武汉地区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒基因型分析

武汉地区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒基因型 武汉地区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒基因 型分析 【摘要】  目的:了解武汉地区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒,human papillomavirus, HPV,基因型的分布情况。方法:取妇女宫颈的脱落细胞～利用基因芯片技术检测18种高危型HPV和5种低危型HPV。结果:总共检测606例～HPV总共感染391例～感染率64.5%。高危型HPV感染274例～感染率45.2%,高危型HPV感染率排在前5位的依次是HPV 16,24.6%,、HPV 18,10.4%,、HPV 58,5.3%,、HPV 33,2.8%,、HPV 56,1.5%,。仅感染低危型HPV为117例～感染率为19.3%。单一基因型感染332例～占感染人数的84.9%,两重感染53例～占感染人数的13.6%,三重感染6例～占感染人数的1.5%。结论:武汉地区妇女宫颈HPV感染率较高～主要为单一基因型感染,高危型HPV主要是HPV16和18～其次是HPV 58、33、56。 【关键词】  宫颈,人乳头瘤病毒,基因型 Analysis of Human Papillomavirus Genotype Distribution in Cervical Lesion of Women in Wuhan HU Xing wen (Maternal and Child Health Hospital of Hubei, Wuhan, Hubei 430070, China) Abstract: Objective To investigate human papillomavirus (HPV) genotype distribution in cervical lesion of women in Wuhan. Methods 18 high risk HPV(hrHPV) genotypes and 5 low risk HPV(lrHPV) genotypes in cervical lesion of women were detected by gene chip techniqe. Results Of 606 cases were detected, 391 cases were HPV positive (64.5%). 274 cases were hrHPV positive (45.2%). 117 cases were only lrHPV positive (19.3%). Among hrHPV infection, HPV16 was the most common genotype (24.6%), followed by HPV18 (10.4%), HPV58 (5.3%), HPV33 (2.8%), and HPV56 (1.5%) respectively. Among HPV infection cases, 332 cases were single HPV infection (84.9%), 53 cases were double HPV infection (13.6%), and 6 cases were triple HPV infection (1.5%). Conclusion HPV infection in cervical lesion of women was severe in Wuhan. Most of them were single HPV infection. HPV16 was the most common genotype, followed by HPV 18, HPV 58, HPV 33, and HPV 56. Key words: Cervical; Human papillomavirus; Genotype     宫颈癌是全世界妇女第二位最容易发生的癌症～每年新诊断出约470 000例～每年死亡人数达250 000,1,。HPV是宫颈癌发展的必要因素,2，5,。在感染人类的人乳头瘤病毒(HPV)中～已经测定基因序列的有100多种基因型,6,。在全世界～不同的地域～HPV流行的基因型有所差异～了解武汉地区妇女宫颈感染的HPV基因型分布情况～对监控HPV感染疫情和将来使用HPV疫苗来预防宫颈癌的发生有很重要的指导意义。 1  材料和方法 1.1  材料 1.1.1  研究对象  606例标本来自我院妇科门诊2005年1月至2006年12月诊断为宫颈上皮内瘤样变,cervical intraepithelial neoplasia CIN,?级以上 的患者～年龄16岁，60岁～平均年龄(31.5〒8.2)岁。 1.1.2  试剂和仪器  HPV分型基因芯片检测系统(亚能生物技术有限公司, 深圳), Biometra基因扩增仪(德国)～FYY 3型分子杂交仪(江苏兴化分析仪器厂)。显色液须新鲜配制, 按顺序加入以下溶液: C 液(0.1 mol/L 柠檬酸钠, pH 5.4)19 ml, 四甲基联苯胺1 ml, 体积分数3%H2O2 10 μl。20 倍SSC, 质量分数10%的十二烷基硫酸钠(SDS)、1 mol/L 柠檬酸钠均为深圳亚能生物技术有限公司提供, 用时按所需浓度加蒸馏水配制。 1.2  方法 1.2.1  标本的采集及保存方法  用专用毛刷, 紧贴宫颈口黏膜, 稍用力转动2周, 以取得脱落细胞～将取样后的毛刷放入备有1 ml无菌生理盐水的试管中, 充分漂洗后将毛刷贴壁挤干丢弃。采集的样本没有及时检测时则放在-20 ?保存。 1.2.2  样本处理方法  将漂洗过毛刷的生理盐水全部转移到1.5 ml离心管中,13 000 r/min离心10 min, 弃去上清, 保留管底的细胞块。加入50 μl裂解 液充分混合,100 ?加热10 min。13 000 r/min离心10 min, 保留上清待用。 1.2.3  HPV基因芯片检测  PCR扩增取PCR反应管一支,做好标记,于5 000 r/min离心2 s, 加入已提取的待测样品DNA 5 μl, 反应总体系为25 μl。每次实验设置一个阴性对照, 即以5 μl无菌纯水为模板。扩增条件:50 ?,15 min,95 ?,10 min,而后循环40次(94 ?,30 s,42 ?,90 s,72 ?,30 s),72 ?延伸5 min。杂交及洗膜取固定有23种HPV分型探针的膜条放入塑料离心管,加入A液(2SSC)及PCR产物,将塑料管放入沸水中加热10 min后,放入杂交箱51 ? 1杂交1 h。于51 ?轻摇洗涤15 min。膜条转移至已于杂交箱中预热到51 ?的40 ml B 液(0.5 SSC)管中, 轻摇洗涤15 min,弃液体。显色膜条置于POD溶液室温轻摇浸泡30 min,弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗2次,5 min/次。用C液室温洗膜1 min，2 min,将膜条浸泡于显色液中避光10 min左右即可见斑点显现, 若显色液较弱可适当延长显色时间, 显色完毕将膜条浸泡在水中清洗, 最后取出膜条于4 ?保存。结果判定作为阴性对照的杂交膜条会在PC位置出现蓝色斑点, 同时其他位点不应该显色, 检测用的每张膜条在PC处均应有蓝色斑点出现, 此时结果的判读视为有 效。膜条上的探针排列顺序HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、51、52、53、56、58、44、59、66、68、73、83、MM 4、PC。由斑点显现的位置即可断定HPV 的基因型。其中, 低危型: HPV 6、11、42、43、44。其他为高危型: HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM 4。 2  结果 总共检测606例～HPV总感染例数391例～感染率为64.5%。检出的基因型有低危型HPV 6、11、42和高危型HPV 16、18、31、33、35、45、53、56、58、59、68、73～见表1。未检出的基因型有低危型HPV 43、44和高危型HPV 39、51、52、66、83、MM 4。高危型HPV感染人数274例～感染率为45.2%～在高危型基因型中～HPV 16和18共占71.9%～其他基因型共占28.1%～感染率排在前5位的依次是HPV 16、18、58、33、56。仅感染低危型HPV为117例～感染率为19.3%。单一基因型感染332例～占感染人数的84.9%。两重感染53例～占感染人数的13.6%～其中～高危型和低危型混合感染32例～占两重感染的60.4%,两者均为高危型感染18例～占两重感染的34.0%,两者均为低危型感染3例～占两重感染的5.6%～见表2。三重感染6例～占感染人数的1.5%～其 中高危型和低危型混合感染5例～三者均为高危型感染1例～见表3。 表1  HPV基因型的分布,略, 表2  HPV两重感染基因型分布,略, 表3  HPV三重感染基因型分布,略, 3  讨论 武汉地区检查的606例妇女宫颈病变患者HPV感染率达到64.5%～比深圳,40.0%,,7,、广州,59.7%,,8,、广西,52.1%,,9,、粤东地区,48.3%,,10,都高～这可能与筛查的患者和检查方法有关～筛查对象的宫颈病变越严重～HPV感染率可能越高,另外～检查的基因型越多～漏检率越小～HPV的感染率也就越高。在高危型HPV感染中～武汉地区感染率最高的是HPV 16,24.6%,～其后依次是HPV 18,10.4%,、HPV 58,5.3%,、HPV 33,2.8%,、HPV 56,1.5%,等。不同的地区～流行的基因型有所不同～广州地区排在前5位的分别为HPV 52、16、51、58、68,8,～粤东地区排在前5位的分别为HPV 16、18、58、33、73,10,～香港地区 感染率最高的是HPV 16、18,11,。在非洲感染率排在前5位的分别是HPV 52、35、58、51、16,12,,在印度是HPV 16、18、33、58、35,13,,在美国是HPV 56、53、16、58、52,14,,在澳大利亚是HPV 16、18、45、39、73,15,。在世界范围内～HPV 16是与宫颈癌联系最紧密的基因型～并随地域变化很小,16,。在武汉地区HPV感染患者中～大多数是单一基因型感染～单一基因型感染占感染人数的84.9%～两重感染的占19.3%～感染基因型最多的也只有三重感染～三重感染占1.5%～非洲有些患者可同时感染有7种基因型,12,～由于HPV属于性传播疾病～患者和(或)对方性伙伴越多～多重感染的基因型可能就越多。武汉地区两重感染的主要是低危型HPV和高危型HPV混合感染～占60.4%,其次是两者均为高危型HPV感染～占34.0%,两者均为低危型HPV只占5.6%。大多数HPV感染者是短暂无症状～并且自身能够把病毒清除掉～只有持久感染高危型HPV～就会增加发展成为宫颈癌的风险性,2～17，20,。自身清除病毒, 多重基因型感染可能比单一基因型难～HPV 16是最难清除掉的基因型。妇女感染高危型HPV后～在随后的6年中发展成CIN ?级病变的风险比未感染者高210倍,21,～国外正进行研究HPV疫苗来预防HPV的感染～但HPV的基因型比较多～国外主要是研究HPV 16和18两价疫苗～一般是在第一次性生活之前13岁，14岁左右接种,22,。武汉地区高危型HPV也主要以HPV 16、 18为主～占71.9%～其他高危型HPV共占28.1%～但若接种 HPV 16/18两价疫苗～将会仍有将近30%的机会感染其他高 危型HPV基因型而不能预防。   【参考文献】   ,1, Parkin DM, Bray FI, Devesa SS. 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