硝酸还原酶活性的测定

硝酸还原酶活性的测定 赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》) 参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27,29 硝酸还原酶活性的测定 原理 硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮 简单易行，在一般条件下都能做到。 红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。 仪器药品 721型分光光度计 真空泵(或注射器) 保温箱 天平 真空干燥器 钻孔器 三角烧瓶 移液管 烧杯 0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5(见附2)。 0.2mol/L KNO3:溶解20.22g KNO3于1000ml蒸馏水中。 磺胺试剂:1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。 α—萘胺试剂:0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。 NaNO2溶液:1g NaNO2用蒸馏水溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。 操作步骤 1. (将新鲜取回的叶片(蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可)水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g(或每份取50个圆片)，分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中:(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+蒸馏水5ml;(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中(如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中)。将三角烧瓶置于30?温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加 保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测 3. (绘制标准曲线 与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。 吸取不同浓度的NaNO2溶液(例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml)1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟(或于一定温度的水俗中保温30分钟)，立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线。 实验作业 1(试比较不同植物的酶活性。 2(试比较取样前植物处于照光或黑暗条件下酶活性的不同。 参考文献 1(陈薇、张德颐:1980。植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化，植物生理学通讯，1980(4):45—49。 2(周树、郑相穆:1985。硝酸还原酶体内分析方法的探讨，植物生理学通讯，1985(1):47—49。 3(Hageman,R.H.and D.P. (Hucklesby:1971.Methods in Enzymology,23A:491—503. 4(Radin.J.W.:1973.Plant Physiology,51:332—336. 5(Snell,F.D.and C.T.Snell:1949.Colorimetric Methods of Analysis,Vol.II,802—807 硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法:(1g样)(参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27,29) 亚硝酸钠标准溶液(1µg/ml):称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml，再吸5ml定容到1000ml。 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液:30.0905g Na2HPO4?12H2O + 2.4965g NaH2PO4?2H2O，加蒸馏水定容到1000ml。 3mol/L HCl:125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml。 1, 磺胺溶液:5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中。 0.2, a-萘胺溶液:1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml，贮于棕色瓶中。 0.1mol/L KNO3溶液:5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液。 0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液:Na2HPO4?12H2O 8.8640g + NaH2PO4?2H2O 0.0570g，加蒸馏水定容到1L。 提取缓冲液:1.211g半胱氨酸 + 0.372g EDTA，溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的 磷酸缓冲溶液。 2mg/ml NADH 溶液:0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液 (临用前配制)。 首先标制作准曲线: 取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂，即配成0,2.0μg的系列标准亚硝态 氮溶液。摇匀后在30?保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下 比色。以亚硝态氮(μg)为横坐标(x)，光密度值为纵坐标(y)绘标准曲线 或建立回归方程。 各试剂加入顺序 管 号 1 2 3 4 5 6 7 亚硝酸钠标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 1, 磺胺溶液(ml) 4 4 4 4 4 4 4 0.2%α-萘胺(ml) 4 4 4 4 4 4 4 每管含NO2- (μg) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1g +15ml提取缓冲液后研磨匀浆，转移到离心管中于4?、4000r/min下 离心15min,上清液即为粗酶提取液，用于硝酸还原酶(NR)的测定。 0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液 + 0.4mlNADH溶液后混匀(对照不加NADH 溶液，而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替)，在25?水浴中保温30min。 保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml 0.2, a-萘胺溶液，显 色反应15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸 光度。根据回归方程计算。