腊八蒜绿变色素的分离提取

塑塑堑血 丝 —————————————一 腊八蒜绿变色素的分离提取 赵晓丹 ， 傅达奇 王 萍 胡小松 1(中国农业大学食品学院，北京，100083)2(东北林业大学林学院，哈尔滨，150040) 摘 要 通过试验初步确定了提取分离大蒜绿变色素的方法：体积分数 75％乙醇提取绿变色素， 色素经弱阳离子交换树脂CG一50，sephadexLH-20柱层析分离，得到了构成绿变色素的蓝色素和黄 色素2条色带，两者的最大吸收波长分别为590nm和440nm。通过试验证明了黄色素为蓝色素转 化而来。 关键词 大蒜，绿变，色素，分离 在大蒜加工过程中，常常会发生蒜泥绿变 的现象，影响了产品品质，中国传统食品腊八蒜 也存在绿变的现象，因此研究蒜的绿变现象有 很大的意义。有关蒜的绿变的研究在国外从 1950 1960年代已经开始，Imai⋯等通过宏观 的化学实验认为P ，alliin(ACs0)和大蒜 中的蒜酶参与了色素形成；我国江英 J等也通 过化学实验研究得到类似结论，同时认为氨基 酸和羰基化合物也可能参与了反应，提出了可 能的反应机理。 现有的研究主要是通过化学方法探讨其绿 变机理，对绿变物质尚未明晰。由目前的研究 结论可知，蒜中绿变物质形成可能有诸如alliin 等具有活性的物质参与。蒜泥绿变可产生较大 量的绿变色素，如能对其分离将有可能找到一 种新的天然色素来源。 本文以分离提取绿变色素为出发点，通过 试验初步确立了蒜中的绿变物质的提取分离方 法，得到了初步纯化的色素，为今后进一步研究 其理化性质和生理活性，阐明其结构奠定了基 础。 1 材料与方法 1．1 试验材料及仪器 腊八蒜：陈蒜用5％醋酸腌制，室温避光存 放约10d。试剂：甲醇，乙醇，冰醋酸，正丁醇， 乙酸乙酯，盐酸，丙酮等均为纯，来源于北 第一作者：博士研究生生，讲师(胡小松教授为通讯作者)。 收稿时间：2004—06—30，改回时间：2004—07—30 京化学试剂厂；硅胶200～300目，薄层层析硅 胶板(5×10)mm(均为青岛海洋化工厂生产)； 弱酸性阳离子交换树脂 CG一50(Sigma公司)； SephadexLH-20(Phamacia公司)仪器：自动层 析装置(Bio-rad公司)，752紫外一可见分光光度 计，超纯水机。 1．2 试验方法 1．2．1 色素的提取 将腌好的呈蓝绿色的蒜用组织捣碎机捣 碎，冻干，磨碎过100目筛。分别用水，5％醋酸 溶液，体积分数为95％、75％、60％乙醇溶液， 体积分数80％、60％丙酮，乙酸乙酯进行提取， 料水比(g：mE)1：3，时间均为24h，测量提取液 在590nm的吸光度 J，确定提取溶剂。 1．2．2 色素极性的初步判定 将色素的乙醇提取液浓缩除去乙醇后依次 用2倍体积乙醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，检测 萃取液的A59omⅡ，初步判定色素极性。 1．2．3 分离介质的选择 根据色素的极性，选定几种分离介质，考察 其对色素的吸附分离效果，几种分离介质为大 孔树脂SIPI一40，聚丙烯酰胺，弱阳离子交换树 脂 CG-50，硅胶，sephadexLH一20。经预试验选 出弱阳离子交换树脂CG一50，sephadexLH-20作 为分离介质，确定分离条件。由于有关大蒜绿 变色素的分离未见有报道，因此文中分离介质 的初步选择及分离条件选择借鉴性质相似的物 (129) 维普资讯 http://www.cqvip.com 质的分离方法 J。 1．2．4 色素的分离纯化 取1 kg腊八蒜冻干粉，用体积分数75％乙 醇以1：3(g：mL)的料水比浸提2次。合并浸 提液，过滤，真空旋转蒸发去乙醇至浓缩液体积 为800mL左右，将浓缩液用乙酸乙酯萃取(体 积比1：1)2次，取下层水层，真空浓缩去乙酸乙 酯。将浓缩液上 CG-50柱[(20×2)ClTI]，用 10％的醋酸溶液淋洗4～5倍柱体积，后用乙醇 醋酸混合溶液[ (乙醇)：V(醋酸)：V(水)= 30：5：65]洗脱，流速 1 mL／rain，得洗脱液200 mL，为组分 A。再用 HCI酸化的无水乙醇 (HCI终浓度为0．2％)洗脱，流速1 mL／min，得 洗脱液100mL，为组分B。收集2部分洗脱液， 分别将其真空浓缩，冻干，得到色素粗提物 A 2．3g，B 1．7g，一7012保存待用。将A，B各1 g 分别用体积分数50％甲醇溶解，配制成0．5g／ mL的色素样液各2 mL，分别经sephadexLH一20 柱[(50×2)cm]层析，均以体积分数50％甲醇 为流动相，A可得黄色色带a，B可得蓝色色带 b，将a，b色带分别进行紫外一可见光谱扫描。 色素的薄层层析：色带A、a、B、b进行薄层 层析，考察分离效果。层析介质为硅胶GF254， 展开剂为BAW(正丁醇：醋酸：水的体积比为4 ：1：5)。紫外及碘蒸气显色。 2 试验结果与分析 2．1 提取溶剂确定 表1 不同提取溶剂的提取效果比较 提取溶剂 A590 5％醋酸溶液 体积分散 95％乙醇 体积分数75％乙醇 体积分数60％乙醇 丙 酮 体积分数80％丙酮 体积分数6O％丙酮 乙酸乙酯 正丁醇 由表1可知，水、醋酸等极性较高的溶剂和 非极性溶剂乙酸乙酯对色素的提取效果均不 佳，丙酮的提取效率稍好但不及乙醇。较高体 积分数的乙醇对色素的提取效果较好，而当乙 醇体积分数大于90％时，很多非极性物质也会 被提取出来，不利于后面的分离，因此选用 75％乙醇作为提取溶剂。 2．2 色素极性判定 表 2 不同极性溶剂萃取色素结果比较 由表2可见，在正丁醇一水萃取体系中，色 素大量富集于正丁醇相中，可认为色素属中等 极性物质，可参考中等极性物质的分离方法进 行尝试。 2．3 色素分离纯化 试验过程中发现，色素对热较为敏感，因此 直接将浓缩液通过CG-50柱，对色素进行富集 分离。由于CG一50是离子交换树脂，对物质的 吸附选择性较强，因此经酸液淋洗后可除去大 部分杂质。用乙醇醋酸混合溶液洗脱，流出液 为黄色，定为组分 A。用 HCI酸化的无水乙醇 洗脱，流出液为蓝绿色，定为组分 B。将 A，B 再经SephadexLH一20分离，A在柱上呈现一条 黄色带，B在柱上呈现一条很明显的蓝色带，在 其上方有一条较弱的黄色带，这一色带与A在 SephadexLH-20呈现的色带迁移率近似，且微 弱，可能为A组分在CG一50柱上未被完全洗脱 残余的部分。分别收集各色带部分的洗脱液， 其可见光谱扫描结果如图1所示。 图1是色素的乙醇提取液，蓝色素及黄色 素的可见光吸收光谱对比。大蒜绿变色素经过 分离后可得到黄色和蓝色两种色素。由图1可 见黄色素在 440 nm处有最大吸收，蓝色素在 590 nm处有最大吸收，原色素提取物在可见光 范围也是在这2个波长处有明显吸收。可见大 蒜绿变色素是由黄色素和蓝色素两部分组成 的。同时在腊八蒜腌制过程中，可观察到蒜最 初呈现的是蓝色，而后渐渐变绿，经过1～2个 月在室温下存放的腊八蒜最后变为黄色，所以 腊八蒜中的色素形成可能如下：先形成蓝色素， 3 8 5 4 0 7 9 9 4 5 3 8 4 1 7 O 2 6 " ∞ 订 加 ¨ 0 1 1 0 0 0 O 0 1 维普资讯 http://www.cqvip.com 1．1 1．0 09 — 0．8 1 0．7 0．6 0．5 0．4 0．3 0．2 0．1 0．0 一 《 一 芸 4OO 450 500 550 6OO 650 700 波长，m 图1 三种色素提取物可见光吸收光谱 4OO 450 500 550 6OO 6．50 700 波 图2 蓝色素放置后吸收光谱变化 蓝色素逐渐转化为黄色素，2种色素混合使腊 八蒜呈现绿色。将纯化后的蓝色素甲醇水溶液 在室温放置，每隔5 d进行可见光波长扫描，其 变化见图2，与假设相吻合。 硅胶GF25 薄层层析结果显示分离得到的 色素a，b只呈现一个斑点，可以认为达到了初 步纯化的目的。 3 结 论 以体积分数75％的乙醇溶液为提取溶剂， 以弱阳离子交换树脂 CG一50及sephadexLH一20 为层析介质进行柱层析分离，确立了分离条件。 色素经分离后，得到黄色和蓝色2条色带，对比 两者在可见光范围的最大吸收波长与色素粗提 液的最大吸收波长，可以认为腊八蒜呈现的绿 色是由蓝色和黄色2种色素共同作用的结果， 两种色素的最大吸收波长分别为440 nm和 590nm。通过测定蓝色素的吸收光谱变化，初 步证实了腊八蒜中色素的变化过程：腊八蒜中 最初形成的为蓝色素，蓝色素不稳定逐渐转化 为黄色素，两者共存使蒜呈现绿色，最后蓝色素 全部转化为黄色素。 参 考 文 献 1 Imai S，Akita K，Tomotake M et a1．Blue pigment formation from onion and garlic[c]．IFT Annual Meeting，1996 2 江 英，胡小松，廖小军等 ．蒜泥绿变机理的研究 [J]．中国食品学报 ．2003，1：41～47 3 Lukes T M．Factors governing the greening of garlic puree[J J．Food Sci，1986，5I：1 577 4 洪筱坤译 ．层析理论与应用[M]．上海：上海科学 技术出版社，1981 5 彭军鹏，陈 浩，乔艳秋等 ．大蒜中两种新的甾体 皂甙成分及其对血液凝聚性的影响[J]．药学学报， 1996，31(8)：607～612 6 刘绣华，陈伯森，汪汉青 ．皂甙分离和结构鉴定研 究进展[J]．化学研究，1997(8)，3：28--34 7 Torgils Fossen，Yvind M An dersen．An thocyanins from red onion，allium cepa，with novel aglycone[J]． Phytoehemistry 62(2003)：1217～1220 Isolation of Green Pigment in Laba Garlic Zhao Xiaodan ，z Fu Daqi Wang Ping2 Hu Xiaosong I(College of Food Science and Nutrition，China Agriculture University，Beijing，100083) 2(College of Forest Science，Northeast Forest University，Harbin，150040) ABSTRACT A method for isolating the green pigment in greening garlic was developed．The pig— ment was extracted with 75％ ethanol and isolated by column chromatography with Amberlite CG-50 and Sephadex LH一20．The green pigment was separated into blue pigment and yellow pigm ent，which showed a maximum absorbance at 590 nm and 440nm respectively．The experiments also demonstrated that the yellow pigm ent was transformed from the blue pigment． Key words garlic，greening，pigment，isolation 9 8 7 6 5 4 3 2 l 0 维普资讯 http://www.cqvip.com