茯苓免疫功能性成分研究与质量分析

茯苓免疫功能性成分研究与质量 湖北中医药大学 硕士学位论文 茯苓免疫功能性成分研究与质量分析 姓名:徐斌 申请学位级别:硕士 专业:中药学 指导教师:刘焱文 20100519茯苓免疫功能性成分研究与质量分析 中文摘要 茯苓为多孔菌科真菌茯苓乃,砌.的干燥菌核, 寄生于松科植物赤松或马尾松根茎,埋于土壤下厘米繁衍而成。茯 苓为传统药食两用中药,《神农本草经》将其列为上品,收载于历版《中国 药典》。茯苓具有渗湿利尿、和胃健脾、宁心安神的功效;现代药理学研 究表明,茯苓有抗肿瘤、调节免疫功能、抗炎、抗过敏等方面的生物活性。 其主要活性成分为茯苓多糖和三萜类化合物。 为了进一步诠释茯苓免疫调节功能物质基础和建立该药材与国际接 轨的质量评价体系,本论文在前期研究的基础上,对其进行了调节免疫功 能活性成分及质量分析研究。 本实验室前期利用溶剂萃取法将茯苓药材提取物分离成为不同物质 部位,药理实验表明,正丁醇萃取物质部位具有显著调节免疫功能活性。 本论文采用大孔树脂纯化技术,将正丁醇萃取物质部位分离为个组分, 从中筛选出个免疫调节功能活性组分;采用现代色谱分离技术,从上述 个活性组分中分离得到 个单体成分;通过现代波谱分析方法,鉴定 了其中 个化合物, 分别为乙酰氨基葡萄糖 ??, 一脲苷, 一吡喃木糖 ,一【一一吡喃甘露糖一一葡糖糖一【.., ., 【一三羟基一羊毛甾 ??, 一, ,一三烯一一酸【 , 一乙酰氧基 【一羟基一羊毛甾一,一二烯一卜酸 ,一乙酰氧基 【一羟基一羊毛甾,,一三烯酸 , , 一二羟基一羊毛甾一,一二烯一羟基羊毛甾,二烯酸 酸 , ...,.. ..等;药理筛选结果表明,化合物 、等具有免疫增强的生物活性,化合物、、 等具有 免疫抑制的生物活性,而化合物 和 则表现出免疫双 向调节作用。这对于诠释茯苓的药效物质基础具有重要意义。湖北中医药大学 届硕士学位 论丈 采用现代分析方法,建立了茯苓药材规范化的指纹图谱, 测定了 批不同产地茯苓药材的图谱,标定了 个共有峰,对其中 个指纹峰进行了归属。参照中药指纹图谱评价系统对不同产地茯苓药材进 行了分析,依据相似度大小,将各样品进行了分类,指出了有较大差异的 离散样品,表明该指纹图谱能有效地控制茯苓药材的质量。 采用紫外分光光度法和高效液相色谱法,以茯苓多糖、 茯苓酸和总三萜含量为评价指标,对茯苓药材进行了有效物质含量分析研 究;同时以药材色泽、致密度、水分、灰分等理化指标对其质量进行比较, 综合分析结果表明,安徽岳西和霍山,湖北罗田和英山,以及湖南靖州产 茯苓质量较优。 主题词:茯苓;调节免疫功能;化学成分;指纹图谱;含量测定;茯苓免疫功能性成分研究与质量 分析 : :. ... . , ,’ . ,, ; ?, , ?,卜., .,, ..湖北中医药大学届硕士学位论丈 . , ? , . , , , . ???; ? ;?;一【一?一 【, 【一 ; , ? 一, ,一一一 ; ?一 【一?? 【 一,一一; ?一 一一 ? , ,一 ; , 【一?? 一,一一一?; ??一. ? ,一一一?, , ..,? , , , . ,. . , , . , , 茯苓免疫功能性成分研究与质量分析, ?. , , , . : ; ;; ; 茯苓免疫功能性成分研究与质量分析 前 言 茯苓为传统药食两用中药,收载于 版《中国药典》,《神农本草 经》将其列为上品,具有渗湿利尿、和胃健脾、宁心安神的功效;临床用 于治疗水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、便溏泄泻、心神不安、惊悸失眠 等症,效果显著;其药性缓和、补而不峻、利而不猛、既能扶正又能祛邪, 因此作为传统中药防治疾患的历史悠久;现代药理学研究表明,茯苓具有 抗肿瘤、调节免疫功能、抗炎、抗过敏等方面的生物活性。 茯苓在历史长河中在人类养生保健和防治疾病等方面享有盛誉,是广 泛应用于临床的传统中药。据第三次全国中药资源普查统计在数以万计的 中药临床组方中,茯苓的配伍率达 %以上,在医药市场上以茯苓为原料 或配伍组方的中成药制剂约余种,其中药典收载的中成药和处方中茯 苓配伍的品种逾百种。以茯苓为原料制作保健食品备受人们的欢迎,茯苓 饼、茯苓酒、茯苓点心、云片白雪糕、长寿挂面等产品在市场上随处可见。 随着人民生活品质的不断提高,人们保健意识的逐渐增强,以茯苓为原料 制作的药食两用的中药品种,越来越受到人们的青昧和重视。 茯苓远销世器很多国家,占有中药材出口可观的份额。我国茯苓资源 分布广泛,主要来源于湖北、安徽、云南、四川、广西、福建、贵州等省 区,浙江、陕西、河南、广东等省区亦有栽培资源。湖北省为茯苓地道药 材产区,种植历史悠久,品质优良,驰名国内外,其产量占全国总产量的 %以上。 本研究论文是国家自然科学基金项目 和国家“十一五 科技支撑项目 ??部分内容。通过学科交叉的研究 方法,采用现代科学技术对茯苓调节免疫功能的药效物质和质量控制方法 进行了研究。其研究结果可望诠释茯苓药效物质基础,为其保健和治疗功 能提供科学依据,并为其开发新产品奠定一定基础,以期促进我省中药现 代化进程和地方经济发展。原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含其 他任何个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究作出重 要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由 本人承担。 论文作者签名: 日期:沙/年万月日 锉蔚 学位论文使用授权说明 本人完全了解湖北中医学院关于收集、保存、使用学位论文的规定, 即: 按照学校要求提交学位论文的印刷本;学校有权保存学位论文的印刷 本;在不以赢利为目的的前提下,学校可以公布学位论文的部分或全部内 容。保密论文在解密后,遵守此规定 论文作者签名:咎网’导师鲐五/哆殳 日期:芦年月/日茯苓免疫功能性成分研究与质量分析 第一章文献综述 茯苓为多孔菌类植物尸勿,, .的菌核,腐生于松 科植物赤松或马尾松根茎,埋于土壤下 厘米繁衍而成。茯苓为传统 药食两用中药,具有渗湿利尿、和胃健脾、宁心安神的功效;临床用于治 疗水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、便溏泄泻、心神不安、惊悸失眠等症 ?,效果显著;现代药理学研究表明,茯苓具有抗肿瘤、调节免疫功能、 抗炎、抗过敏等方面的生物活性。 茯苓临床用于治疗疾病药性缓和、补而不峻、利而不猛、既能扶正又 能祛邪,因此作为传统中药防治疾患的历史悠久。据第三次全国中药资源 普查统计在数以万计的中药临床组方中,茯苓的配伍率达 %以上,在医 药市场上以茯苓为原料或配伍组方的中成药制剂约余种。以茯苓为原 料制作保健食品备受人们的欢迎,茯苓饼、茯苓酒、茯苓点心、云片白雪 糕、长寿挂面等产品在市场上随处可见。我国茯苓还远销世界很多国家, 在中药材出口占有可观的份额。据年统计乜’,我国每年药用、食用和出口茯苓的需求量为 万 公斤,是中药材需求量的大品种。 我国茯苓资源分布广泛,主要来源于湖北、安徽、云南、四川、广西、 福建、贵州等省区,浙江、陕西河南广东等省区亦有栽培资源。湖北省是 世纪 茯苓药材古往今来的主要产地,且品质优良。 年代初,为缓解 全国茯苓药材供应紧缺,在中国药材公司在长江以南湖北、安徽、福建、 广东、云南、等几个省区进行栽培茯苓药材,产量迅速提高,但湖北 茯苓药材产量仍占全国%上,其产量优势一直保持至今。 上世纪国内外学者对茯苓进行了大量的研究。近年来,随着科学技术 的不断进步,茯苓倍受国内外学者关注,诸多文献资料较系统报道了茯苓 的研究情况,总计发表的学术论文达到余篇。对茯苓的栽培方法、届硕士学位论丈 湖北中医药大学 化学成分、药理作用和临床应用也取得了一些进展,现概述如下: 栽培方法的研究 茯苓栽培方法较多,最近 多年发表相关学术论文百余篇。茯苓药 材是多孔菌类植物,寄生于松科植物赤松或马尾松的根茎,在土壤中繁衍 而成。其栽培过程包括选木材一挖地穴一接菌种一覆土一管理一加工等环 节。为了保护松林的生态环境和提高茯苓的产量,李萍等人进行了“茯苓 种植用材代用品”的研究,蔡德华等人利用棉籽壳辅助松木栽培茯苓; 岩金火等人利用松木屑料栽培茯苓;茯苓栽培过程中菌种选择是影响茯 苓药材质量的重要因素,蒋昌钟对茯苓菌的选育进行了研究“;胡适松等 进行了茯苓栽培菌种的比较研究”;林杰等进行了茯苓栽培新菌株的研究 哺;刘振武等进行了茯苓旱田立体生态栽培技术的研究?等等。茯苓的栽 培研究成果推动了茯苓药材大规模种植。 茯苓的化学成分研究 近百年来国内外学者对茯苓的化学成分进行了广泛研究,其主要成分 为茯苓多糖、三萜类化合物、脂肪、蛋白质及无机盐。 .茯苓中的多糖成分及其衍生物 茯苓多糖的含量占 %以上,从茯苓菌核提取分离得到的多糖主要是 葡聚糖,含少量链接的一葡聚糖支链 ’; 等从菌核体中分离出种多糖,其中种是由葡萄糖、半乳糖、木糖和甘 露糖组成的杂多糖,且含较多链接的一葡聚糖支链: ; 等报道从茯苓菌丝体中分离出的多糖与茯苓菌核中的多糖几乎相 同,主要为一葡聚糖,带少支链;丁琼等从茯苓菌核中分 离出种多糖,其中种是由一葡萄糖、一木糖、一甘露糖和一半乳糖 组成,一种为线型一葡萄糖;从茯苓茵丝体中分离出种多茯芩免疫功能性成分研究与质量分析 综合分析报道,不同来源茯苓 糖,其结构与茯苓菌核中多糖基本相同 中分离出的多糖,其化学结构基本相同,仅分子量有差异,见图卜及表 。 表茯苓多糖类成分 .. 【 】 ..一【 ..卜【.? .%/ .%, ‘‰ , ,?,, ,甜研刀刀 . ,,?, ?. 】 ? . ?. .? .?【】 吼 . ? ? ?, ? ,一? 屹 犯 .跚跚踟川叫” 一 . . 。吼。仅.。。。?‘砌。辩柚 . . . ?. ..舢 【】 一? .. . . 【 ?.. 【】 湖北中医药大学届硕士学位论文 图卜茯苓多糖的基本结构 将茯苓多糖进行一定的结构修饰后,可分别得到羧甲基化、硫酸酯化、 羟丙基化、羟乙基化、甲基化等茯苓多糖衍生物,不同程度的改善了水溶 性。其中,羧甲基化衍生物具有较好水溶性和较高生物活性。 .茯苓中的三萜类成分 到目前为止,国内外报道从茯苓菌核和菌丝体中分离鉴定了茯苓酸 、土莫酸 、茯苓酸甲酯等 余种三萜类化合物,见表。多属于类固醇类 四环三萜。这类化合物一般具有重要的生物活性。根据化学结构的差异可 分为以下五种结构类型 ,即羊毛甾烯型三萜 、羊毛甾,一二烯型三萜一,一、 ,一开环一羊毛甾,二烯型三萜 、,一开环一羊 , ,一 和齐墩果 毛甾烯型三萜,一 烷型三萜。茯苓免疫功能性成分研究与质量分析 表茯苓三萜类成分 参 考 中文名称 英文名称 文 霉 献 .乙酰氧基..羟基.羊毛甾....,.... 烯酸茯苓酸 , , .,, 【.二羟基羊毛甾., .. .. ,,?三烯酸去氢土,, 莫酸 【】 .酮基.仅.羟基羊毛甾., ... ?,烯??酸猪苓酸伊, 【 , .二羟基.羊毛甾... ,..,, 二烯一酸土莫酸.羟基.羊毛甾.二烯.....,...,【】 酸依布里酸 .乙酰氧基. .羟基羊毛甾... , ... .烯?酸甲酯茯苓酸甲酯 ., ,, 【.二乙酰氧基.羊毛甾,,..., 二烯一酸乙酰茯苓,旺. 酸 . .羟基.羊毛甾. ,烯, ,.. ,, .酸 乒羟基. ,仅.二乙酰氧基羊毛..,,. 甾?烯一酸乙酰茯苓酸,, 】 醇 【】, 【.二乙酰氧基羊毛甾,,..., .二烯一酸甲脂一乙酰,? 茯苓酸甲酯 【 .羟基. 【.乙酰氧基一羊毛甾.,,.. ., ..., ,,三烯?酸,一? , , .香树脂醇乙酸酯 ..,, .羟基.羊毛甾.,皤..酸,... ., . ? 【】.乙酰氧基. ..羟基羊毛甾.,...,....,, 烯酸 .?? 【, , 【.二羟基.羊毛甾.烯.,... ,?, 酸 【 【一 , .二羟基.羊 毛甾, ,.. ., , ,.三烯.一酸 , ?, ,?一.乙酰氧基., .二羟基.羊.,..,.., 【 毛甾?,,烯?酸 一一,,. :鍪茎圭氢茯芩酸 ???????????一??????????????????? ????????????一湖北中医药大学届硕士学位论丈 【】. .羟基.羊毛甾. ,.三烯., ,.. ,.. ..酸甲酯 ,,一 . .羟基.羊毛甾..二烯. .酸.,.. ,., 甲酯.羟基.羊毛甾.,,.,...,... 烯?酸甲酯 & 【】 .乙酰氧基. .羟基.羊毛甾.,...,. .,,烯?一酸去氢茯一,, 苓酸 【】 .对.羟基苯甲酰基. 【.羟基...., 羊毛甾,,三烯酸,,一 .对羟基苯甲酰基去氢土莫酸, .,, . .二羟基.羊毛甾, . ,,烯酸?差向 ,’ 去氢土莫酸 .羟基.羊毛甾.,.三.,.. ,.., 烯酸去氢依布里酸酮基., 【.二羟基.羊毛甾., .,..,,... , .三烯?卜酸 ,,】 【.乙酰氧基. .羟基.羊毛甾.,.., .,,.三烯?酸?差向一,,?. 去氢茯苓酸 .乙酰氧基. ..羟基.羊毛甾.,,.仃..,... . ,.三烯. ?酸 , 【.羟基.,.开环.羊毛甾 ... ...,.【 .,, ,.四烯,二酸 ..,,,,,,一 一 ?. ,, 【】 .,, 。【, 【,.三羟基.羊毛甾., .. ,... .,,一三烯一酸羟基 .?差向去氢土莫酸 羟基.开环一羊毛甾 ??,? ’ ’ ,,,四烯,二 一?,,,,,,酸 , ,一、,, 【,.二羟基.,.开环.羊毛甾 ..,... ,,,一四烯?,二酸?,,,,,, 一,,一一, ,一 【】..羟基.开环.羊毛甾 ..,.【...一 ,, ,?四烯?二??,,,,,,?? 酸一.甲酯 .一卜 垦:垒兰:?:垦: ,鲨坐竺 ????????一??????’?’?’一 .【.,.【..一 甾二 .? 羊四 烯 .勰 似 卜 毛啦 .,,,,,,, 开坝 环皿 ...,,,。 珥叫酸 【 .【】.。,一【. 【,.二羟基.,.开环.羊毛甾 ,,,四烯?二??,,,,,,? 酸.,一,, ,,. 【..二羟基.,.开环.羊毛甾 ,?【?卜’? 四烯., ?二?,,,,,, ,,, 酸..甲醋 ?一, ,,. ‘“’ 一,?【‘。.羟基..开环.羊毛甾 ,,?‘, ..,,? ,,.三烯..二酸 ... .?,,,, 【】 .羟基.,一开环.羊毛甾 %,.一 ?一,如,,,, ,,.三烯.,二酸 ,, ...一,【】 , 去氢松香酸甲酯 ,,,,.,?一? &, , ’ :,’ ,,? , ,,,, 客 嵩心,硼基羊?扎.邸即阳??.?, 毛甾.烯.酸 【【.羟基去氢土莫里酸 【 ,.二羟基去氢依布里酸 一 【】 , .过氧去氢土莫里酸 【 .羟基茯芩酸 【 去氧茯苓酸 .其他成分 、十一酸 茯苓中还含有其他少量成分,包括辛酸、、棕榈酸 、十二酸 、等?;组氨酸、卵磷脂、左旋葡萄糖、甲壳素、蛋 月桂酸 白质、腺嘌呤、胆碱、树胶、脂肪及酶等“;无机元素钙、镁、铁、钾、 钠、磷、硅、镉、铜、硫、铬、铅锰、及氯。 湖北中医药大学届硕士学位论文 茯苓的药理学研究 现代药理学研究表明,茯苓具有抗肿瘤、调节免疫功能、抗炎抑菌、 利水消肿、保肝健脾、镇静安神、抗突变、抗衰老、抗过敏等多方面的生 物活性,其药效物质基础主要为茯苓多糖和三萜类化合物。 .抗肿瘤作用 吴波等将茯苓多糖与小鼠肉瘤 和人白血病细胞体外培养 小时,发现茯苓多糖对两种细胞增殖有强烈的抑制作用刀;许津等人 研究发现,茯苓素对艾氏腹水癌和肉瘤 有显著抑制作用,对小鼠 肺癌的转移有一定抑制作用;李电东等人将茯苓素与环磷酰胺等 抗癌药合用,结果表明,有明显增效作用?。 .与抗癌药物合用增效,提高放,化疗效果作用 于滨等蚰采用茯苓多糖与多种抗癌药物合并使用对小鼠移植性肿瘤 进行试验观察,发现茯苓多糖显著增强了环磷酰胺、 、、平阳霉 的抑制作用和平阳霉素对食管癌 素、丝裂霉素、更生霉素对小鼠 的抑制作用,提高了环磷酰胺对白血病小鼠、和长春 新碱对 的生命延长率,与抗癌药合用有明显的增效作用;徐榕等”” 发现茯苓中羊毛甾烷三萜类化合物与抗癌药物合用,能促进小鼠巨噬细胞 产生集落刺激因子,提高由线照射所致白细胞减少症的小鼠的 外周血白细胞水平和血小板的数量,明显促进粒细胞增殖,引起造血细 胞再生,表明茯苓可提高放、化疗的疗效。 .调节免疫功能 、 祝秀军等人研究表明刘,茯苓多糖静脉注射剂量依次为、 .时,对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用和腹腔巨噬细胞吞噬功能均 具有明显促进作用;张思访等人报道如,茯苓多糖具有较好的增强免疫系 统功能作用,既能增强细胞免疫,又能提高体液免疫,能显著增强小鼠腹 腔巨噬细胞的吞噬能力,能刺激淋巴细胞与淋巴细胞,显示其免疫机 制活性。仲兆金等人从茯苓中提取分离得到三萜类化合物,并将其制备 成 个三萜类的衍生物品,实验结果表明,原三萜类化合物及其衍生物茯苓免疫功能性成分研 究与质量分析 对小鼠淋巴细胞均具有促进增殖的调节作用;王国军等人的研究结果表 明,茯苓素对小鼠细胞免疫和体液免疫有相当强的抑制作用,其浓度在 ~ /范围时,对、和诱导的淋巴细胞转化均有显著 作用,对小鼠血清抗体及脾细胞抗体均有显著抑制作用,而茯苓素达到一 定浓度后,其抑制作用不再增强钉。 .抗炎、保肝、抗衰老作用 侯安继等报道,茯苓多糖具有抑制急慢性炎症反应作用们;日本学者 从茯苓中提取分离得到多种三萜类化合物,可抑制引起的鼠耳肿和 引起的雌鼠炎症四。。金琦等人报道,茯苓三萜类化合物茯苓素对水肿 患者,有利于尿液排出,恢复肾功能,消除蛋白质,茯苓多糖具有保肝健 脾的作用引;陈春霞町发现注射液对四氯化碳引起的小鼠肝损害具有 保护作用,并可使血清谷一丙转氨酶显著降低,注射液还可能使肝脏 部分切除的大鼠的肝再生度明显提高,再生肝重和体重之比也明显提高。 侯安继等人还报道,茯苓多糖具有很好的抗动物衰老作用陆们。 .其他作用 陈焱??等发现茯苓多糖能有效防止草酸钙结石的形成,具有防石作 用;张信岳等陆发现从茯苓提取的茯苓多糖能抗单纯性疱疹病毒;日本学 者?发现茯苓三萜及其衍生物抑制蛙口服五水硫酸铜引起的呕吐,茯苓中 的三萜化合物哺使胰岛素的分化诱导活性增强,茯苓还具有抑菌作用,镇 静作用,对心血管系统的作用等哺卯。 临床研究 在茯苓现代药理学生物活性研究基础上,诸多学者报道了将茯苓或茯 苓配伍的中药复方用于临床治疗相关疾病的研究,显示了较好的临床效 果。 潘明继等人报道拍叫,用羧甲基茯苓多糖治疗胃癌和肝癌例,能使病 人食欲增加,病状改善,体质增强,减轻化疗的副作用;林熙然等用复方 茯苓汤及其冲剂治疗急性、亚急性和慢性湿疹患者,临床研究结果表明, 治愈率分别为 .%和 .%,皮损完全消退,症状消失,显示其具有湖北中医药大学届硕士学位论 文 较强的调节免疫功能作用;康爰秋等用茯苓治疗例心源性水肿,有明 显利尿作用拍;陈建南用茯苓饼干治疗水肿患者例,例治愈,例 剂后,尿频、 显效砧引;黄玉成等用苓桂术甘汤治疗尿路感染患者,服 尿急、尿痛症状消失哺;杨红等用茯苓汤治疗糖尿病 例,能明显改善糖 尿病患者的临床症状,尤其适用口燥咽干、烦渴多饮,尿频量多症;顾玉 凤等用桂枝茯苓汤治疗阑尾炎脓肿患者例,例症状完全消失们。 茯苓的开发利用 茯苓作为药食两用的传统中药,其防治疾病和保健强身的功效享有盛 誉,驰名国内外。因此,从古至今,人们十分重视该中药的开发利用,以 茯苓药材及其配伍组方开发的中成药产品和保健食品数量众多。据第三次 全国中药资源普查统计,在数以万计的中药临床组方中,茯苓的配伍率达 %以上,在医药市场上以茯苓为原料或配伍组方的中成药制剂约余 种;据 年第四届全国食用菌保健食品展销会的资料统计,以茯苓为 原料开发的保健产品数量排名第一。茯苓免疫功能性成分研究与质量分析 第二章茯苓正丁醇萃取物质部位调节免疫功能的活性物质研究 本实验室前期采用溶剂法和化学法,将茯苓药材提取物分离为不同物 质部位;通过药理学筛选,确定了正丁醇萃取物质为调节免疫功能的有效 物质部位。本章节对正丁醇萃取的物质部位的调节免疫功能的活性物质进 行了较系统的研究。 第一节正丁醇萃取物质部位的组分分离与药理筛选 采用大孔树脂纯化技术,将茯苓正丁醇萃取物质部位分离为个组 分,并对各组分进行免疫调节活性筛选,观察其在体外对正常小鼠淋巴细 胞和活化的小鼠淋巴细胞的影响,根据该调节免疫功能模型实验结 果,确定茯苓正丁醇萃取物质部位调节免疫功能的生物活性组分。 仪器与试药 .试验药材 茯苓药材购于湖北省罗田县九资河镇,并经湖北省中医药科学研究院 王克勤教授鉴定为多孔菌科真菌属茯苓肋,力.的 干燥菌核; .试验动物 雄性 /小鼠,由上海市华生动物实验中心提供; .试剂与仪器 试剂:%食用酒精;磷酸盐缓冲盐水;溶液/; 刀豆蛋白 购于 公司; 培养基;二甲基亚砜 ,分析纯;乙酸乙酯、正丁醇等其他化学试剂均为分析纯。 河 仪器:中试提取设备湖北中医药大学;多级闪蒸器 南金鼎科技;?公司酶标仪型;公司二氧化碳 培养箱;孔细胞培养板;倒置光学显微镜;台式离心机;微量加样器; 血球计数板;湖北中医药大学届硕士学位论文 方法与结果 .茯苓提取物正丁醇部位不同极性分离组分的制备 取茯苓药材,适当粉碎,%乙醇回流提取两次,乙醇用量分 别为药材量的倍和倍,提取时间分别为.和.,抽滤,合并提 取液,减压浓缩回收乙醇,得乙醇提取物; 取乙醇提取物,加适量水分散,用乙酸乙酯萃取多次,水液再加水饱 和的正丁醇多次萃取,合并正丁醇萃取液,回收溶剂,得正丁醇部位; 取正丁醇部位,用纯净水溶解,将水溶液经大孔树脂分离,依 次用水、 %、%、/、%、%的乙醇溶液洗脱,收集各部分洗脱液, 减压回收溶剂,所得分离组分依次为、、、、、。 分离流程见图: 茯苓扮末 厂??塑号取 乙醇提职液 醇不客物 诫压回收乙醇 多糖 ?。 、二 浸营 不同溶剂涟行萃取 乙 正丁醇部位图正丁醇部位不同组分分离流程图 .茯苓有效部位的药理筛选研究 ..仪器与试药茯苓免疫功能性成分研究与质量分析 ?灭菌器材:培养瓶,孔板,剪刀,镊子,网筛 目,注射器 芯,培养皿若干,托盘酒精擦拭,紫外照射,细胞计数板,电动 移液器 ?试剂:一瓶,培养基 备用: /小鼠,烧杯一只加少量%酒精 ..供试样品溶液的制备 取上述各组分药物适量,加溶剂配制成药物母液/,: :;取母液,先用 稀释至 倍体积,再用无血清 稀释至倍作为高浓度;取适量高浓度母液稀释至倍体积作为中 浓度,然后稀释倍作为中低浓度,再稀释倍作为低浓度。各浓度依次为 /, /, /, .?/。 ..药物对小鼠正常淋巴细胞的影响 ...小鼠脾淋巴细胞制备 小鼠禁水禁食 ,摘眼放血后断颈处死,于超净工作台中无菌开腹, 取出脾脏置盛有 的平皿中清洗,去除血液,吸去;再次用 在平皿中清洗;转移至目不锈钢网上,用无菌注射器芯轻轻 挤压研磨,并用轻轻冲洗钢网,使细胞过网入溶液中,制成脾细胞溶 液;离心 弃去上清液,加 培养基,在光学显微镜 下计数,稀释成每毫升约 个细胞的细胞悬液。 ...细胞给药培养 /, 取孔细胞培养板,每孔接种淋巴细胞悬液 置于。、%:培养箱中培养。小时后取出细胞培养板,每孔加入培养液 ,同时每孔加入 不同稀释 浓度的药物;空白对照组加 培养液 。每组浓度设个复孔;药物自身无色不会对光吸收造成 影响,故不加设背景对照组。置入?、%:及饱和湿度的培养箱培 养。 ...细胞活性测定 实验终止前小时取出细胞培养板,先在倒置显微镜下观察,然后每湖北中医药大学届硕士学位 论丈 . 孔加入溶液 /;培养结束后,用微量加样器小心吸 弃上清,每孔加入 ;待还原产物完全溶解, ,振荡 在酶标仪上选择以 为检测波长, 为参考波长测定光密度值 值;计算细胞的存活率,并以药物浓度和细胞存活率作图,实验重复三 次。 计算细胞的存活率: % 细胞存活率【试验组平均值】/【空白对照组平均值× 所得实验结果以平均值?偏差表示,采用软件进行统计学分析, 作图;以药物浓度为横 坐标,细胞存活率为纵坐标,绘 制药物作用的浓度曲线,用以评价不同浓度的提取物对正常 /小鼠 的脾脏淋巴细胞的毒性。结果见图。 .蕾暑盎薏一 舱加博?加 图?提取物对正常小鼠的脾脏淋巴细胞的毒性 ..提取物对体外异常增殖的淋巴细胞的调节作用筛选 ...小鼠原代脾脏淋巴细胞制备 制备方法同...。 ...淋巴细胞异常增殖实验 取孔细胞培养板,每孔接种上述细胞悬液 ,于?和 %:培养箱中培养。小时后取出细胞培养板,实验组每孔加入刀豆蛋 白 终浓度为/,同时加入不同稀释浓度的药物每 孔 ;对照组加刀豆蛋白 终浓度为/及培养液茯苓免疫功能性成分研究与质量分析。每组浓度设个复孔。置?、%:及 饱和湿度的培养箱培 养。 ...细胞活性测定 测定方法同...。所得实验结果以平均值?标准偏差表示,并在 软件中进行统计学分析,软件作图;以浓度为横坐标,细胞 相对存活率为纵坐标,绘制药物作用的浓度曲线,用以评价不同浓度的提 取物对小鼠体外异常增殖的淋巴细胞的影响,结果见图。 ? 加 鲫 如 一售零参善号 / 图?药物对小鼠体外异常增殖的淋巴细胞的影响 综合分析图和图表明,号样品有明显免疫增强作用,且 能协同刀豆球蛋白作用,进一步促进淋巴细胞增殖;号样品 和号样品低浓度时有免疫增强作用,并可一定程度协同刀豆球蛋白作 用促进淋巴细胞增殖,高浓度具有免疫抑制作用;号样品表现为免疫 抑制活性;而 和 号样品活性不明显,且有一定细胞毒性。 讨论 本实验室前期研究表明,茯苓乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯萃取物 质部位具有双向免疫调节活性,正丁醇萃取物质部位有较好的免疫增强作 用。 采用大孔树脂纯化技术,从茯苓提取物的正丁醇莘取物质部位分离获 得六个组分,调节免疫活性筛选结果表明,样品、、、有免疫湖北中医药大学届硕士学位论文 调节活性,其中样品呈现较强的免疫增强活性,样则具有免疫抑制 作用以上药理筛选实验是在华东理工大学刘建文教授指导下完成。在 此基础上,还研究了各样品对淋巴瘤细胞的影响,结果表明各样品对小鼠 淋巴瘤细胞和人淋巴瘤细胞均有抑制作用,呈现出 抑制淋巴瘤的趋势。这与文献报道茯苓调节免疫功能的生物活性相一致 拍钉?钉??。因此,本实验的研究结果为进一步分离茯苓调节免疫功能和抑 制淋巴瘤的活性成分提供了参考依据。茯苓免疫功能性成分研究与质量分析 第二节免疫功能活性组分的成分分离与结构鉴定 药理活性筛选试验表明,茯苓提取物正丁醇萃取物质部位经大孔树脂 分离纯化得到的、、、组分具有免疫调节活性。本实验通过硅 胶柱色谱、凝胶柱色谱、中低压制备液相以及半制备高效液相色谱等分离 方法,从上述个活性组分中分离得到了个单体成分,采用、 、等波谱分析方法,鉴定了其中的个化合物。 仪器与试药 仪器:仪: ,美国;、 仪: 美国瓦里安公司;旋转蒸发仪上 海亚荣生化仪器厂;硅胶试剂级青岛海洋化工厂生产;中低压分离纯化仪上海利穗公司; 液相 色谱仪; 型超声波清洗仪昆山市超声仪器有限公司;型电子天平十 万分之一德国; 试药:茯苓药材为湖北罗田九资河产,并经湖北省中医药研究院王克 勤教授鉴定;高效液相用乙腈为色谱纯,水为重蒸馏水,其它试剂均为分 析纯。 活性组分的成分分离 . 组分的分离 取组分即水洗部分干燥粉末.,加水溶解,滤过,采用 中低压制备液相色谱分离【分离条件:反相。。分离柱× , 啪,紫外检测波长为,监测波长为,流动相甲醇 %, % :.甲酸水溶液, %梯度洗 脱】,分别收集.、.峰位的洗脱液;冷冻干燥,得到分离物 、的干燥粉末,分别用%甲醇水溶解,经葡聚糖凝胶 纯化,甲醇一水:洗脱,收集洗脱液,经检测纯度,合并 相同洗脱液,冷冻干燥,得单体成分 和单体成分 。 分离流程见图:湖北中医药大学届硕士学位论文 . 分离物 分离物 凝胶柱, 凝胶柱, 甲醇一水洗脱 甲醇~水洗脱 单体 单体 图 组分的分离流程图 . 组分的分离 取组分即 %乙醇洗脱部分干燥粉末.,加水溶解,滤过, 采用 中低压制备色谱分离【分离条件如下,反相分离柱 ,啪,紫外检测波长为,监测波长为,流动 相甲醇:.%甲酸水溶液, %, % % . 、 梯度洗脱】,分别收集 .峰位的洗脱液。减压回收部分溶 剂,冷冻干燥,得到分离物?和的干燥粉末;分别用 %甲醇一水溶解, 经葡聚糖凝胶 纯化,甲醇一水:洗脱,收集洗脱液, 检测纯度,合并相同洗脱液,冷冻干燥,得单体成分 和单体成分 。 分离流程见图: ×. 分离物? 分离物 凝胶柱, 甲醇一水洗脱 徽洗脱 甲醇一水洗脱 ’ 单体 单体 图 组分的分离流程图 . 组分的分离茯芩免疫功能性成分研究与质量分析 取组分即 %乙醇洗脱部分干燥粉末.,加氯仿一甲醇: 溶解,滤过,浓缩滤液,加硅胶 目拌匀,挥干溶剂; 经常压硅胶 目柱色谱分离,依次用氯仿,氯仿一甲醇:, 甲醇洗脱,收集氯仿一甲醇洗脱液,减压回收溶剂;残余粉末加硅胶 目拌匀,再经常压硅胶 目柱色谱分离,依次用 氯仿一甲醇:、氯仿一甲醇:、氯仿一甲醇一水::. 洗 脱,经薄层色谱检识,合并收集相同成分流分,减压干燥,得分离物、 ?、。分离物和分别经葡聚糖凝胶 纯化,氯仿一 甲醇:洗脱,收集洗脱液,经检测纯度,合并相同洗脱 液,冷冻干燥,得单体成分和 。 分离物用乙腈一水:溶解,滤过,滤液采用 中低压制备液相色谱分离【分离条件:反相分离柱×,啪, 紫外检测波长为,监测波长为,流动相乙腈:.%甲酸 水溶液,%,?%%,% .、 .所在峰处的洗脱液;减压回收部 梯度洗脱】,分别收集 分溶剂,冷冻干燥,得到分离物和,再分别经葡聚糖凝胶 纯化,得单体成分 和。 分离流程见图: . 硅腋柱色谱分离 氯仿。氯仿.甲醇:,甲醇洗脱 氧仿.甲酿:洗月兑物 , .洗脱 分离物垤 分离物 分离物 角皇斑纯竺栏讹 毳墨曩嚣骱氰 荤体成分 单体成分 ??二?“ 洗脱物. 洗脱物? . 凝胶柱纯化 ;疑胶柱纯化 单体成分牟鲜本届苦分 图 组分的分离流程图湖北中医药大学届硕士学位论丈 . 组分的分离 取组分即%乙醇洗脱部分干燥粉末.,加氯仿一甲醇: ? 溶解,滤过,浓缩滤液,加 硅胶 目拌匀,挥干溶剂; 常压硅胶 目柱色谱分离,依次用氯仿,氯仿一乙酸乙酯: ,甲醇洗脱,收集氯仿一乙酸乙酯洗脱液,减压回收溶剂;残余粉末加 硅胶 目拌匀,再经常压硅胶 目柱色谱分离, 依次用氯仿一乙酸乙酯:、氯仿一乙酸乙酯:、氯仿一乙酸乙酯 :洗脱,洗脱液经薄层色谱检识,收集相同流分洗脱液,减压干燥, 得分离物和。 分离物采用半制备高效液相色谱分离,分离条件:反相分离柱 .× ,,紫外检测波长为 ,流动相乙腈:.%甲 酸水溶液, %等度洗脱,收集 .峰位的洗脱液; 减压回收部分溶剂,冷冻干燥,得到单体成分 。 分离物?采用 中低压液相色谱分离【分离条件:反相 , 分离柱×,,紫外检测波长为,监测波长为 流动相乙腈和.%甲酸水溶液,梯度洗脱: %,%,%一%,流速为.一, 自动收集条件为每管收集 ,收集指令为全收】,在 中 低压液相分离色谱图中有较明显个峰,合并收集相应部分的洗脱液,冷 冻干燥,得白色粉末和及淡黄色粉末。各粉末经纯化,以氯仿一甲醇:为洗脱剂洗脱,分离得乳白 色针晶 , 和淡黄色成分 。 分离流程见图:茯苓免疫功能性成分研究与质量分析 . 硅胶柱色谱分离 氯仿,氯仿.乙酸乙酯:,甲醇洗脱 , 氯仿.乙酸乙酯:洗脱物 分离物? 分离物 中低压制备分 高效制备液相分离 梯度洗脱 单体成分 洗脱物? 洗脱物? 洗脱物? ?凝胶柱纯化凝胶柱纯化凝胶柱纯化 毒 毒 毒 单体成分 单体鼢 单体鼢 图组分的分离流程 化学成分的结构鉴定 .化合物的鉴定白色粉末, 反应呈阳性,/: 【】一,结合? 和谱数据推算,分子式:。;。。显示有个碳信号,.处有一个碳信号,表明有羰基存在,结合?图谱数 据,可 以初步推断为取代糖结构。 .为糖端基碳信号, .,,. 为糖端基质子信号,根据其偶合常数可以知,位在【位上。因 . ?结构的影响,至位化学位移向高场移动,说明取代在位。 ,为与羰基相连甲基质子信号, .为酰胺碳的化学位移值。 核磁波谱数据归属:,:.,,,. , ,?,. ,,一,. ,,,. ,,一,. ,,一,.,,,.,.,,一,一;? . : , .,.,.,. 一,.,.。综合分析,鉴定化合物为乙酰氨 基葡萄糖,其波谱图见附图和,化学结构式如下: 湖北中医药大学届硕士学位论文 一一乙酰氦基一一葡萄糖? ?? .化合物的鉴定 白色结晶,/:】, 】。;结合?和? 谱数据推算,分子式为,。:。:。从图谱数据可知,该化合物 的个碳分别有个位于 之间,为碳糖信号;个位于 .? ?之间,说明有碳碳双键和碳氧双键片段存在。?显示, . .有个糖碳质子信号, ,,.为糖端基质子信号。 . ,,.和 .,,.说明碳碳双键上各连. , 一个质子。 .,且分子中有原子,推断结构中含有两 个酰胺基团。 核磁波谱数据归属:。 :.,,’,. ,,一’,.,,一’,.?. ,,’,’,. . ,,’,. ,,,.,,一;”,: 一’,.’,. 一’,.一’, .’,., .,波谱数据 .一, ., 与文献报道一致。综合分析,鉴定化合物为一脲苷,其 波谱图见附图和,化学结构式如下: 一脲苷 .化合物的鉴定 /: 白色粉末, 反应呈阳性, 】一,结合数 据推测其分子式:,。,。”图谱显示有 个碳信号,分别为两组 五碳糖信号,说明该糖在此溶液中,以【和侈两个构型按照一定比例同时茯芩免疫功能性成分 研究与质量分析 存在。图谱数据及归属如下:?,:.,.’, . . . 一’, 一,.一’,., 一,. ’,.,.’。综合分析,鉴定化合物为一吡 喃木糖?,波谱图见附图,化学结构式如下: , 一吡喃木糖 .化合物的鉴定 /: 白色粉末, 反应呈阳性, 】分子式:。:: :。。。初步推断为二糖,所显示的 个碳信号可以分为两组,且两 组信号值差异很小,仅在、和为略有不同,推断二者构型在此有差 .、 异。碳化学位移值 .和氢信号 .,,.说 .、 . 明有葡糖糖;而 .和氢信号 ,,. 说明与一葡糖糖相连端基碳上为【一苷键。根据图谱,验证各氢 连接顺序。碳谱数据及归属如下:,:.,. ’,.一,.’,.,.’,., .’,.一,.’, ., .’。综合分析并 借助和数据库,鉴定化合物为【吡喃甘露糖葡 糖糖【卜? ,波谱图见附图, 和,化学结构式如下: . 一?蘸甘露糖一葡糖糖一?? .化合物的鉴定湖北中医药大学届硕士学住论丈 ? 白色粉末氯仿一甲醇;易溶于吡啶,可溶于甲醇; 反应呈阳性;? /:【】;结合谱数据,推测其 ?。 分子式为:。;: 分析图谱,在高场区 ..,有多个甲基单峰信号及堆积 ..显示有 呈山状的、:质子信号,显示出三萜类结果特征; 质子存在,底场区 ..有三个烯碳质子信号。从”谱可 以得出,具有个碳, 有 个碳信号,说明为三萜的伯、仲、 叔和季碳区域,其中有个。信号; 有个信号, 有个烯碳, .为信号。谱显示,个羟基碳的化.,., 学位移分别为位 位 .,.和 位 .,. 。谱推断出各、的相互连接情况,进一步验证了上诉推测。 :. 核磁波谱数据归属如下:?, ,,一 ,,,. ,,,. ,.,.,,一,一,.,,一,. ,,一 ,. ,,一 ,, ,. ,, ,.,,一,. ,.,, ,.,.,,一,. ,, ,. ,,;?, 一,:.一,..一 , .一,.一, .一, .一, .一, .一 ,.一 ,.一 ,. , .一,.一 , .一 .一 .一 , ,.一 ,.一 , , ,. . , ,.,. , .一,. .一 . ,. ,. ,.一, , .一, 。【, 综合分析,鉴定化合物为 , 【一三羟基一羊毛甾, 【, ,一三烯一酸, , 【一?一, 【羟基去氢土莫酸 【一 ,,即 。波谱图见附图至,化学结构式如下:茯苓免疫功能性成分研究与质量分析 羟基去氢土莫酸 ?× .化合物的鉴定 细小白色针晶氯仿一甲醇;易溶于,微溶于氯仿、甲醇; ?反应呈阳性;? /:】,结合数据推 ?。 测出其分子式为,,:;: 核磁波谱数据归属如下:? , ,. ,, 一,.,,一 ,.,, ,.,. ,,一,一,. ,,一,.,,一,.,, ? ,. ,,一 ,.,, ,. ,, ,. ,, ,. ,,一,.,.,; , :.一,.一, .,., ., .一, .一, .一, . .,. , , .一 .一 , ,. , . . ,. , .一 . , , .一 ,.一 , .,., 一 , .一,. ,.,. , . , .一,., ,其?和”数据与文献酣 报道数据一致。综合分析,鉴定化合物为 一乙酰氧基 【一羟基一 羊毛甾一,一二烯一卜酸 【?, 一卜 ? 一 ,即茯苓酸 。其波谱图见 附图和,化学结构式如下:湖北中医药大学届硕士学住论丈 ?? 茯苓酸 的鉴定 .化合物 白色针晶氯仿一甲醇;易溶于吡啶,微溶于氯仿一甲醇的混合溶剂; 反应呈阳性;? /:【】,结合数 据推测出其分子式为,,。。,;:?。 ,,:. ,, 核磁波谱数据归属如下:? ,.,,,.,, ,.,. ,,一,一,.,,一,.,, ,., ,一,.,, ,.,,一 ,. ,, ,.,,,.,.,,一,.,, ,. ,, , ;” :.,., .,.一,.一, .一, .一, .一, .一, .一 , .一 ,.一 ,.一 ,.一,.一 . .一 .一 .一 ,.一 , , , ,.一 , ,.一 ,.一 , .一,.一,.一 , . .一 .’ ,.一 , , ., .一,, .,‘。其?和数据与文献的报道数据一致。 综合分析,鉴定化合物 为 一乙酰氧基 【一羟基一羊毛甾一, , 【一 一三烯一酸, , , 。波谱图见附 ,即去氢茯苓酸 图和,化学结构式如下:茯苓免疫功能性成分研究与质量分析 去氢茯苓酸.化合物 的鉴定 白色粉末氯仿一甲醇;易溶于吡啶,溶于氯仿一甲醇的混合溶剂; ?反应呈阳性;? /:【】,结合数据 推测出其分子式为,。;。.;: 。 核磁波谱数据归属如下:? ,,:.,, 一,.,,一,.,, ,.,. ,, ,,一, ,. ,. ,,一 ,., ,,. ,, ,. ,,一 ,. ,, . ,. ,,一 ,, ,. ,,,.,. ,,一;?, :.,., .一,.一,.一, ., ., ., .一,.一 ,.一 ,. ,. ,. , .一 . . . . ,. , , , , .一 , ,.一,.一 , .一,. ,. 一 .一 . . , , , ., , . 。其?、谱数据与文献啦的报道数据一致。综合分析, 鉴定化合物 为 , 【一二羟基一羊毛甾一,一二烯酸, 【一 ? , ? 一, ,即土莫酸 。其波谱图见附图,化学结构式如下:湖北中医药大学届硕士学位论文 土莫酸 .化合物 的鉴定 白色针晶氯仿一甲醇;易溶于吡啶,溶于氯仿一甲醇的混合溶剂; /: ?反应呈阳性;? /:【】; .】,结合数据分析,推测其分子式为。。。。,;: ?。 核磁波谱数据归属如下:?,,:. ,, ,一,.,,一, ,.,,一 ,.,. ,,一, ,. ,, ,. ,,,.,,一;,?: .一,.一,.一,.一, .一, .一, .一, .一, .一,.一 , .一 ,. 一 ,.一 ,.一 ,.一 ,.一 ,.一 , . .一 .一 , ,.一 , ,.一,.一 . .一 .一 , .一, ,.一, ,.一, ,.。 其?、谱数据与文献的报道数据一致。综合分析, 鉴定化合物为 一羟基羊毛甾一,烯酸, ,。波谱图见附图和,化学结构 式如下:茯苓免疫功能性成分研究与质量分析 一羟基羊毛甾一.一二烯一酸 一? ? ??一.一 讨论 .本实验通过硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、中低压制备液相以及半制 备高效液相色谱等分离方法,从上述个活性组分中分离得到了个单 体成分,采用、”、等波谱分析方法,鉴定了其中的个 其分别为 乙酰氨基葡萄糖 化合物。 ???,一脲苷,一吡喃木糖? , 吡喃甘露糖葡糖糖?一【【, , 【一三羟基一羊毛甾 卜?, , ,一三烯一 一酸 【一 一酸 , 一乙酰氧基 【一羟基一羊毛甾一,一二烯一 , 一乙酰氧基 【一羟基一羊毛甾 【一 , , , ,一三烯一一酸, 一羟基 二羟基一羊毛甾一,一二烯酸 羊毛甾一,一二烯一卜酸 ??一, 一。其中,化合物、、和为首次从茯 苓药材中分离得到。 .分析单体成分、和的、、和 图谱数据可知,这三个化合物属于三萜苷类成分。此类成分在茯苓相关文 献中尚未见报道,说明茯苓的化学成分中存在三萜苷类物质。其结构有待 进一步解析。湖北中医药大学 届硕士学位论丈 第三节茯苓免疫调节活性成分药理筛选研究 本试验对上述分离得到的个化合物进行了免疫功能活性筛选,观 察其在体外对正常小鼠淋巴细胞和刀豆蛋白活化的小鼠淋巴细胞以 及混合淋巴细胞增值率的影响,进一步筛选出茯苓调节免疫功能的活性成 分。 仪器与试药 .试验药物 茯苓正丁醇部位分离所得个化合物的干燥粉末。 .试验动物 雄性小鼠,由湖北省疾病预防控制中心实验动物中心提供,动物合格 证号:,许可证号鄂。 .仪器与试药 试剂:磷酸盐缓冲盐水;溶液/;刀豆蛋白 购于公司;培养基;二甲基亚砜,分析纯; 仪器: ?公司酶标仪型;公司二氧化碳培 养箱;孔细胞培养板;倒置光学显微镜;台式离心机;微量加样器; 目, 血球计数板;灭菌器材:培养瓶,孔板,剪刀,镊子,网筛 注射器芯,培养皿若干,托盘酒精擦拭,紫外照射,细胞计数板, 电动移液器。 备用:小鼠一只,烧杯一只少量 %酒精 方法与结果 .供试样品溶液的制备 取上述个化合物粉末,分别加溶剂::配制成药 物母液 稀释 倍,然后再 /,储存;取母液于 用无血清稀释.倍作为高浓度供试液;在此基础上再稀释倍作 为中浓度供试液,再稀释倍作为低浓度供试液。各浓度依次为约 /, /, /。 .药物对小鼠正常淋巴细胞的影响茯芩免疫功能性成分研究与质量分析 ..小鼠脾淋巴细胞制备 小鼠禁水禁食 ,摘眼放血后断颈处死,于超净工作台中无菌开腹, 取出脾脏置入已盛有 的平皿中清洗,去除血液,吸去;再 次用 清洗;转移至 目不锈钢网上,用无菌注射器芯轻轻挤 压研磨,并用轻轻冲洗钢网,使细胞过网入溶液中,制成脾细胞悬液。 离心 ×弃去上清液,加 培养基,在光学显微镜下计 数,稀释成每毫升约.× 个细胞的细胞悬液 ..细胞给药培养 . / 取孔细胞培养板,每孔接种淋巴细胞悬液 个,置于。和%:培养箱中培养。 小时后取出细胞培养板,每 ,同时每孔加入 ; 孔加入培养液 不同稀释浓度的药物每孔 空白对照组加培养液 。每组浓度设个复孔;药物自身无色不会 对光吸收造成影响,故不加设背景对照组;置?、%:及饱和湿度 的培养箱培养。 ..细胞活性测定 实验终止前小时取出细胞培养板,先以倒置显微镜下观察,然后每孔加入溶液 ,终浓度为. /;培养结束后,用微量加样 器小心吸弃上清,每孔加入,振荡;待还原产物完或 全溶解,在酶标仪上选择以 为检测波长, 为参比波 长测定光密度值值;计算细胞的增殖率,并以药物浓度和细胞的增 殖率作图,实验重复三次