全血胆碱酯酶活性测定

全血胆碱酯酶活性测定 实验五 全血胆碱酯酶活性测定 全血胆碱脂酶活性分光光度测定方法WS/T67—1996 [原理] 胆碱脂酶水解硫代乙酰胆碱,ASCH～acetyl-thilcholine,,生成硫代乙酰胆碱和乙酸。硫代胆碱与硫基现色几剂～5,5-联硫代双-2-硝基苯甲酸[DTNB～dithio-bis-(nitribenzoic acid)]反应～形成黄色化合物5-巯基-2-硝基苯甲酸,TNB,。在412nm长下比色定量。 [仪器]分光光度计～5mm比色杯,恒温水浴,离心机,血红蛋白吸管～20ul,刻度吸管～5.0ml, 2.0 ml,试管10ml,容量瓶～10ml。 [试剂] 1(1/15mol/L磷酸盐缓冲液,PH 7.4,,生理盐水:氯化钠0.85/100ml, 硫代乙酰胆碱,ASCh,溶液:称取ASCh 72.3mg～溶于生理盐水中并稀释成10ml。置冰箱中保存。临用时～以生理盐水稀释10倍,5,5-联硫代双-2-硝基苯甲酸,DTNB,溶液:称取DTMB19.8mg～滴加硫酸缓冲液并搅拌至完全溶解～溶液透明,约2ml,。再用生理盐水稀释至10ml ～置冰箱中保存。临用时～用生理盐水稀释10倍,出现黄色即弃取,毒扁豆碱溶液,抑制剂,:取毒扁豆碱约1mg～溶于1ml生理盐水中。临用时配制。严防污染其他试剂和器材。 2(巯基溶液:准确称取还原型谷胱甘肽3.07mg～用水,经煮沸并冷却的水, ml相当于1μmol谷胱甘肽。溶解并移入10ml容量瓶中～稀释至刻度。此溶液1 因谷胱甘肽易氧化～故溶液应临用时配制。 [采样、运输和保存]取10ul末梢血滴入置有肝素钠或3ml磷酸缓冲液的小试管 ?冰箱内保存～尽快分析。中～混匀～加塞。置冰瓶中运送～于4 [分析步骤] 1(标准曲线的绘制:取5支试管～按实习10—6配制标准。 以水为参比测定吸光度。从各标准管的吸光度减去0管～以酶活性为横坐标～吸光度值为纵坐标～绘制标准曲线。 2(样品测定 实习表10—6 标准管的配制 管 号 0 1 2 3 4 巯基标准溶液～ml 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 水～ml 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 缓冲溶液～ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 DTNB溶液～ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 胆碱酯酶活性～μmol/ml 0.0 20 40 60 80 1(将样品从冰箱中取出～使恢复到室温～混匀待用。如果样品是采集到肝素钠的吸管中～则加入3ml磷酸缓冲液～混匀后备用。 2(取样品液1.5ml置于另一支比色管～作为测定管。原样品管作为对照管。向对照管中加入1滴抑制剂溶液。混匀～并将两管同置于37?水浴中预温5~10min。 在37?水浴中保温过DTNB溶液和0.5mlASCh3(向两管中分别加入0.5ml预先 溶液～立即计时并混匀。在37?水浴中准确反应6min。 4(向测定管中加入1滴抑制剂溶液～混匀以终止反应。 5(离心除掉血细胞。取上清液放入5mm比色杯中～以水为参比测定管的吸光度,A,和对照管的吸光度,A,。A减去ΔA‘～得吸光度差A～查标准曲线得全血胆碱脂酶活性单位。 6(测定人血样时～以每ml血样在37? 加温6min水解基质为1单位。1μmol谷胱甘肽能提供1μmol巯基～其显色效应相当于1μmol 硫代胆碱～也相当于酶促1μmol基质,一酰硫代胆碱,的效应。现测定管取血量为0.005ml～在37?水浴中加热6min～每1ml巯基标准溶液含谷胱甘肽1μmol～故显色效应相当于0.1ml巯基标准溶液的酶活性单位为: 1μmol/ml×0.1ml×1/0.005ml=20单位 式中～0.1ml:巯基标准溶液的用量。如果试.2ml 巯基标准溶液～就相当于40单位。余类推;0.005ml:血样量。 [注意事项] 1( 采样时～应注意不得溶血～否则将干扰测定。 2( 对照管的吸光度不得超过0.07，0.08～否则说明可能是溶血或DNTB自然分解～会使测定结果偏低。