液态发酵法生产云芝胞内糖肽

叁 塑 液态发酵法生产云芝胞内糖肽 余晓斌 ， 缪 静 胡卫珍 ， 陈 坤 濮文林 1(江南大学生物工程学院，无锡，214036) 2(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡，214036) 3(烟台师范学院生命科学学院，烟台，264025) 4(南京老山药业股份有限公司 南京，211811) 摘 要 通过筛选比较6株云芝菌种，获得液态发酵生产云芝糖肽较佳菌株CV-S和CV-H，经优 化摇瓶发酵，将菌株CV-S放大至30L罐发酵，28*(2发酵4 d，菌丝体干重达24．9g／L，菌丝体破碎 后，超滤浓缩，醇沉干燥后，云芝胞 内糖肽产率达 2．23 g ，糖肽总糖为 55．58％，肽 33．53％，经 HPLC检测其分子质量高于 10ku的有2个组分，分别为742．2和 25．2 ku，所提取的产品，其出峰 时间与品基本一致，总糖、单糖、肽含量符合国家药品标准wS_IxG一021—2002的要求。 关键词 云芝，云芝糖肽，液体发酵 云芝胞内糖肽系自担子菌纲多孔菌科云芝 属真菌的菌丝体中提取的结合蛋白多糖，具有 广泛的药理作用，特别对机体的免疫功能具有 调节和增强作用，是一种有效的免疫增强药，已 成为治疗免疫功能低下者的药物。云芝胞内糖 肽可预防和治疗慢性乙型肝炎、肝硬化等类肝 病，可预防和治疗多种肿瘤疾病如肝癌、乳腺 癌、胃癌、食道癌、大肠癌、头颈部癌、妇癌等类 恶性肿瘤，可降低放、化疗毒副反应，可作为治 疗癌症的辅助药品。此外云芝糖肽还具有镇 痛、镇静、降血糖、抗乙肝病毒、以及提高抗氧化 能力，清除脂质过氧化物(LPO)作用 ．2 J。云 芝胞内糖肽已作为防治癌症的药物，因其疗效 好、无毒性而受到临床医生的青睐。 有关云芝液态发酵有一些文献报道 ．8 J， 但由于云芝糖肽是一个多组分复杂体系，糖肽 的理化性质、生理活性与分子质量和肽含量有 很大关系，如何通过液体发酵获得大量云芝菌 丝体，提取得到含有较高有效成分的产品，特别 是要符合国家药品标准WS--XG-021—2002要 求，无疑是一个十分重要而关键的研究，目 前尚未见文献报道。文中主要通过菌种筛选， 获得适合的菌株 CV—S、CV—H，经培养基优化， 将CV—S扩大至30 L罐发酵液体发酵，提取获 得云芝胞内糖肽，通过高效液相色谱检测，与云 第一作者：博士，副教授。 收稿时间：2004—09—07，改回时间：2004—10—26 芝糖肽标准品比较，并检测其总糖、还原糖、肽 含量等指标。 1 材料与方法 1．1 菌 种 云芝菌种 6株，分别编号 CV—B、CV—D、 CV—H、CV_J、CV—L、CV—S，由本研究室从全国 各地收集、分离并保藏。 1．2 培养基 种子培养基：每升培养基含20 g葡萄糖，3 g蛋白胨，5g麸皮及无机盐等。 发酵培养基：每升培养基含 30 g葡萄糖， 20g豆饼粉，15 g玉米粉，3g蛋白胨，5 g麸皮及 无机盐等。 121℃灭菌25min，冷却，接种，28℃，150r／ min，摇瓶发酵5 d。 1．3 30L发酵罐的发酵条件 30 L全自动不锈钢发酵罐，pH，溶氧 D0 探头为梅特勒公司产品，在线自动检测，由无锡 三海生化工程有限公司制造。接种量 10％、搅 拌转速150～200 r／min、通风0．8 v／v／m、温度 26～28℃、装液量22 L、罐压0．5 kg／em2。 1．4 云芝胞内糖肽的提取 1．4．1 摇瓶培养的胞内糖肽的提取 过滤发酵液获得菌丝体，洗涤2次，用组织 维普资讯 http://www.cqvip.com 捣碎机破壁，90～100℃热水煮沸2，抽提2次， 过滤得滤液，减压浓缩至原体积 1／3，加入3倍 体积乙醇沉淀，过滤干燥得胞内糖肽。 1．4．2 30L发酵罐的胞内糖肽的提取 发酵液一板框过滤一菌丝破壁一热水抽 提一板框过滤一超滤浓缩(膜截流分子质量为 10 ku)一醇沉一干燥 1．5 菌丝体干重 在发酵液内无固形物情况下，采用如下方 法： 取100 mL发酵液过滤，用去离子水洗涤残 渣2次，烘干至恒重，得菌丝体干重(g／L)。 在发酵液有固形物的情况下，参照文献 [9]，稍加修改，测定方法如下：取3 mL稀释N 倍的发酵液，加入3mL 1mol／L HC104溶液，沸 水浴煮沸20min，冷却至室温，5 000 r／min离心 10min，于260 nm波长下测上清液 0lD值，定 为A，同上法测定不含菌体的离心发酵液，019 值为B，则每升发酵液中菌体干重为0．65×N ×(A—B)(g／L)。 1．6 质量指标的测定 云芝糖肽标准品：从中国药品生物制品检 定所购买。 1．6．1 总糖测定 苯酚一硫酸法，按国家药品标准(WS-XG一 021—2002)所提供的方法H J。 1．6．2 还原糖测定 DNS法测定【 。 1．6．3 肽含量测定 国家药品标准(WS-XG一021—2002)所提 供的方法。 1．6．4 分子质量测定【 高效液相色谱，WatersTM 600，凝胶色谱柱 (UltrahudrgelTM Linear 7．8×300 mm)。检测 条件为：进样量20 L，以0．1 mol／L NaN03溶 液为流动相，流速为0．9 mL／min，采用示差折 光检测器。 采用标准分子质量的葡聚糖Dextran，Mw 分别为 4．6，10，70，188，482 ku，用 0．1 mol／L NaNO3溶解并过滤，进样量为20 L，流动相为 0．1 mol／L NaNO 溶液，用GPC软件绘制分子 质量对数(1g Mw)一保留时间(t)的标准曲线， 根据待测样品保留时间，由GPC软件计算各出 峰组分的分子质量。 2 结果与讨论 2．1 不同菌种的筛选结果 对6株云芝菌种，CV—H、CV—D、CV—B、CV— S、CV—J，分别进行了摇瓶培养和云芝胞内糖肽 的提取与检测，虽然这6株菌种所提取获得的 胞内糖肽在总糖、还原糖、肽含量上均符合国家 药品标准 WS-XG一021—2002的要求(总糖≥ 35％、还原糖<10％、肽≥20％)，但经 HPLC 检测，只有菌种CV—S、CV—H所制得的胞内糖 肽与标准品符合(参见图2和 3)，因此选用 CV—S、CV—H进一步试验。 2．2 云芝糖肽标准品与菌种CV．H、CV．LS所 提取胞内糖肽的HPLC检测 用不同分子质量的标准葡聚糖Dextran，进 样检测其保留时间t，用GPC软件绘制分子质 量对数(1gMw)一保留时间(t)的标准曲线，得 到一标准分子量工作曲线，如图1所示，经线性 回归，其方程为 l gMw=13．2—0．471×t，相 关系数为0．996 5，这样通过测定样品的保留时 间，由标准工作曲线所做出的线性方程，可计算 出样品中各组分的分子质量。 10 00 12．00 14．00 16．00 18．00 20．O0 22．00 24 ．00 保留时间／rain 图 1 标准分子质量工作曲线 云芝胞内糖肽标准品、云芝菌CV—S、CV—H 所提取获得的胞内糖肽样品，经 HPLC检测， 其出峰保留时间如图2、3、4所示，根据个组分 的保留时间，由GPC软件计算各出峰组分的分 子质量，如 1所示。 一 般认为只有分子质量在 100 ku J，至少 10 ku以上云芝糖肽组分才可能具有功能性，从 维普资讯 http://www.cqvip.com 图2 云芝糖肽标准品出峰保留时间图谱 图3 菌种CV-S胞内糖肽出峰保留时间图谱 图4 菌种 CV-H云芝糖肽出峰保留时间图谱 表 1 CV．S、CV．H所制备的胞内糖肽与 标准品HPLC图谱比对 图2可以看出，在10 ku以上的有2个组分，即 HPLC图谱中的前 2个峰，一个是 728．9 ku (48) (15．583 min)，一个是 25．2 ku(18．683 rnin)，因 此在所获得的云芝糖肽产品中，主要比对这 2 个峰的保留时间及所占比例。 菌种 CV—H、CV．S所提取获得的胞内糖肽 与标准品的前2个峰的保留时间和分子质量基 本一致，其中CV—H的II峰保留时问与标准品 完全相同，CV—S的峰 I和峰 II保留时间与标 准品基本相同，并且其归一化含量均较高，分别 达14．12％和21．94％，远高于标准品4．42％ 和1．93％。因此选用CV—LS进一步扩大培养 和提取研究。 蛋白多糖在凝胶柱上表现的分子质量与流 动相的盐浓度有关ll ，流动相的盐浓度较小 时，表现出较大的分子质量，流动相的盐浓度较 大时，表现出较小的分子质量。因此采用高效 液相色谱测定的糖肽分子质量是一个相对值， 不是绝对值，但在相同流动相的盐浓度下，通过 比对标准品和样品，仍是进行样品质量鉴别的 有效方法。 2．3 碳源种类及浓度对胞内糖肽的影响 碳源是培养基的最主要成分，是菌体和多 糖肽的骨架。以 2％豆饼粉、0．3％蛋白胨、 0．5％麸皮汁、无机盐为基础培养基组分，分别 在其中加入2％的不同碳源，试验了不同碳源 对菌体生长和胞内糖肽得率的影响，结果如表 2。 表 2 不同碳源对菌体生长和胞内糖肽得率的影响 碳源 木糖 葡萄糖 果糖 蔗糖 乳糖 麦芽糖 16．87 15培6 16．23 16．856 15．94 15．435 o．564 o．563 o．489 o．517 o．680 o．669 菌体干重／g·LI1 胞内糖肽得率／g·L 乳糖、麦芽糖的胞内糖肽得率最高，木糖、 葡萄糖次之；木糖和蔗糖对菌体的生长最有利， 果糖、乳糖、葡萄糖次之，但以果糖为碳源时，菌 体生长较好，糖肽得率最低。五碳糖——木糖 所产生的多糖肽，与其他糖所合成的多糖肽在 结构与功能上有否差异。 考虑到规模化生产原料的易得性及价格因素， 以葡萄糖为碳源，试验不同葡萄糖浓度对胞内 糖肽得率及总糖、肽含量的影响。 维普资讯 http://www.cqvip.com 表3 不同浓度的葡萄糖对胞内糖肽合成的影响 从表3可见，增加葡萄糖浓度，有利于胞内 糖肽总糖含量的提高，但培养基中葡萄糖浓度 从3％提高到4％，肽含量略有下降，胞内糖肽 得率明显下降，葡萄糖浓度过高并不利于胞内 糖肽的合成。 以葡萄糖为单一碳源的培养基，其菌体易 结菌球，菌球较大时影响菌体生长和物质交换， 试验中发现，向培养基中添加一定量的玉米粉 可改善菌球的形成，菌球明显变小，有利于菌丝 体生长和代谢过程中的物质交换，同时菌丝体 量可得到进一步提高，其结果见表4。 表4 葡萄糖与玉米粉复合对云芝生长和胞内糖肽得率的影响 用稀碘液检测，发酵液中无残留淀粉，可见 添加玉米粉可明显提高菌体量，并随玉米粉添 加量的增加而增加，当玉米粉由1．5％提高到 2％，菌体生长略微提高，但胞内糖肽得率略为 降，因此采用3％葡萄糖和1．5％玉米粉作为复 合碳源较佳。 国家药品标准中，对云芝胞内糖肽要求总 糖≥35％，肽含量≥20％，因此培养基的碳氮组 成及配比十分关键，即要保证总糖含量符合要 求，又要保证肽含量，因此碳氮比要平衡。经多 次试验优化后，确定了3％葡萄糖，1．5％玉米 粉，2％豆饼粉和0．5％麸皮为主要成分的培养 基配方，即1．2中的培养基配方。 2．4 30 L发酵罐的扩大培养 以菌种CV—S为种子，进行30 L罐发酵， 其发酵过程曲线如图5所示。 由图5可见，发酵25 h左右，菌丝体开始 进入对数生长期，溶氧开始急剧下降，还原糖也 开始显著下降，在发酵20～70 h左右菌体处于 对数生长期，发酵至70 h菌丝体干重达到最大 24．9g／L，之后菌体量略微降低。 发酵至50 h左右，由于菌丝体大量生长， 菌体代谢旺盛，同时培养液变得十分粘稠，溶氧 D0维持在一个较低，并一直维持到发酵结束， 今后可考虑通过提高转速和加大通风量来改善 溶氧水平。发酵起始pH为5．93，培养5 h，pH 略微回升到5．96，之后pH持续下降，到60h降 到最低(4．54)，70h后 pH开始缓慢回升，至发 酵终止4．85。 0 1ll 2ll 30 40 50 60 70 80 90 100 发酵时间，ll — ◆一 pH—△一 菌体量(g,／L) — ■一 DD(％)—*一 还原糖 (mg／mL) 一 ∞ 暑 絮 图5 30 L罐云芝CV—S液体发酵过程曲线 根据还原糖不再下降以及 pH回升的情 况，终止发酵，对发酵液进行过滤，分别对发酵 清液和菌丝体进行提取，获得胞外多糖和胞内 糖肽，并进行检测，结果如表5所示。 表 5 30L罐发酵所提取产品的质量检测数据 检测指标 检测结果 由表5可见，所提取制得的云芝胞内糖肽， 总糖≥35％(以葡萄糖计)，单糖<10％，肽≥ (49) 维普资讯 http://www.cqvip.com 20％，并经江苏省药物研究所检测，其 HPLC g／L胞外粗多糖，胞外多糖其功能性有待进一 图谱与标准品一致，符合国家药品标准 ws一 步研究。 XG一021—2002要求。此外进行了 10批次的上 参 考 文 献 罐发酵，所提取获得的胞内糖肽均符合要求，表 明此发酵工艺可靠。 1邹巧根，朱 玲．云芝糖肽的研究进展[J]．中成 药，2003，25(7)：578～580 3 结 论 2鲁 ~ 晓 IJi]i 燕 ,19 ’ 9 孟 9 凡 ,2( 振3)。 ： 云 148 芝 -- 糖 1笔药理作用进展⋯·中国 ㈩ 通过筛 H ⋯ PLC 、 ， 苎 篓 嚣 菌CV—H、CV—S符合生产要求，其提取获得的 2⋯000～ , 31(1⋯2) ： ‘ 5 54 ⋯ 。。 产品符合国家药品标准wS—xG一021—2002的 4 国家药品标准WS-XG一021—2002 要求。 曼三‘0L ： i i．c aci d。rcehg emnt，fo r9 d9e，- (2)以3％葡萄糖，1．5％玉米粉，2％豆饼 31：426～428 茎墨 雯差-配 ： 釜 6 Ngy T B h． dAd re v iew。 o f rhe s ea rc h odn ， spPro e in-mbou nhd 胞内糖肽的合成 ，碳源浓度过高，胞内糖肽得率 o0m CD z ：一 ∞ ，：Ge Ph ，1998， 反而下降，不利于胞内糖肽的合成。 30(1)：1--4 (3)CV—Ls经30L发酵罐扩大培养，28℃ 7 轰 曩 。] 蓦 发酵液体培养 4 d，菌丝体干重达24．9 g／L，菌 1998．24(3)：65--68 兰竺 !要．，譬超滤浓缩， ， 8 篙 霎 内糖肽产率达 2．23 g／L，总糖为 55．58％，肽 ⋯lq--⋯21⋯ ⋯ 。。⋯ ⋯ 。～‘’。 33．53％，经 HPLC检测其有效成分的分子质 9 Yasushi Morikawa．ngric Biol Chem，1985，49(6)： 量分别为742·2和25·2ku，其归一化含量分别 1o 8 张 8 志 -- 5 花 97 ．云芝糖肽在高效液相色谱凝胶柱上色谱 为 8．77％和 28．62％，高于标准品4．42％和 行为的研究[J]．色谱，1997，15(2)：150～152 1．94％。在获得胞内糖肽的同时，可获得7．85 Production of Coriolus versicolor P0lysacchar0peptide by Submerged Fermentation Yu Xiaobin ，z Miao Jing HU Weizhen ’z Chen Kun4 PU Wenlin4 1(School of Biotechnology，Southern Yangtze University，Wuxi，214036)2(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Southern Yangtze University，Wuxi，21 4036)3(School of Life ABSTRACT By comparison of six different Coriolus versicolor strains．strain CV—H was selected for polysaccharopeptide production by submerged fermentation．After optimization of shake—flask culture， po1ysaccharopeptide production was scale—up to 30 1iter fermentor．Maximal dry mycelium weight was 24．9 g／L after cultivation for 4 days at 28℃ ．Intracellular polysaccharopeptide was extracted by crash— ing mycelit，m，ultra—filtration concentration，ethanol precipitation and dehydration．The yield of polysaccharopeptide was 2．23 g／L，total sugar content was 55．58％ ，and peptide content was 33．53％．High Performance Liquid Chromatography(HPLC，UhrahudrgelTM Linear 7．8 X 300 mm columns)was used in the fraction and molecular weight(Mw)estimation of polysaccharopeptide．Two components with molecular weight more than 1 0 ku were found and their molecular weights are 742．2 ku and 25．2 ku respectively．HPLC retention time of extracted polysaccharopeptide was consistent with that of standard．Total sugar content，reducing sugar content and peptide content of extracted polysaccharopeptide were in accordance with China medicine standard WX—XG一021—2002． Key words Coriolus versicolor，Coriolus versicolor polysaccharopeptide，submerged fermentation (50) 维普资讯 http://www.cqvip.com