狐阴道加德纳氏菌共同抗原蛋白免疫活性的研究

狐阴道加德纳氏菌共同抗原蛋白免疫活性的研究 ※ 狐阴道加德纳氏菌共同抗原蛋白免疫活性的研究 闫新华阎喜军王长凤 赵传芳 ()中国农业科学院特产研究所 吉林 132109 摘 要 对狐阴道加德纳氏菌三个血清型的共同抗原蛋白进行免疫印迹试验 ,结果证实 , 4 条 共 同 抗 原 蛋 白 带 中 , 只 有 74. 1 K 蛋 白 We st e r n - blo t 呈 现 阳 性 反 应 , 从 凝 胶 中 提 纯74. 1 KD 蛋白免疫小鼠 ,免疫后 35d 采血分离血清 ,以 DO T - EL ISA 进行检测 ,血清抗体呈现 阳性反应 ,证实 74. 1 K 蛋白能产生免疫应答 。 关键词 狐阴道加德纳氏菌 ;共同抗原蛋白 ; We st e r n - blo t ; 免疫应答 〔1 〕闫新华等以 SD S - PA GE 研究证实 , 狐阴道加德纳氏菌三个血清型有 4 条共同抗原蛋 白带 , 为确定它们的免疫活性及其免疫应答反应 , 进行了此项研究 , 旨在为抗原和疫苗制造选 育的菌株提供更充足的理论依据 , 为今后研究抗狐阴道加德纳氏菌共同抗原蛋白单克隆抗体 奠定理论基础 。 1 材料与方法 1. 1 样品及 SD S - PA GE 电泳 参照文献〔1〕 阴 、阳性血清1. 2 阴性血清 1. 2. 1 :健康兔血清 ,采自体重 2,2. 5 K的健康家兔 。健鼠血清采自体重 18,20g g健康鼠 。 1. 2. 2 阳性血清 :兔抗狐阴道加德纳氏菌 GV F 44 高免血清 ,由本研究室制造 。 1. 3 酶标抗体 羊抗兔 IG - H R P 、羊抗鼠 IG -H R P 医学科学院微生物流行病研究所产品 。使用浓度g g 为 1 ?200 稀释 。 封闭液1. 4 H7. 4 的 PB S + 0. 1 % Twee n - 20 + 10 %脱脂乳 。p 1. 5 洗涤液 H7. 4 的 PB S + 0. 1 % Twee n - 20 。p 1. 6 底物溶液及底物 ( ) 底物选用 3. 3 二氨基联苯二胺盐酸盐 DAB , 溶液用 的 0. 05mol / L 的 Tri s - 盐 H7. 6 p 酸 。 1. 7 免疫佐剂 10 号白油 、司盘 - 85 和吐温 - 85 。 1. 8 We stern - bl ot 样品经 SD S - PA GE 后 , 取下凝胶 , 再利用转移电泳 , 常温下 , 50V 电泳 16h , 将凝胶 ( ) 中蛋白转移到硝酸纤维膜 N C上 , 室温干燥后 , 在 4 ?以 10 %脱脂乳封闭过夜 , 洗涤 3 次 , 加抗 GV F 44 阳性血清覆盖 , 37 ?作用 3h , 洗涤 3 次 ,H R P , 37 ?作用加羊抗兔 IG - g 1. 5h , 洗涤 3 次 , 用 DAB + HO显色 30mi n , 用流水终止反应 , 晾干后进行分析 。2 2 1. 9 共同蛋白的提取 样品经 SD S - PA GE 电泳后 ,取下凝胶浸入 0. 25M Kcl 溶液中显色 ,切取阳性反应的共同 蛋白带 , 将凝胶剪碎 , 装入盛有适量 0. 01MH7. 4 PB S 的透析带中 , 用手揉碎 , 再加入 PB S , 在p 4 ?透析 48h ,以 3000rm 离心 30mi n ,收集上清 ,测定蛋白含量。 p 1. 10 共同蛋白免疫应答测定 用免疫佐剂与提取的蛋白以乳钵研磨制成油包水乳剂 。选取 3 只体重 15,20健康小白g 鼠 ,以递增剂量皮下多点注射 ,每次间隔 5d ,第 7 次免疫后 5d 断颈采血 ,分离血清。 用 Do T - EL ISA 检测血清抗体 。 2 结果 2. 1 We stern - bl ot 结果 样品经 SD S - PA GE 电泳 , 转移到 N C 膜上 , 通过免疫印迹 , 三个血清型的 4 条共同蛋白 带仅 74. 1 KD 蛋白呈阳性反应 。 2. 2 共同蛋白对小白鼠免疫应答结果 用提取蛋白免疫小鼠后 , 以 Do T - EL ISA 检测免疫鼠血清 , 血清在 1 ?5,1 ?40 稀释 , 3只免疫鼠血清均呈强阳性反应 ,对照鼠为阴性 。 3 讨论 用免疫印迹确定了狐阴道加德纳氏菌 3 个血清型的 4 条共同蛋白带中仅 74. 1 KD 蛋白呈阳性反应 ,说明该蛋白有免疫学活性。 提取 74. 1 KD 共同蛋白免疫实验动物小白鼠 , 免疫后 35d 用 Do T - EL ISA 检测 , 血清抗 体呈阳性反应 ,证实该蛋白可产生免疫应答。 〔2 〕 闫新华等用交叉免疫琼脂扩散试验证实 , GV F 三个血清型间产生一条完全融合的蛋白 沉淀线 , 本研究从分子水平进一步证实了这条沉淀线就是 74. 1 KD 蛋白 , 该研究为制备 GV F on of c o mmon St udi mmune a c t iv ita n t ien yyg of Ga r dnerel la of f ox r ote inVaina l is pg Ya n Xi n h ua e t . al Abstra ct We st e r n - bol t wa s w se d to a nal set h ree se ro t e s co m mo n a nt i e n ro t ei n ofy yp gp Ga r d ne rella V a i nali s of fo x , t he re sul t co nf i r me d t ha t o nl 74. 1 KD ro t ei n wa s o si t vegy p p a mo n fo ur co m mo n a nt i e n ro t ei nba n ds , li t t le w hi t e mice wa s i m m u ne d wi t h urif ie dg gp p 74. 1 KD ro t ei n f ro m t he el , t he bloo d wa s collect e d a n d se r u m wa s se ra t e d af t e r 35da sp gp y i m mu niza t io n , EL ISA wa s use d to e xa mi n se r u m a nt i bo d t ha t wa s o si t i ve , t hi s co nf i r me dy p 74. 1 KD ro t ei n ca n ro duce i m m u ne re so n se .p p p ; i m mu ne re2 wor ds Fo x Ga r d ne rella va nali s ; co m mo n a nt i n ro t ei n ; we st e n - blo tieKeggp y so n sep ()上接第 22 页 参 考 文 献 李玉杰等 ,梅花鹿巴氏杆菌病的诊断 ,中国兽医杂志 ,1997 ,3 : 251 张凤翔等 ,鹿猝死症的病因调查 ,中国兽医杂志 ,1997 ,12 : 162 俞乃胜等 ,梅花鹿肠毒血症的细菌学鉴定 ,中国兽医杂志 ,1994 ,10 : 28 3 孙立明等 ,梅花鹿肠毒血症的诊断 ,中国畜禽传染病 ,1992 ,1 : 28 甘肃4 农业大学主编 ,兽医微生物学 ,农业出版社 ,1991 ,262 5 St udon Isola t ion a n d Iden t if ica t ion a n d So me Biol o y gy Cha ra c ter ist ic s of Deer Cl ostr idium Wel c hi i Ya n Xiu n et . alj ( ecial)S In st i t ut e of CAA S ,J ili n 132109 p Abstra ct The st ud o n24 st rai n s of Clo st ri di u m Welc hii i sola t e d f ro m vi sce ra of sudde n y ( ) ( ) 3/ 24we re dea t h dee r sho we d 87. 5 % 21/ 24i sola t io n st rai n s we re se ro t e A a n d 12. 5 % yp se ro t C . B e xa mi na t io n of to xici t ,t he t h ree st rai n s ro duci n st ro n e yp y y p g g to xi n we re sc ree ne d ,t he st ud lai d a fo u n da t io n fo r de velo me nt ofClo st ri di u m Welc hii vacci ne . y p Kewor d Dee r Clo st ri di u m Welc hii ; Isola t io n a n d Ide nt if ica t io n ;Biolo Cha ract e ri st ic sy gy