姬松茸深层发酵培养基的优化

第 21卷第 4期 2002年 7月 无 锡 轻 工 大 学 学 报 Journal of W uxi University of Light Industry Vo1．21 No．4 Ju1． 2002 文章编号：1009—038X(2002)04—0389—04 姬松茸深层发酵培养基的优化 王 六生 ． 谷文 英 (江南大学 食 品学院，江苏 无锡 214036) 摘 要 ：通过姬松茸碳氮源筛选的单因素实验，确定玉米粉、蔗糖为碳源，豆粕粉、麸皮汁为氮源； 在此基础上，进行 了碳氮源质量浓度及比例实验、摇瓶发酵正交实验，优化培养基配方，确定姬松 茸摇瓶发酵培养基的最佳配方为：玉米粉 1．5 g／dL，蔗糖 0．5 g／dL，麸 皮汁 0．5 g／dI ，豆饼粉 2．0 g／dL． 关键词：姬松茸；深层发酵；培养基优化 中图分类号 ：Q 815 文献标识码 ：A Optimization of Submerged Fermentation M edium of Agaricus blazei M urill W ANG Liu—sheng， GU W en—ying (School of Food Science and Technology，Southern Yangtze University，Wuxi 214036，China) Abstract：In order tO screening an optimum culturing medium of Agacicus blazei(AbM)，single factor test in culturing utensil was carried out．The results showed that maize powder and sucrose were good carbon sources，and soybean powder and wheat bran extracts were nitrogen sources．Then，their con— centrations and the ratio of carbon and nitrogen were discussed．Through orthogonal test，an optimum formula for submerged ferm entation was proposed as follows：maize powder 1．5％ ，sucrose 0．5％ ， bran extracts 0．5％ ．soybean powder 2％ ． Key words：Agaricus blazei M urill；submerged ferm entation；medium optim ization 姬松茸又名巴西蘑菇(Agaricus blazei Muril1)， 属伞菌 目蘑菇科蘑菇属的大型食用真菌，分布于南 美洲的巴西、秘鲁等地，1965年传入 日本，经人工栽 培获得成功⋯ ．20世纪 80年代以来，日本科学家相 继发现巴西蘑菇 中含有多种生物活性物质，在抗肿 瘤、抗病毒、提高机体免疫功能等方面均有较好功 效，尤其在抗肿瘤方面效果显著，活性高于其它食 用菌．以巴西蘑菇多糖或蛋白多糖为样品注入小 鼠 体内，发现其对某些肿瘤的抑瘤率可以达到 90％左 右[ ， ．目前，巴西蘑菇仍局限于固体栽培，液态深 收稿 日期 ：2001一’2—06； 修订 日期 ：2002—04—25． 作者简介 ：王六生、，977一)，男，安徽怀宁人，工学硕士 层发酵报道较少，但是灵芝 、香菇等食用菌的液态 深层发酵技术已经实现工业化生产，获得显著的经 济效益．作者对姬松茸液态深层发酵的培养基进行 了优化筛选，成功进行了姬松茸的液体培养． 1 材料 与方法 1．1 菌种 姬松茸斜面菌种，市售，作者所在实验室保存． 1．2 材料 葡萄糖，甘露糖，半乳糖，乳糖，麦芽糖，果糖， 维普资讯 http://www.cqvip.com 390 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第 2l卷 木糖，鼠李糖，阿拉伯糖，蔗糖，棉籽糖，硫酸铵，硝 酸钠，磷酸二氢钾，硫酸镁均为国产分析纯试剂；酵 母膏，牛肉膏，蛋白胨，维生素 B1为生化试剂 ；可溶 性淀粉，蔗糖 (用于二级摇瓶 )为化学纯试剂 ；玉米 粉，豆饼粉过 60目筛 ；麸皮汁为麸皮煮沸 20 min后 用 6层纱布过滤制得 ． 1．3 主要仪器 WSZ一84—73型高压蒸汽消毒器，无锡第二医疗 器械厂产品；SW—CJ一1F型超净无菌工作台，苏州安 泰空气技术有限公司产品；SP一250A型生化培养箱， 南京实验仪器厂产品；HYG-Ⅱ型恒温调速摇床柜， 上海欣蕊 自动化设备有限公司产品；LD4—2型离心 机，北京医用离心机厂产品；101—1型电热鼓风干燥 箱，上海沪南科学仪器联营厂产品；752型紫外分光 光度计，上海精密科学仪器有限公司产 品；320S型 酸度计，梅德勒托利多仪器 (上海)有 限公司产 品； FA1004型电子天平，上海精密科学仪器有限公司 产 品 ． 1．4 实验方法 1．4．1 培 养基的配制 综合 PDA培养基(g／dL)：土豆 汁 20，葡萄糖 2．0，麸皮汁 1．0，酵母膏 0．2，蛋 白胨 0．2，KHzPO4 0，2，MgSO4 0．1． 发酵基础培养基(g／dL)：葡萄糖 2，蛋白胨0．4， KH2PO4 0．2，MgSO4 0．1，VB1 0．05；添加 2％琼脂 ． 一 级种子培养基(g／dL)：玉米粉 1．0，葡萄糖 1．0，麦芽糖 1．0，麸皮汁 1．0，蛋 白胨0．2，酵母膏 0．2． 二级发酵培养基(g／dL)：玉米粉 1．0～2．0，麸 皮汁 0～1．0，蔗糖 0～1．0，豆饼粉 1．0～2．0． 1．4．2 培养方 法 1)斜面培养：用接种铲从试管母种中切出蚕豆 大小的菌丝块接种于空白斜面的中部，于 25℃活 化培养 5 d． 2)一级种子培养 ：将已经活化的斜面菌种用接 种铲切成黄豆大小的菌丝块，接种于液体种子培养 基中，每 100 mL接种 5块，500 mL三角瓶装培养 基 100 mL，自然 pH值 ．于 25℃，160 r／min，培养 4 d．+ 3)二级摇瓶培养：将 已经培养约 4 d的一级摇 瓶种子以 l0％接种量接入装液量为 100 mL的 250 mL三角瓶中，自然 pH．于 25℃，160 r／rain摇瓶培 养 4 d． 4)碳源利用实验 ：用果糖、麦芽糖、蔗糖、半乳 糖、乳糖 、阿拉伯糖、棉籽糖、可溶性淀粉、玉米粉代 替基础培养基中的葡萄糖，在直径 9 cm的培养皿中 26℃条件下进行生长实验，培养 4 d后记录其菌落 直径及 菌丝 密度 ． 5)氮源利用实验 ：采用 以上的基础培养基，分 别以酵 母膏、牛 肉膏、蛋 白胨 、硫 酸铵、硝酸 钠、麸 皮、米糠 、豆饼 粉为氮 源，在直径 9 cm 培养皿 中 26℃条件下进行培养，4 d后记录其菌落直径及其 菌丝密度． 6)碳氮源质量浓度及碳氮 比实验：采用以上的 二级摇瓶实验 培养方 法 ． 7)正交实验 ：采用二级摇 瓶实验培养方法 ． 1．4．3 测 定 方 法 1)菌丝干重测定：取 100 mL发酵液用 4层纱 布过滤后，用 自来水洗涤 3次，再用蒸馏水洗涤 1 次，然后将菌丝在 60℃下烘 12 h称重． 2)胞外多糖的测定 ：取 100 mL发酵液于 3 000 r／min下离心 10 min，于上清液中加入 3倍体积的 乙醇，置冰箱中过夜，然后离心取沉淀得粗多糖，60 ℃烘干后，用电子天平称重 ． 3)还原糖测定：采用 3，5．二硝基水杨酸法[引． 2 结果 与分 析 2．1 单因素实验筛选最佳碳氮源 2．1．1 姬松茸对 不 同的碳 源利 用实验 不同的碳源对姬松茸菌丝生长促进的作用不 一 致，实验结果见 1． 表 1 碳源对姬松茸菌丝生长的影响 Tab．1 The effects of carbon source on growing of AbM 碳源 薯篓 碳源 薯嫠 葡萄糖 5．6 ++++ 乳糖 3．8 +++ 果糖 5．7 +++ 阿拉伯糖 5．0 + 麦芽糖 6．5 +++++ 棉子糖 6．2 +++ 蔗糖 6．3 +++ 可溶性淀粉 6．3 ++++ 半乳糖 5．0 ++ 玉米粉 6．8 ++++ 从表 1实验结果看来，姬松茸对单糖、双糖、寡 糖以及多糖均能利用．对醛糖和酮糖的利用情况没 有显著差异，单糖 中的葡萄糖、果糖均是姬松茸菌 丝生长的良好碳源，双糖中的麦芽糖是姬松茸的优 良碳源，能显著促进姬松茸的生长，其中玉米粉、麦 芽糖的菌落半径明显大于乳糖、半乳糖等的菌落半 径．就菌丝密度看来，以玉米粉、麦 芽糖为最好，果 糖、半乳糖 、乳糖、阿拉伯糖则较差．综合考虑菌丝 生长速度、菌丝密度以及生产成本等因素，选用玉 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 王 六生等 ：姬松 茸深 层发酵培 养基 的优化 391 米粉及蔗糖作为姬松茸的生长碳源 ． 2．1．2 姬松茸对不同的氮源利用实验 不同氮源对姬松茸菌丝体生长有不 同程度的 促进作用，结果如表 2． 表 2 氮源对姬松茸菌丝体生长的影响 Tab．2 The effects of nitrogen source on growin‘g of AbM 氮源 薯 氮源 薯 酵母膏 5．8 +++++ 硝酸钠 3．5 + 牛 肉膏 6．6 ++++ 麸 皮 6．2 ++++ 蛋白胨 6．0 ++++ 米糠 6．0 +++ 硫酸铵 4．2 ++ 豆饼粉 6．5 ++++ 同灵芝、灰树花等其它食用菌一样，姬松茸对 有机氮源的利用优于无机氮源，有机氮源中的酵母 膏、牛 肉膏、蛋 白胨等有机复合氮源的利用情况较 好．此外，对豆饼粉 、麸皮等天然氮源的利用情况也 较好．综合评价姬松茸对各氮源 的利用情况，酵母 膏、豆饼粉最好，牛 肉膏、蛋 白胨、麸皮次之，米糠较 差，硫酸铵、硝酸钾最差 ．实验选用廉 价的豆饼粉、 麸皮作为姬松茸发酵的氮源． 2．2 碳氮源质量浓度及碳氮比实验 碳、氮源的质量浓度直接影响到微 生物的营养 需求及代谢产物对微生物 的生长抑制等．如氮源过 多会引起菌丝生长过于旺盛，不利于代谢产物的积 累；碳源不足，又容 易引起 菌体衰老 和 自溶 J．此 外，食用菌的深层发酵还要考虑到培养基的粘度， 微生物 的质量浓度过 大，易造成溶氧不足．碳氮源 比会改变微 生物的代谢流 向从而对微生物 的生长 造成影响．为便于计算及排除其它因素的干扰，采 用葡萄糖 2 dL，3 g／dI ，4 g／dL；蛋白胨0．2 g／dL， 0．4 g／dL，0．6 g／dL的质量浓度梯度，再外加磷酸 二氢钾 0．2 g／dL，硫酸镁 0．1 g／dL，进行碳氮源质 量浓度及碳氮源质量浓度比实验 ，结果见表 3． 从表 3可以看出，姬松茸在碳氮源质量浓度 比 为 5：1时，较有利于姬松茸的生长，当碳源质量浓 度 由2 g／dL到 3 g／dL、相应的氮源质量浓度由 0．4 g／dL变成 0．6 g／dL时，姬松茸的生物量没有同比 增长，说明姬松茸的碳源质量浓度达到 2 g／dL以上 时，姬松茸 的生长就要受到 一定 的限制 ．当碳源质 量浓度过低时，菌丝生长受阻；而碳源质量浓度过 高时，则粘度增加，减少 了培养基中的溶氧，也会使 菌丝生长受到影响．进一步优化实验碳源的质量浓 度，选择在 2～3 g／dL之间较为合适，此实验结果和 潘继红等研究结果相似 J． 表 3 碳氮源质量浓 度及碳氮比对姬松茸液态深层发酵的 影响 Tab．3 The effec ts of the concentration and the ratio of C、N on the subm erged ferm entation of AbM 2．3 正交实验优化培养基的组成 以上的单因子实验初步表明，玉米粉、蔗糖、豆 饼粉、麸皮汁为姬松茸生长的较佳营养因子，可以 促进姬松茸在固体培养基中的生长．为了考察这些 因子的协同作用，以及在液体培养时的生长利用状 况，选用玉米粉、蔗糖、豆粕粉和麸皮汁等 4个因 子，各取 3个水平，在摇瓶中进行 (3 )正交实验， 其实验 与分析结果 见表 4和表 5以及 图 1、 图 2， 表 4 正交实验因子 L9(3 )水平表 Tab．4 The factors an d level of orthog onal test 从极差分析结果来看，豆饼粉对生物量的影响 最为显著，玉米粉对生物量的增加影响次之；当玉 米粉 由 1 g／dL增加到 2 g／dL时，生物量增加 了 0．187 g，即增加部分的转化效率为 18．7％．蔗糖有 先增加后下降的趋势，这可能是 由于当蔗糖增加到 一 定的程度，碳源含量过高，或碳氮源质量浓度 比 不适宜，影响了它 的生长．麸皮汁质量浓度当增加 到 0．5 g／dL后，其对增加生物量和胞外多糖的贡献 就变得不明显 ．因为实验培养基所选用的玉米粉和 豆饼粉溶解性差、粘度大，当质量浓度增加到一定 值时，造成培养基溶氧下降，使菌丝生长受阻，所以 出现 了生物量先上升，后反而下降的情况．从减小 维普资讯 http://www.cqvip.com 392 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第 21卷 培养液的粘度考虑，同时考虑到蔗糖是速效碳源， 可用部分蔗糖代替玉米粉作为碳源．再结合前面的 可溶性碳氮源的质量浓度 比实验，选定姬松茸的二 级摇瓶 最佳配方 为：玉米 粉 1．5 g／dL，蔗 糖 0．5 g／dL，麸皮汁 0．5 g／dL，豆饼粉 2 g／dL． 表 5 正 交实验结果与分析 Tab．5 The results and analysis of orthogonal test 参考文献 ： 目 1瑚1 H． 1 {匠 吕 据 型 图 1 实验 因素与指标趋势 图 2 实验因素与指标趋势 Fig．2 Effects of factors on extracellular polysaccharides 3 结 论 1)用廉价的玉米粉、蔗糖、豆饼粉、麸皮为原料 进行姬松茸的液体培养，用二级摇瓶筛选的最佳配 方，在自然 pH值、160 r／min、26℃条件下培养 4 d， 生物量可 以达到 1．43 g／dL，胞外粗多糖达 0．167 g／dL． 2)培养基筛选实验所选用的摇瓶发酵培养条 件，如 pH值 、温度、装液量、摇瓶转速需通过实验进 一 步 优化选择 ． 3)在姬松茸的液态培养过程中，培养基筛选的 参考指标为生物量和胞外粗多糖，因为多糖是姬松 茸中的主要活性物质，培养基的优化应围绕促进多 糖的生物合成展开． [1]黄年来 ．巴西蘑菇值得研究推广[J]．中国食用菌，1994，13(1)：l1—13． [2]TAKASHI MIZUO，JOSHIHIKO HAGIWARA．Antitumor activity and SOme properties of water-souble polysaccharides from “Himernatsutake”．the fruiting body of Agaricus blazei Murm[J]．Agric Bilo Chem，1990，54(11)：2889—2896． [3]MASASHI MIZUNO．Antitumor polysaccharide from the mycelium of liquid—cultured Agaricus blazel mill[J J．Biochemistry and Molecular Biology International，1999，47(4)：707—714． [4]张惟杰．复合多糖研究技术 [M]．上海 ：上海科学出版社，1987． [5]梁峙 ．食用菌深层液体发酵参数控制的研究[J]．食品科学，2001．22(1)：38—41． [6]潘继红．灵芝液体培养需求 的探讨 [J]．食用菌学报，1997，4(1)：31—34． (责任编辑：杨 萌，朱 明) 维普资讯 http://www.cqvip.com