原料血浆及血浆蛋白制品中人细小病毒B19 DNA检测与分析 _607

原料血浆及血浆蛋白制品中人细小病毒B19 DNA检测与分析 _607 原料血浆及血浆蛋白制品中人细小病毒B19 DNA检测与分析 王敏，马秋平，于传飞，侯继锋 (中国药品生物制品检定所，北京100050) 摘要 目的:用实时荧光定量PCR方法，检测原料血浆及血液制品中的人细小病 毒B19 DNA，分析人细小病毒B19在献浆员中的感染率及血液制品的污染情况。 方法:PCR引物探针区域在B19基因组编码区高度保守区的2000,2300bp 之间，对2276份单人份血浆、血液制品成品静注人免疫球蛋白、人凝血因子?、 凝血酶原复合物及纤维蛋白原进行B19 DNA检测。 结果:2276份献浆员血浆样 本，9份初筛阳性，对初筛阳性样本复测3次，确认阳性4份。对血液制品成品 进行检测，静注人免疫球蛋白样本84批，均为阴性;人纤维蛋白原样本14批， 1批确认阳性;人凝血因子?样本25批，9批确认阳性;人凝血酶原复合物样品 24批，18批确认阳性。 结论:PCR检测原料血浆及血液制品中的人细小病毒B19 DNA，原料血浆阳性率以及在血液制品的污染情况，与国外有关文献报道基本一 致。本研究结果为今后进一步研究奠定了良好基础。 关键词 B19病毒;实时荧光PCR;献浆员;血液制品 Detection and analysis of human parvovirus B19 DNA in source plasma and plasma-derived medicinal products WANG Min, MA Qiu - ping, YU Chuan-fei, HOU Ji - feng (National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Product, Beijing, P. R. China,100050) Abstract Objective: Using fluorescence based real time quantitative PCR to detect the human parvovirus B19 DNA, determine the frequency of infection in plasma donors and contamination in plasma-derived medicinal products. Methods: Using the highly conserved sequence between 2000~2300bp in the coding regions of B19 genome as primers, 2276 individual human plasma samples, intravenous immunoglobulin, coagulation factor VIII, prothrombin complex and ________________________ 国家科技支撑计划项目(No.2008BAI54B08) 第一作者 Tel(010)67095262;E-mail:mickeywang@163.com 通讯作者 Tel(010)67095338;E-mail: houjf@nicpbp.org.cn fibrinogen were assayed by quantitative PCR. Results: Among the 2276 individual human plasma samples, 9 samples were positive, and of the 9 positive samples 4 were confirmed positive after repeated test for 3 times. 84 batches of intravenous immunoglobulin were all negative; One batch was confirmed positive in 14 batches of human fibrinogen; 9 batches confirmed positive in the 25 batches of factor VIII and 18 batches positive in 24 batches of prothrombin complex. Conclusion: Qualitative PCR detection of human parvovirus B19 DNA demonstrates overall information about its infection in plasma donors and contamination in plasma-derived medicinal products. The positive frequency in the source plasma and plasma products are similar to those reported in the foreign literatures. This study will build up a good foundation for further research. Key word: human parvovirus B19; real time quantitative PCR; plasma donors; plasma-derived medicinal products [1]人细小病毒B19是已知唯一对人类致病的细小病毒，病毒无包膜，耐热， [2]直径约18,20nm，基因组为单链线状DNA分子，约5.5kb，并且对热灭活有 [3~6]抵抗性。B19病毒有普遍易感性，晚冬和早春是感染高峰，几乎成世界范围 分布。B19病毒因感染因被感染个体的年龄和免疫状态不同，临床表现也不相同。 儿童感染该病毒可引起传染性红斑;成年妇女感染后可引起短暂的多关节炎或关 节痛;孕期感染可引起自然流产和胎儿水肿或死胎;潜在的红细胞缺陷如镰刀型 细胞贫血病人感染B19病毒后，有可能引起严重的再生障碍危象;持续细小病 [7~9]毒感染可导致慢性骨髓障碍，而免疫缺陷病人会导致慢性贫血。据文献报道 8长期接受凝血因子类产品(产品中病毒含量大于10geq/ml时产生抗体，小于 3.5[10]10geq/ml不产生抗体)治疗的患者体内抗B19抗体显著升高。大约60%的 28[11]生产用混合血浆含10到10 gce /ml(genome copy equivalents )，经S/D处理 68后的血浆仍有23,含有B19 DNA病毒且滴度高达10-10geq/ ml，而混合血浆 [12]中IgG滴度约为44IU/mL不足以中和抗原。目前美国食品药品监督管理局已 4规定对混合血浆进行B19病毒DNA检测,对于B19病毒DNA浓度超过10拷贝 /ml的混合血浆应废弃不予使用，如果高病毒载量的捐赠者血浆在混浆前没有检 [13]测并及时剔除的话，会有5%到15%的混合血浆不能用于血液制品的生产。因 此，建立原料血浆B19 DNA检测方法，并对原料血浆进行检测，确保血液制品 安全性显得尤为重要。 B19病毒因其独特的特性，对现行的病毒灭活具有较强的抵抗力。因此， 加强原料血浆筛查以降低生产用原料血浆病毒含量是确保制品安全性的重要手 段之一。PCR技术具有操作简便、结果直观、重复性好、特异性强、能准确定量等优点。用PCR方法对国内血制品病毒的污染情况进行调查分析，以期对产品的生产工艺改进和质量控制提供依据。 1 材料与方法 1.1 试剂及仪器 1.1.1 血浆标本 合格献浆员血浆，为稻黄色澄清液体，无乳糜、无纤维蛋白析出、无溶血、无异物。样本的采集、运输及保存符合血液制品生产用人血浆规程。 1.1.2 血液制品 静注免疫球蛋白，人纤维蛋白原，?因子、凝血酶原复合物等，均为批签发合格制品。 1.1.3 诊断试剂 B19病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒, 中山大学达安基因股份有限公司生产。 1.1.4 荧光定量PCR仪 7500实时荧光PCR系统 美国ABI公司产品。 1.1.5 高速冷冻离心机(H-103NR)科库森日本 1.1.6 高速离心机(Z 323K) 德国 1.1.7 恒温水浴箱(SWB 2D) 德国 1.1.8 生物安全柜(BHC 1300IIA) 苏州中国 1.2 方法 按照试剂盒说明书操作程序进行 1.2.1 核酸DNA提取 取1.5 mL灭菌Eppendorf管作好标记，样品解冻。先加入100μL 裂解液，然后分别加入被检样品、阴性对照及阳性对照各100μL，充分混匀后，100?恒温处理10分钟;12,000rpm离心5分钟，备用。 1.2.2 扩增 取上清液2μL，加入反应管中，8,000离心数秒。参照试剂盒说明书方法设定程序进行扩增，见表1。 表1 荧光定量PCR检测B19程序 Tab 1 The program of real time quantitative PCR to detect the human parvovirus B- 19 DNA 程序(program) 循环(cycle) 温度(temperature?) 时间(time) 1 1 93 2 min 2 10 93 45s 55 1min 3 30 93 30s 55 45s 3 1 55 45s 1.2.3 结果判定 试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和CT值判定结果。 阴性质控品:检测通路荧光信号无增长，无典型S型扩增曲线;阳性质控品:呈S型扩增曲线。以上要求需要同时满足，否则本次实验无效。利用ROC曲线法确定本试剂盒的参考值为27。 1.2.3.1 阳性结果判定标准: 荧光信号增幅明显，呈典型S型扩增曲线，且CT值小于等于27。 1.2.3.2 阴性结果判定标准: 检测通路荧光信号无增长，无典型S型扩增曲线。 1.2.3.3 灰度区结果判定: 荧光信号增幅明显，呈典型S型扩增曲线，但CT值大于27。处于灰度区的样本经复检符合阳性结果判定标准或仍处于灰度区均判定为阳性，符合阴性结果判定为阴性。 2 结果 2.1 经荧光定量PCR技术检测单人份献浆员血浆2276份，其中B19DNA阳性9份,对阳性进行复测三次，确认阳性4份。 2.2 随机抽取20个企业生产的静注人免疫球蛋白样品84批次，B19病毒DNA检测结果均为阴性; 2.3 抽取国内4家企业生产的人纤维蛋白原样品14批，B19病毒DNA检测结果1为批确认阳性，13批阴性，见表2。 2.4 抽取国内3家企业生产的人凝血因子VIII样品25批，B19病毒DNA检测结果9为批确认阳性，16批阴性，见表3。 2.5 抽取国内3家企业生产的人凝血酶原复合物样品24批，B19病毒DNA检测结果18为批确认阳性，6批阴性，见表4。 表2 人纤维蛋白原制品B19DNA检查结果 Table 2 Results of B19 virus DNA tested in human fibrinogen products 生产企业 样品批号 B19DNA检测结果 企业 A 20080406 - (manufacturer A) 20080407 - 企业 B 20080101 - (manufacturer B) 20080102 - 20080103 - 企业 C 20090601 - (manufacturer C) 20090702 - 20090803 - 企业 C 200801F001 - (manufacturer D) 200801F002 - 200802F003 - 200811F015 - 200812F019 + 200901F001 - 表3 人凝血因子?制品B19DNA检查结果 Table 3 Results of B19 virus DNA tested in human factor VIII products 生产企业 样品批号 B19DNA检测结果 200802003 + 200805007 + 200806008 - 200806009 + 企业 A 200807010 + (manufacturer A) 200807011 - 200905009 - 200906012 - 200906014 - 200907018 - 200908019 - 20060601S - 20060702S - 企业 B 20060703S - (manufacturer B) 20080101C - 20080101 - 20080102 - 20080303 - 200712H039 + 200712H040 + 企业 C 200802W006 - (manufacturer C) 200802W007 - 200803W008 + 200803W009 + 200901H001 + 表4 人凝血酶原复合物制品B19DNA检查结果 Table 4 Results of B19 virus DNA tested in human prothrombin complex products 生产企业 样品批号 B19DNA检测结果 200802003 + 200803005 + 200805011 + 200806012 + 200806013 - 200905017 + 企业 A 200905018 + (manufacturer A) 200906019 - 200906021 + 200906022 + 200907026 + 200907027 + 200907028 + 200908029 + 200908030 + 200908032 + 200801P002 - 企业 B 200811P029 - (manufacturer B) 200812P030 + 200905P020 - 20080303 - 企业 C 试20061004 + (manufacturer C) 试20061005 + 试20061006 + 3 讨论 血液制品主要通过献血员选择、血浆筛查、混合血浆检测、生产工艺病毒灭 [14]活或去除等步骤确保最终产品的病毒安全性。到目前为止，所有血液制品生产工艺中都含有一步或多部病毒灭活或去除步骤。对脂胞膜病毒(如HIV、HCV、HBV)而言，现行的原料血浆规程要求和生产工艺基本能确保制品的安全性。但对于非脂胞膜病毒，尤其是人细小病毒B19，现行生产工艺中的灭活或去除病毒方法的效果都不理想。欧美等发达国家已将人细小病毒B19纳入原料血浆的常规检测范围。所以我国有必要尽快建立原料血浆人细小病毒B19检测方法，对原料血浆和生产用混合血浆进行检测，确保制品安全并与国际接轨。 酶联免疫的方法不适合该病毒的筛查，我们采用实时荧光定量PCR检测人 细小病毒?型基因型DNA。完成了2276人份原料血浆的筛选，并对国内生产的 静注人免疫球蛋白、人纤维蛋白原、人凝血因子VIII及人凝血酶原复合物等产 品进行了检测。从目前检测结果看，国内的血液制品B19病毒污染情况略低于国 外文献报道(B19病毒DNA污染凝血因子?、凝血酶原复合物、因子?等血浆制 [12]品的比例分别达到86.18%、88.14%和66.11%)。可能与试剂盒的灵敏度及样 本量有一定关系，我们将对国内的相关制品进一步跟踪。 4根据国内目前产品性能评估结果，本试剂盒灵敏度为1.0×10copies/ml，样 本检测阴性结果仅表明B19DNA浓度低于试剂盒的灵敏度。样本收集、处理、 运送、保存及实验操作过程都将会对检测结果造成影响。应严格按原料血浆采集 规程要求采集和保存样品，并严格按试剂盒要求进行实验操作，减少假阳性和假 阴性结果。 荧光定量PCR检测在判断病毒感染方面具有重要意义，通过对国内血液制 品检测结果发现，凝血因子类产品具有较高的人细小病毒污染风险。但目前没有 患者输入凝血因子类血液制品后感染B19病毒的报道。可能原因包括，一方面是 多数患者自身体内含有的B19中和抗体中和了进入体内病毒，中和抗体起到较好 的保护作用。同时，混合血浆中含有大量的B19中和抗体，有直接的中和作用。 另一方面，B19病毒感染只对特殊人群引起较严重的症状，而且只有当血液制品 中含有较高的病毒载量时才会引发感染，目前对病毒载量与感染率之间的关系未 见文献报道。 参考文献 1 Wong S, Brown KE. Development of an improved method of detection of infectious parvovirus B19. Journal of Clinical Virology, 2006, 35:407-413 2 Corcoran A, Doyle S. Advances in the biology, diagnosis and host-pathogen interactions of parvovirus B19. Journal of Medical Microbiology, 2004,53:459-475 3 Yunoki M, Tsujikawa M, Urayama T, et al. Heat sensitivity of human parvovirus B19. Vox Sanguinis, 2003, 84:164-169 4 Ros C, Baltzer C, Mani B, et al. Parvovirus uncoating in vitro reveals a mechanism of DNA release without capsid disassembly and striking differences in encapsidated DNA stability. Virology, 2006, 345:137-147 5 Bliimel J, Schmidt I, Willkommen H, et al. Inactivation of parvovirus B19 during pasteurization of human serum albumin. Transfusion, 2002, 8,42 6 Blumel J, Schmidt I, Effenberger W, et al. Parvovirus B19 transmission by heat-treated clotting factor concentrates. Transfusion, 2002, 11, 42 7 Miyagawa E, Yoshida T, Takahashi H, et al. Infection of the erythroid cell line, KU812 Ep6 with human parvovirus B19 and its application to titration of B19 infectivity. Journal of Virological Methods, 1999, 83:45-54 8 Gallinella G, Zuffi E, Gentilomi G, et al. Relevance of B19 markers in serum sample for a diagnosis of parvovirus B19 correlated diseases. Journal of Medical Virology, 2003, 71:135-139 9 Kaufmann B, Chipman PR, Kostyuchenko VA, et al. Visualization of the externalized VP2 N termini of infectious human parvovirus B19. Journal of Virology, 2008, 8:7306-7312 10 Baylis SA, Shah N, Minor PD. Evaluation of different assay for the detection of parvovirus B19 DNA in human plasma. Journal of Virological Methods, 2004, 121:7-16 11 Prikhod ko GG, Vasilyeva I, Reyes H, et al. Evaluation of a new lightCycler reverse transcription-polymerase chain reaction infectivity assay for detection of human parvovirus B19 in dry-heat inactivation studies. Transfusion, 2005, 6(45):1011-1019 12 Schmidt I, Blumei J, Seita H, et al. Parvovirus B19 DNA in plasma pool and plasm derivatives.Vox Sanguinis, 2001, 81:228-235 13 Thomas I,Giambattista D,Gerard C, et al. Prevalence of human erythrovirus B19 DNA in health Belgian blood donors and correlation with specific antibodies against structural and non-structural viral proteins. Vox Sang, 2003, 84:300-307 14 Expert committee on biological standardization. Guidelines on Viral Inactivation and Removal Procedures Intended to Assure the Viral Safety of Human Blood Plasma Products, Geneva, 2001