葛根提取物的技术要求

葛根提取物的技术要求 葛根提取物技术要求 本技术要求的编写是按GB/T 1.1-2009《标准化工作导则》的有关规定编辑。 本技术要求检验方法引用了《中华人民共和国药典》2010年版一部;GB/T 5009.11;GB 5009.12;GB/T 5009.13;GB/T 5009.15;GB/T 5009.17;GB/T 5009.19等国家标准，以保证检验数据的准确性。 本技术要求的附录A、附录B均为规范性附录。 1 范围 本技术要求适用于以豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 的干燥根(习称野葛)为原料经加工制成的提取物。 2 规范性引用文件 本技术要求中引用的文件对于本技术要求的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本技术要求。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本技术要求。 GB/T 5009.11 食品中总砷及无机砷的测定 GB 5009.12 食品中铅的测定 GB/T 5009.13 食品中铜的测定 GB/T 5009.15 食品中镉的测定 GB/T 5009.17 食品中总汞及有机汞的测定 GB/T 5009.19 食品中有机氯农药多组分残留量的测定 GB 4789.2 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定 大肠菌群测定 GB 4789.3 食品卫生微生物学检验 GB 4789.4 食品卫生徽生物学检验 沙门氏菌检验 GB 4789.5 食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验 GB 4789.10 食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 GB 4789.11 食品卫生微生物学检验 溶血性链球菌检验 GB 4789.15 食品卫生微生物学检验 霉菌和酵母菌计数 《中华人民共和国药典》2010年版一部 3 技术要求 3.1 制法 取葛根，粉碎成粗粉，加30%乙醇加热回流提取两次，每次2小时，第一次加10倍量，第二次加8倍量，滤过，合并滤液，滤液于60?减压浓缩至相对密度为1.10,1.20(室温)的清膏，放冷，加乙醇使含醇量为70%，静置12小时，取上清液，减压回收乙醇，并浓缩至稠膏，干燥，即得。 3.2 感官要求:应符合表 1 规定。 表1 感官要求 项 目 要 求 1 色泽 淡黄色至棕黄色、色泽均匀。 滋味及气味 具有本品应有的气味、味微甜。 性状 干燥均匀的粉末。 杂质 无肉眼可见杂质。 3.3 功效成分:应符合表2规定。 表2 功效成分 项目 指标 葛根素(CHO)(以干燥品计)/( mg/g) ? 100.0 21209 其它异黄酮总量(大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木? 25.0 素)(以干燥品计)/( mg/g) 葛根素与其它异黄酮总量(大豆苷、染料木苷、大豆素? 8.0 和染料木素)的比值 3.4 理化指标:应符合表3规定。 表3 理化指标 项目 指标 薄层鉴别 应符合规定 水分/% ? 5.0 炽灼残渣/% ? 5.0 铅(以Pb计)/( mg/kg) ? 2.0 镉(以Cd计)/( mg/kg) ? 0.3 砷(以As计)/( mg/kg) ? 2.0 汞(以Hg计)/( mg/kg) ? 0.2 铜(以Cu计)/( mg/kg) ? 20 六六六/( mg/kg) ? 0.02 滴滴涕/( mg/kg) ? 0.02 特征图谱 应符合规定 3.5 微生物指标:应符合表4规定。 表4 微生物指标 项目 指标 菌落总数/(cfu/g) ? 1000 大肠菌群/(MPN/100g) ? 40 霉菌/(cfu/g) ? 25 酵母菌/(cfu/g) ? 25 沙门氏菌 ? 不得检出 志贺氏菌 ? 不得检出 2 金黄色葡萄球菌 ? 不得检出 溶血性链球菌 ? 不得检出 4 检验方法 4.1 感观检验 取适量试样，置于白瓷板上，在自然光下，用肉眼观察其色泽、性状、杂质，闻其气味，用温开水漱口，品尝其滋味。 4.2 功效成分检验 按规范性附录A规定的方法测定。 4.3 理化检验 4.3.1 薄层鉴别 取本品0.1g，加甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取葛根对照药材0.8g，加甲醇10ml，放置2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为对照药材溶液。再取葛根素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录? B)试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇-水(7:2.5:0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和葛根素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光条斑。 4.3.2 水分:按《中华人民共和国药典》2010年版一部附录? H(第一法)测定，不得过5.0%。 4.3.3 炽灼残渣:按《中华人民共和国药典》2010年版一部附录? J测定，不得过5.0%。 4.3.4 铅:按GB 5009.12《食品中铅的测定》规定的方法测定。 4.3.5 镉:按GB/T 5009.15《食品中镉的测定》规定的方法测定。 4.3.6 砷:按GB/T 5009.11《食品中总砷及无机砷的测定》规定的方法测定。 4.3.7 汞:按GB/T 5009.17《食品中总汞及有机汞的测定》规定的方法测定。 4.3.8 铜:按GB/T 5009.13《食品中铜的测定》规定的方法测定。 4.3.9 六六六及滴滴涕:按GB/T 5009.19《食品中有机氯农药多组分残留量的测定》规定的方法测定。 4.3.10 特征图谱 按规范性附录B规定的方法测定。 4.4 微生物检验 4.4.1 菌落总数:按GB 4789.2 《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》规定的方法测定。 4.4.2 大肠菌群:按GB 4789.3 《食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》规定的方法测定。 4.4.3 霉菌和酵母菌:按GB 4789.15 《食品卫生微生物学检验 霉菌和酵母菌计数》规定的方法测定。 4.4.4 沙门氏菌:按GB 4789.4 《食品卫生徽生物学检验 沙门氏菌检验》规定的方法测定。 4.4.5 志贺氏菌:按GB 4789.5 《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》规定的方 3 法测定。 4.4.6 金黄色葡萄球菌:按GB 4789.10 《食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》规定的方法测定。 4.4.7 溶血性链球菌:按GB 4789.11 《食品卫生微生物学检验 溶血性链球菌检验》规定的方法测定。 5 贮藏 密封，置凉暗干燥处。 4 附 录 A (规范性附录) 功效成分的检验 葛根素、其它异黄酮总量(大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素)、葛根素与其它异黄酮总量(大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素)的比值的测定 A.1 原理 用60%乙醇作为溶剂，超声提取试样中的葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素，经高效液相色谱柱(C)分离，紫外检测器(UV)检测，根据色谱峰的保留时间定性，18 峰面积外标法定量，测定试样中葛根素、其它异黄酮(大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素)的含量，并计算葛根素与其它异黄酮总量(大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素)的比值。 A.2 试剂 A.2.1 水:纯化水。 A.2.2 甲醇、色谱纯。 A.2.3 乙腈:色谱纯。 A.2.4 乙酸铵:分析纯。 A.2.5 冰乙酸:分析纯。 A.2.6 乙醇:分析纯。 A.2.7 0.02mol/L乙酸铵(pH 4.6):称取乙酸铵1.54g，加水约900ml，搅拌使溶解，用冰醋酸调节pH值至4.6，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。 A.2.8 葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素对照品:由中国药品生物制品检定所提供。 A.3 仪器 高效液相色谱仪，带紫外检测器。 超声波清洗器。 A.4 分析步骤 A.4.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(AichromBond-AQ C18 4.6×250mm 5μ，或相当者);以乙腈为流动相A，以0.02mol/L乙酸铵溶液(用冰乙酸调pH值至4.6)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱;流速为1.0 ml/min;检测波长为260nm。理论板数按葛根素峰计算应不低于5000。 时间(min) A(%) B(%) 0.0,9.0 20,30 80,70 9.0,10.0 30 70 10.0,12.0 30,48 70,52 12.0,18.0 48 52 18.0,18.5 48,20 52,80 18.5,26.0 20 80 5 A.4.2 色谱图 A.4.3 溶液的制备 A.4.3.1 对照品混合溶液的制备 取葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中含葛根素1mg、大豆苷0.2mg、染料木苷0.1mg、大豆素0.1mg和染料木素0.1mg的混合溶液，摇匀，即得对照品混合溶液。 A.4.3.2 供试品溶液的制备 取本品约50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加60%乙醇适量，超声处理30分钟，放冷至室温，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 A.4.4 标准曲线的制备 分别精密量取对照品混合溶液0.05、0.1、0.5、2.0、5.0ml,置10ml量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，得对照品系列溶液。分别精密吸取对照品系列溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。 A.4.5 精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按标准曲线法以峰面积计算，即得。 A.4.6 计算 C×25 X= W×(1-M) 式中: X,试样中单一成分的含量，mg/g; C,从标准曲线上求得供试品溶液中相应成分的浓度，μg/ml; W,取样量，mg; M,水分，%。 计算结果保留至小数点后一位。 A.4.7 允许差 同一样品两次测定，相对平均偏差不得超过5.0%。 6 附 录 B (规范性附录) 特征图谱 B.1 原理 用60%乙醇作为溶剂，超声提取试样中的特征成分，经高效液相色谱柱(C)分离，紫18外检测器(UV)检测，根据参照物色谱峰的保留时间，计算各特征峰的相对保留时间。 B.2 试剂 B.2.1 水:纯化水。 B.2.2 甲醇、色谱纯。 B.2.3 乙腈:色谱纯。 B.2.4 乙酸铵:分析纯。 B.2.5 冰乙酸:分析纯。 B.2.6 乙醇:分析纯。 B.2.7 0.02mol/L乙酸铵(pH 4.6):称取乙酸铵1.54g，加水约900ml，搅拌使溶解，用冰醋酸调节pH值至4.6，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。 B.2.8 葛根素由中国药品生物制品检定所提供。 B.3 仪器 高效液相色谱仪，带紫外检测器。 超声波清洗器 .4 分析步骤 B B.4.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(AichromBond-AQ C18 4.6×250mm 5μ，或相当者);以乙腈为流动相A，以0.02mol/L乙酸铵溶液(用冰乙酸调pH值至4.6)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱;流速为1.0ml/min;检测波长为260nm。理论板数按葛根素峰计算应不低于5000。 时间(min) A(%) B(%) 0.0,9.0 20,30 80,70 9.0,10.0 30 70 10.0,12.0 30,48 70,52 12.0,18.0 48 52 18.0,18.5 48,20 52,80 18.5,26.0 20 80 B.4.2 溶液的制备 参照物溶液的制备 取葛根素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含葛根素1mg的溶液，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。 供试品溶液的制备 取本品50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加60%乙醇适量，超声处理30分钟，放冷至室温，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 7 B.4.3 测定法 分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 B.4.4 结果判断:供试品特征图谱中应有5个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的?5%之内。规定值为:1.00(峰S)、1.06(峰2)、1.35(峰3)、1.99(峰4)、3.20(峰5)。 对照特征图谱 峰1(峰S):葛根素 峰2:未知 峰3:大豆苷 峰4:染料木苷 峰5:大豆素 8