RNA 病毒感染性克隆的构建原理及应用[J]

RNA 病毒感染性克隆的构建原理及应用[J] RNA病毒感染性克隆的构建原理及应用 2003-9-30 刘光清 刘在新 谢庆阁 (中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点开放实验室，兰 州 730046) 摘要:构建RNA病毒感染性克隆是对RNA病毒实施反向遗传操作技术的前提和基础，本文综述了RNA病毒感染性克隆的构建原理、方法和应用。 关键词:RNA病毒;感染性克隆;反向遗传学 中图分类号:Q52 重组DNA技术使得人们能够在RNA分子水平上对病毒基因组进行修饰与分析，从而对基因组的结构与功能有了进一步的认识。但非逆转录RNA病毒的复制周期并不经历DNA阶段，在DNA分子水平上对RNA病毒基因组进行研究似乎不大可能，RNA病毒感染性克隆的成功构建解决了这一 [1]难，首先得到的是Qβ噬菌体的感染性克隆。虽然感染性克隆对RNA分子的化学修饰是在体外RNA的复制过程中进行的，并且RNA的突变范围受到限制，但作为研究RNA病毒的一种强有力的工具，它仍有显著的优越性，特别是在定点突变方面，使得人们能按照自己的意愿来实施突变。为研究RNA病毒的基因结构、基因功能、基因重组甚至病毒与宿主细胞的相互作用等提供了崭新的途径。 1(感染性克隆构建的策略 1(1 构建全长cDNA 正确构建全长cDNA是获得感染性克隆的关键。虽然有报道称从非全长cDNA序列也可以得到感染性转录物，但大多数RNA病毒感染性克隆的获得仍须依赖于全长cDNA的构建。基因组较小的RNA病毒容易获得全长cDNA序列，在体外也容易获得感染性转录物，但是对于基因组较大的RNA病毒，这一过程就变的比较困难。首先是难以获得真实的cDNA序列，因为随着RNA序列的延长，RT-PCR的保真性也成比例的下降，而RNA病毒的准种特性更加剧了这一困难;其次，长的RNA序列更有可能含有毒性序列，这将使质粒中的cDNA序列更加不稳定;第三，难以找到合适的能够容纳较大外源基因的载体。 第一个难题通过改进RT-PCR系统可以克服，高保真反转录酶和DNA聚合酶的应用极大地降低了RT-PCR过程中可能出现的差错率;第二个问题比较麻烦，因为宿主菌难以适应具有毒性序列的外源基因，而且细菌具有主动选择特定病毒序列的能力，因此所克隆到的序列不具有随机性，不能代大多数的RNA准种序列。为了避免毒性序列对宿主菌的影响，可以先将病毒(如黄病毒)的RNA序列分成若干段段分别克隆到载体上，在进行转录时再将其连接成全长cDNA序列，这样毒性序列在细菌中的传 [2]代就得以避免。第三个问题通过使用不同的载体系统可以部分解决，如使用细菌人工染色体(BAC)可以成功的克隆长达150kb的单纯疱疹病毒[3]。 长期以来，小RNA病毒属的心病毒和口疮病毒感染性克隆难以构建，其原因在于这些病毒的基因组中含有特殊的poly(C)序列，该结构对病毒的感染性有一定的影响，但是通过常规RT-PCR方法难以得到该序列。目前，有两种策略可以克服这一困难，其一是用人工合成的方法模拟 [4]poly(C)序列，将其插入到cDNA序列中;其二是利用末端转移酶在病毒 [5]基因组S片段的3’端加上poly(C)结构。通过以上方法，已成功得到了脑心肌炎病毒、口蹄疫病毒、门戈病毒等的感染性克隆。 还有些RNA病毒具有poly(A)尾巴，该结构不仅具有稳定RNA基因组结构的功能，而且对维持其感染性也有一定的作用，不同的病毒对poly(A)的长度有不同的要求，但基本上都要求A残基的数目有一定的阈值，当低于阈值时转录物RNA的稳定性和感染性都将受到影响。所以构建全长cDNA时要确保得到合理长度的poly(A)。 1(2 感染性转录物的产生 有两种方法可以得到感染性克隆。 1(2(1 体内转录 即机械导入含有病毒cDNA的表达质粒，使之在体内进行转录与复制得到具有感染性的转录物。关于体内生成感染性RNAs的机理目前还不太清楚，人们推测可能是cDNA以某种方式运输到细胞核， [6]在核内被DNA依赖性RNA聚合酶转录成RNAs。通过这种途径得到的感染性克隆具有以下优点:(1)所获得的感染性RNA比较稳定，不易降解，且可以在体内大量复制;(2)避免了体外转录过程，对那些在体外难以获得高产量感染性RNA的病毒来说是一种理想的方法;(3)不需要价格昂贵的试剂，如帽子结构类似物、体外转录系统等即可得到感染性RNAs;(4)病毒基因组的表达很大程度上不再依赖于病毒的复制过程，这一点对研究那些不能在细胞复制的突变体病毒RNAs所表达的蛋白质及其定位很有用。 1(2(2 体外转录 在这种情况下，选择合适的启动子十分重要，因为这将直接影响体外转录物的产量。目前常用的启动子主要有T7启动子和SP6启动子。有三种方法可以将启动子与病毒cDNA序列嵌合在一起。(1)使用通用转录载体，在距离启动子序列最近的地方限制性酶切位点以插入病毒cDNA序列，这类载体有Ppml,λPm、Phst70,SP6、pCa35J,35S等。(2)将外源cDNA序列克隆到含有启动子的载体上以后，通过一定的方法缺失启动子与病毒cDNA之间的冗余序列。(3)在合成病毒cDNA的过程中通过PCR反应在病毒cDNA序列的5’端引人合适的启动子序列，然后将它们一起克隆到表达载体中。 体外转录还需要解决能否正确终止转录的问题，以免转录物含有非病毒的核苷酸序列，影响转录物的感染性。对此，可在全长cDNA的3’末端加上一个特异的限制性酶切位点，在体外转录时先将重组质粒线性化，再进行转录过程，可使转录正确终止。 1(3 感染性克隆的产生与鉴定 虽然有研究者将转录物RNA直接导入体内可以验证其感染性，但大多数研究者还是偏向于采用转染敏感细胞系来确定RNA转录物的感染性。转染RNA的方法主要有DEAE、脂转染和电激法等。转染细胞后可以通过细胞病变、蚀斑-免疫染色斑以及其他一些特异性指标来判断转录物的感染性。为要避免假阳性的产生:在转染时还要设阳性和阴性对照，并在转录前要用DNA和RNA酶处理样品:初步检测以后有必要进一步分析研究感染性克隆的一些生物学特性，如 在宿主细胞中的表达、复制情况，对实验动物的致病性、宿主谱的变化等，在进行这些研究的同时要与其祖代毒性做比较分析。 2(影响感染性的不利因素 2(1 转录物异质性的影响 这是由于在体外转录过程中并非得到的RNA转录物都是全长的，而是由各种长度的RNAs构成的一个类群，该转录类群在宿主细胞中进行复制时，不完整的没有复制能力的转录物与完整转录物会竞相与宿主发生作用，从而影响转录物的感染性。 2(2 基因突变对转录物感染性的影响 在构建全长cDNA以及产生转录物RNA的过程中，由于DNA聚合酶和RNA聚合酶的不忠实性都有可能导致核苷酸的错配，基因突变的发生就难以避免，而且基因组的序列越长，发生点突变的几率越大。这些点突变有可能对转录物的感染性产生一定影响，已有的资料表明，这种影响有可能是负向的，即转录物的感 [7]染性降低或丧失;也有可能是正向的即转录物的感染性增强，这种情况很少。 2(3 非病毒核苷酸的影响 比较一致的观点是5’端的非病毒核苷酸对转录物感染性的影响较大，可使转录物的感染性降低甚至丧失，但有研究也表明，当在cDNA的5’端增加一个非病毒的核苷酸(如G)时有可 [8]能增加转录物的感染性。与植物病毒相比，动物病毒转录物的感染性受5’端非病毒核苷酸的影响较小。已经构建成功的几种动物病毒的感染性克隆5’端存在一定的非病毒核苷酸时仍具有感染性。3’端的非病毒核苷酸序列少于7个核苷酸时对转录物的感染性影响较小。如果再长就有 [9]可能导致转录物感染性的降低或丧失。Sarnow等研究了3’端非病毒核苷酸序列对脊髓灰质炎病毒转录物感染性的影响，其研究结果表明在病毒基因组poly(A)尾下游存在4个多余的核苷酸时，转录物的感染性并不受影响，但是当存在17个C碱基时可以引起转录物感染性的下降。但也 [10]有相反的结论，Dzianott等的研究表明BMV转录物的3’端含有19个非病毒核苷酸时其感染性比含有6-7个非病毒核苷酸时的感染性要高，其原因可能是较长的冗余序列在体内可能会更好的保护转录物对抗核酸酶的消化作用。 2(4 帽子结构的影响 有些RNA病毒基因组5’端具有帽子结构，如果在人工转录物RNAs的5’端加上该结构，将能增加其稳定性，同时也保证了转录物感染性，如果缺少该结构，转录物就可能没有感染性或感染性很低。例如在构建PRRSV的感染性克隆时，由于在体外转录过程中[11]添加了帽子结构类似物，体外转录物就获得了较好的感染性。 3(感染性克隆的应用 3(1 病毒基因功能的研究 可以采取基因敲除、插入、置换、或构建嵌和病毒等方法对病毒基因功能进行研究。例如通过基因突变证明了 [12]FMDV外壳蛋白上的RGD序列在病毒吸附过程中的重要作用;应用基因置换方法确证了在DEN2 3’端非编码区具有与病毒复制功能相关的基序[13][14];Dobbe等通过构建嵌合病毒的方法对马动脉炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的GP5和M蛋白转运到高尔基复合体上的过程及其在病毒装配中的作用进行了研究，确认了GP5蛋白在受体识别中的作用; [15]Kanno等在构建SVDV强、弱毒株感染性克隆的基础上，通过制备一系列重组病毒和定点突变病毒，确定了SVDV中决定毒力的基因。 3(2 新型疫苗的研究 主要有以下几个方面，(1)通过对毒力决定性基因的缺失或修饰得到一种无毒或减毒毒株，以此制备新型的减毒活疫苗。如缺失FMDV细胞吸附位点的编码序列或前导蛋白酶的编码序列可得到FMD的减毒毒株，将其作成减毒活疫苗免疫动物可获得较好的免疫效[16]果。(2)研制嵌合疫苗，开发多价疫苗，例如在DEN4感染性克隆的基础上构建型间嵌合体，表达DENl、DEN2、DEN3的结构蛋白，以此为基础 [17]做成多价疫苗，能为实验动物提供保护作用。(3)新型核酸疫苗即RNA疫苗，RNA疫苗克服了DNA疫苗可能引起细胞转化的潜在危险，也解决了DNA疫苗进入细胞核困难、表达量低下的缺陷。因此RNA疫苗是一类很具希望的新型疫苗。 3(3 利用感染性克隆技术将RNA病毒改造咸载体 与传统活病毒载体(如腺病毒、痘病毒等)相比，以RNA病毒(如甲病毒)作为载体具有如下优点:(1)基因组较小利于操作。(2)多数RNA病毒只在细胞浆中进行增殖和转录，避免了宿主系统的核剪切作用，能高效表达免疫原。(3)外源基因的表达不受宿主的控制。(4)RNA病毒做载体不会发生与宿主染色体的整和现象。(5)有些病毒载体自身的结构蛋白较少，引起的载体免疫反应较低。(6)宿主谱广，几乎适用于所有的哺乳动物和禽类。目前小RNA病毒、黄病毒、甲病毒等正链RNA病毒都尝试了作为载体表达异源病毒蛋白的研究并取得了重大进展。例如以黄热病毒骨架表达乙型肝炎病毒prM和E蛋白，可用作预防黄热和乙脑的二联疫苗，也可以表达DEN2的 [18]prM和E蛋白，能给实验动物提供保护作用。 4(结语 RNA病毒感染性克隆的成功构建为我们研究RNA病毒提供了有力的工具，但在使用感染性克隆的同时我们要注意以下问题:(1)感染性克隆与其母本毒一样，也有感染性，甚至感染性更强;(2)感染性克隆是通过人工手段得到的模拟病毒，和野生型病毒一样，在复制周期中它也会发生突变或重组;(3)感染性克隆在动物体内的命运不一定与其亲本病毒一样，有可能朝不同的方向变异发展，所引发的致病作用未必一致。 参 考 文 献 [1] Taniguchi T et al(Nature，1978，274:223,228 [2] Sumiyoshi H et al(J Virol，1992，66:5425,5431 [3] Messerl M et al(Proc Natl Acad Sci USA，1997，94:14759,14763 [4] Rider E et al(J Viol，1993，67:5139—5145 [5] Zibert A et al(J Viol，1990，64:2467,2473 [6] Recaniello VR et al(Science，1981，214:916,919 [7] van der Werf S et al(Proc Natl Acad Sci USA，1986，83:2330,2334 [8] Klump WM et al(J viol，1990，64:1573,1583 [9] Sarnow P(J viol，1989，63:467,470 [10] Dzianott AM et al(Proc Natl Sci USA，1989，86:4823,4827 [11] Meulewberg JJM et al(J viol，1998，64:1573,1583 [12] Leippert M et al(J viol，1997，1046,1057 [13] Zeng L et al(J viol，1998，72:7510,7522 [14] Dobbe JC et al(Virol，2001，288:283,94 [15] Kanno T et al(Virus Res，2001，80:101,107 [16] Chinsangaram J et al(V accine，1998，16(16):1516,1522 [17] Bray M et al(J Viol，1996，70:4162,4166 [18] Guirakhoo F et al(J Viol，2000，74:5477,5485