从滤液中分离。通常使用氨水(含2-3%NaHSO3或Na2CO3及尿素)，既节约成本，又能起到抗氧化脱色作用，效果较好。条件控制为pH4.5-4.6，28-30℃、结晶通常需要2小时。目前通常采用连续结晶法。经旋风分离，离心送至干燥 2.2.5 干燥 物料经粉碎后，通常采用旋风干燥机干燥，并经除尘可得到最终产物。2.3 土霉素生产总工艺流程图2.3 土霉素生产总工艺流程图null第三章：设备选型 null第四章：相关工艺的改进 在结晶工艺中，为缩短结晶时间，提高结晶设备的利用率，通过研究结晶过程中影响晶型的各种因素，改进了发酵液预处理、结晶工艺。结果表明，在控制发酵液酸化pH值1.95-2.05、黄血盐钠加量0.3%、黄血盐钠和硫酸锌配比3：2、结晶温度等条件，找到了一个较为适宜的发酵液预处理和结晶工艺，在结晶时间仅为47min 的情况下，可明显改善土霉素晶型，使晶体粒度分布均匀，产品内在质量得到进一步提高[1]。 在酸化提取工艺中，最佳酸化条件为：pH值控制在1.43左右，黄血盐钠的用量控制在发酵液体积的0. 35%时得到土霉素效价最高，为5102U/g[2]。 目前，也有报道称通过复合诱变(经饥饿培养、52FU、UV、咖啡因复合诱变处理)的方法得到新的菌株，再用含高磷酸盐的培养基定向筛选, 得到高产突变菌株遗传特性稳定，代谢特性优于出发菌株，经57m3发酵罐生产验证, 生产稳定, 低效价罐批减少59.5%，在磷酸盐浓度提高到0.04%～0.05% 时，统计一年的正常罐批平均发酵效价比对照菌株提高5.76%[3] 在脱色吸附的过程中，改变树脂的高径比，可以提高铲平的色泽[4]。null第五章：参考文献 [1].田彩霞, 赵建强. 土霉素结晶工艺改进的研究[J]. 中国抗生素杂志, 2006, 31(3): 178-180 [2].李永丽. 土霉素酸化提取工艺的研究[J]. 内蒙古石油化工, 2009(11): 6-7. [3].边艳青, 李保荣, 石振华, 等. 耐磷酸盐土霉素菌株选育和发酵的研究[J]. 中国抗生素杂志, 2003, 28(8): 456-458. [4].张玉钧, 刘晶, 吕兵, 等. 土霉素提炼工艺的改进[J]. 黑龙江医药, 1995, 8(1): 18-19.null