展筋消痹胶囊工艺研究

展筋消痹胶囊工艺研究 摘 要 展筋消痹胶囊是在陕西省中医医院多年临床经验方基础上开发的中药新药。该药活血祛湿、除风舒筋，主要用于因血友病引起的关节变形、功能障碍，临床可见收到良效。本课题主要进行了该新药的制备工艺及临床前的相关研究。 目的:以芍药苷和干膏量为评价性的指标，采用正交实验法进行展筋消痹胶囊的最佳提取工艺和成型工艺的选取;建立了展筋消痹胶囊的质量控制;进行初步的稳定性试验以及该制剂有关的急性毒性药理试验。 方法:(1)按处方量将茯苓、猪苓和延胡索混合粉碎、过筛，考察三味药材的出 4)[54]粉率。赤芍、当归等其余七味药材用水提取，采用L(3)正交试验，以提取时9 间、提取溶剂用量及提取次数作为影响因素、芍药苷和干膏量为评价指标优选展筋消痹胶囊的最佳提取工艺。(2)处方中的药材采用薄层色谱法进行定性鉴别，处方君药赤芍中芍药苷的含量采用高效液相色谱法测定。(3)运用在室温条件下 )测定了动物的最大观察留取样品的方式，初步考察展筋消痹胶囊的稳定性。(4 受试药物量。 结果:(1)打粉药材平均出粉率:90.90%。展筋消痹胶囊的优选工艺为:10倍量水，每次1小时，提取3次。(2)对处方中的药材赤芍、当归、防风和乌药等采用薄层色谱法进行鉴别，薄层图谱斑点清晰且阴性对照无干扰;用高效液相色谱法测定芍药苷的含量，在0.0060mg/ml,0.1906mg/ml范围内，芍药苷峰面积值与进样浓度有良好的线性关系，r为0.9999。平均加样回收率为96.97%，RSD=1.04%(n=6)。(3)分别考察了展筋消痹胶囊上市包装的三个批号样品，考察时间为6个月，经检验各项指标均符合注册质量标准草案和《中华人民共和国药典》2010年版一部附录胶囊剂项下规定，暂定有效期24个月。(4)展筋消痹胶囊给昆明品系小鼠灌胃未测出LD，24小时内给药2次，观察14天，小鼠均50 无死亡;其最大受试药物量为26.67g/kg，相当原生药95.04g/kg。 结论:完成了新药展筋消痹胶囊的临床前研究。确定了展筋消痹胶囊的最佳提取工艺和成型工艺;建立了该制剂的质量控制标准;完成了初步稳定性试验;急性毒性实验为临床剂量选择和观察指标的设计奠定了基础。 关键词:展筋消痹胶囊;制备工艺;质量标准;稳定性;急性毒性 引 言 1 立题依据 血友病性关节炎是由遗传性凝血因子缺乏所引起的关节内反复出血、肿胀，并伴有严重疼痛、功能障碍，继而出现纤维化损害，导致关节挛缩、关节变形及关节炎。鉴于血友病性关节炎的特殊性(由血友病引起的关节出血，常累及多个关节，包括膝、踝和肘关节等)，治疗血友病性关节炎就不能用普通的关节炎治疗药物，需要同时考虑血友病的局限性，关节炎病在血友病患者中的发病率高达80%以上，专门用于治疗血友病性关节炎的药物显得尤为重要。 目前，市场上供应治疗普通关节炎的中西药品虽多，但均因血友病凝血障碍 [1-4]而不适应。西医常用治疗普通关节炎的药物消炎痛、布洛芬、双氯芬酸钠、D-盐酸青霉胺等，这些药均影响凝血，不适于血友病应用。中药治疗关节炎的药物也不少，如活络丹、桃仁、红花、全蝎、乌头等，此类药活血作用过强，也不宜用于血友病。陕西省中医医院的经典临床经验方展筋消痹胶囊经过8年的临床应用，证明该方不但可缓解血友病关节肿痛变形，而且可去除病因，阻断或减少、减轻复发。 2 可行性 [5]祖国医学认为痹证的发生，主要由于正气虚弱，风、寒、湿等外邪趁虚而入所致。《内经》首先提出了形成痹症的机制与风寒湿邪及内在机体有关，其观点有“风寒湿三气杂至合而为痹也。”、“所谓痹者，各以其时重感风寒湿之气也。”，强调了内因是痹证发生的基础，痹症与自身体质有关，如自身正气的不足以致体质虚弱，脏腑经脉之气亦失调，素体在整体上难以自我调整到一定程度的平衡，抵抗不了外邪对自身的侵入，进而风寒湿等外邪入体，导致关节、肌肉及经脉的瘀阻不畅进而形成痹症，出现关节病变，如关节肿胀、变形，伸屈不能够自如，皮肤现瘀斑等。 血友病性关节炎的发生主要与正气不足，外感风寒湿邪，侵袭肌肉、关节、经络而成痹症。患者一般表现得较显疲倦、浑身乏力没精神，腰部和膝部等酸痛无力;其面部气色不佳，肌肉无弹性、松弛，舌苔暗淡，脉象虚弱，这些都是肝 肾气血不足所表现出来的症状;还有由于风寒湿邪的侵入导致的关节肿痛、增大变形，长时间不愈，进而气血瘀阻不畅，加重了关节病变，形成血友病关节炎。中医治病求本，辨证施治的原则，展筋消痹胶囊正是结合了中医的治疗原则组方，由赤芍、当归、防风、茯苓、荆芥、伸筋草等药组成。具有活血舒筋、祛风除湿功效。 陕西省中医医院2006年随机接诊来自全国各地血友病性关节炎患者40例，服用关节炎煎剂18天，观察近期疗效:完全缓解者33例(82.5%)，部分缓解5例(12.5%)，末缓解2例(5%);出院后继续服用展筋消痹胶囊用于巩固治疗，在之后的6个月时间里，85.0%(34/40例)持续缓解、无复发。从2005年至今，已经治疗血友病性关节炎450余例，获得了良好的效果而且无不良反应。说明关节炎煎剂是在临床有着确切的疗效、病人服用安全无毒副作用的经验中药方。 展筋消痹胶囊为陕西省中医医院临床经验方，将煎剂改为胶囊剂，不仅很好的保存了该药方的疗效，而且服用方便，更适合临床的应用。 3 国内外研究概况 [6]闫伟强等在临床上应用全膝关节置换术治疗重型血友病性膝关节炎，术后明显改善了膝关节的功能。全膝关节置换术虽然能够在一定程度上改善中后期血友病性膝关节炎患者的膝关节病变，并且能够恢复一定的关节功能，但是容易引起胫骨面假体沉陷、肺栓塞、低毒感染等术后并发症。 [7]Hoots WK,Rodriguez N等研究了引起血友病性关节炎的多因素发病机制。通过对病因的研究发现，血友病性关节炎是由于凝血因子的缺乏造成关节的出血，进一步发展为关节炎病变，针对早期的血友病性关节炎患者，通过补充患者自身所缺乏的凝血因子，可发现患者关节出血现象减少，关节功能改善，对于血友病性关节炎能起到较好的的提前预防和早起治疗作用，但凝血因子价格一般比较昂贵，对于普通条件的患者以及想要连续预防性的补充凝血因子较难实现，限制了该法的应用范围。 [8]Schneider P,Farahati J,Reiners C等将放射性滑膜切除术应用于慢性血友病性关节炎的治疗。虽然此法的优点有很多，如可缓解疼痛并减轻炎症、治疗的费用少、能使患者的关节功能恢复到行走并保持，但此法容易引起辐射损伤、皮肤放射性坏死等并发症，要想安全广泛的应用此法，还需要进一步的晚期干预 等相关的后期研究。 临床常用的中成药有追风活络丸、益肾蠲痹丸、祛风止痛片、湿热痹颗粒、寒湿痹冲剂、健步壮骨丸等用于一般类风湿性关节炎的治疗，对于缓解关节肿痛、改善关节变形、肌肉萎缩、腰膝酸软等症状有作用，但对血友病性关节炎具有一定的局限性，不利于血友病的凝血。 4 处方药物组成及方解 4.1 处方来源:展筋消痹胶囊处方是陕西省中医医院的经典临床经验方，应用于临床治疗血友病性关节炎效果显著且无不良反应。 4.2 处方组成:由赤芍、当归、防风、茯苓、猪苓、乌药、伸筋草、延胡索、荆芥和甘草等10味中药组成。 4.3 方解:该方选赤芍、当归为君药。赤芍:苦、微寒，入肝经，功效:活血、凉血，散瘀止痛，消痈散肿;当归:甘、苦、温，入肝、心、脾经，功效:补血调经，活血止痛，润肠通便;以上二药活血、祛风止痛，为治疗该病之君药。茯苓、防风、荆芥、伸筋草为臣药。茯苓:甘、淡、平，入心、肺、脾、肾经，功效:利尿渗湿，补脾宁心;防风:辛、甘、微温，入膀胱、肝、脾经，功效:祛风止痛;荆芥:辛、温，入肺、肝经，功效:祛风解表;伸筋草:苦、辛、温，入肝、肾经，功效:祛风湿，利筋骨;以上四药为臣药，助君药活血舒筋，祛风除湿，加强主药疗效。延胡索、乌药、猪苓为佐药。延胡索:辛、苦、温，入肝、肺经，功效:活血、行气止痛;乌药:辛、温，入肺、肝经，功效:顺气、散寒止痛;猪苓:甘，淡、平，入脾、膀胱二经，功效:利水渗湿;以上三药助君臣药，温通经络，补阳散寒，行气止痛。甘草:甘、平，入十二经，功效:补脾益气，解毒缓急，止咳祛痰。此方十味中药，君臣佐使配伍得当，组方严谨，共奏活血舒筋、祛风除湿之功，适用于血友病性关节炎患者并前景广阔。 5 临床使用背景 本组方是陕西省中医医院临床经验方，从2005年到2006年，该院随机接诊血友病性关节炎患者40例。经该组方治疗后，完全缓解33例，部分缓解5例，无效2例。从2005年至今，已经治疗血友病性关节炎患者450例，均获得较好的疗效，是一个案例有效的中药制剂。从长远讲可减轻广大患者的经济负担，使大多数患者能长期服药，以完成全部疗程。 文献研究 1 赤芍 本品为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall或川赤芍Paeonia [10]veitchii Lynch)的干燥根，其味苦，微寒，归肝经，具有清热凉血，散瘀止痛之功效。《本经》记载:“主邪气腹痛，除血痹，破坚积，寒热疝瘕，止痛利小便，益气。” 1.1 化学成分 表1 赤芍中的主要成分 没食子酰芍药苷 苯甲酰芍药苷 芍药苷 鞣质 树脂 8(Z)-(1S,5R)-β蒎烯氧化芍药苷 没食子酸 挥发油 蛋白质 -10-羟基-β-巢菜糖苷 (1S,2S,4R)-反式-2-羟芍药内酯苷 丹皮酚苷元 苯甲酸 粘液质 基-1,8-桉叶素 苯甲酰羟基芍药苷 芍药新苷 芍药苷元 丹皮酚 水杨酸 芍药内酯A、B、C 芍药花苷 羟基芍药苷 芍药醇 赤芍乙素 1.2 药理作用 1.2.1 对血液系统的作用 1.2.1.1 抑制血小板的聚集 赤芍提取物在体外能够明显抑制酒石酸肾上腺素、Adenosine Diphos Phate、Trimeresurus mucrosquamatus Snake venom和Arachidonic Acid诱导的血小板聚集，并且降低血小板的粘附作用及第三因子的活性，Cyclic adenosine monophosphate的含量升高。当血小板内环腺苷酸水平升高时，就会抑制血小板的释放、粘附及聚集作用。给冠心病引起的心绞痛患者静滴赤芍精能够显著减少聚集扩大类血小板的聚集数，药理实验表明，赤芍提取物中的成分抑制血小板聚集机制可能与干扰血小板的代谢和提高血小板内环腺苷水平有关，上述实验表明[12]，赤芍抑制血小板聚集的机制可能与干扰血小板的能量代谢，抑制TXA的生2物合成及提高血小板内cAMP含量等有关。 1.2.1.2 抗凝和抗血栓形成的作用 赤芍总苷能够显著延长大鼠和小鼠的凝血时间，还能延长电刺激大鼠颈总动脉血栓形成的时间，表明赤芍总苷通过对凝血系统和血小板功能的影响而产生抗 [13]血栓作用。 1.2.2抗炎作用 有研究发现，赤芍还有抗炎作用。芍药苷能抑制佐剂诱发的关节炎，主要是通过抑制滑骨细胞的非正常增值，减少滑骨细胞中IL-1、PGE2、IL-6、VEGF、 [14]GM-CSF的产生，降低滑膜内Gi和COX-2的表达。赤芍还可改良滑骨细胞的分泌与代谢，抑制其非正常增殖，降低成纤维细胞样滑骨细胞中VEGF、bFGF、MMP-1、 [15]MMP-3的产生，从而对抗胶原诱导的关节炎。 1.2.3 抗肿瘤作用 芍药苷能抑制肿瘤细胞膜上Adenosine Triphos Phate酶(三磷腺苷酶)的活性，升高adenylate cyclase(高腺苷酸环化酶)活性。药理实验对赤芍水提液进行了诱变性和抗诱变性实验，结果显示赤芍水溶性提取液存在明显的抗诱变 [16]作用，且随浓度的增加而增强。 1.2.4 保肝作用 对肝脏有着很广泛的药理作用。药理研究赤芍注射液对体外培赤芍归肝经, 养肝细胞的DNA合成和肝脏水解有显著的促进作用，有助于肝细胞的再生和肝功 [17]能的恢复。 2 当归 [18] 本品为伞形科植物当归Angelia sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，其味甘、辛，性温，归肝、心、脾经。具有活血补血、润肠通便、调经止痛的功效，可用于风湿痹痛、血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调、经闭痛经、 [18]虚寒腹痛、肠燥便秘等的治疗。 2.1化学成分 2.1.1挥发油 当归挥发油含量较高，是当归的主要有效成分之一。 2.1.2有机酸 当归含有阿魏酸、丁二酸、烟酸、茴香酸、瘀酸、亚油酸、香草酸、壬二酸、邻二苯酸、硬脂酸等酸性成分，其中阿魏酸为主要有效成分，且含 量较高。 2.1.3多糖类 当归多糖是当归中的水溶性有效成分，含量丰富，多糖主要由L,阿拉伯 [19]糖、D,半乳糖、葡萄糖醛酸、D,木糖、半乳糖醛酸等组成。 2.1.4黄酮类 当归中黄酮类成分主要是查尔酮衍生物、木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷和 [19]木犀草素-7-O-芦丁糖苷等。 2.1.5其他成分 当归中含有丰富的氨基酸，以及锰、铁、锌、铜等多种微量元素，此外， [19]当归中还含有维生素、香豆素类、胆碱、腺瞟呤、尿嘧啶、磷脂等成分。 2.2药理作用 2.2.1镇痛抗炎作用 当归具有显著的镇痛、抗炎作用，有药理实验表明，通过对比正常小鼠与服用当归提取液的小鼠对热刺激所承受的疼痛值，发现当归能明显提高小鼠痛阈值，同法实验发现当归还能减轻由化学刺激所致的疼痛。进一步的药理研究发现，当归能够显著抑制多类诱导因素引起的各种炎症，而其抗炎机制不会因为双侧肾上腺的摘除受到影响。 2.2.2 抗血小板作用 当归提取液能降低凝血大鼠的血小板释放、聚集和黏附功能，增强红细胞的分列分化能力，进而发挥抑制血小板凝聚的作用。还有研究发现，当归多糖及其硫酸酯可显著延长凝血时间、缩短出血时间、延长凝血酶及活化部分凝血活酶时[21]间。 2.2.3 补血作用 当归被称为“补血要药”，此作用得到了历代医家的公认。当归有利于骨髓和脾细胞造血功能的发挥，提高体内血红蛋白及红细胞数，因此常作为补血中药使用。 2.2.4 保肝作用 在对造模所致多种肝损伤的小鼠的药理实验中，表明当归提取液能起到保护肝损伤的作用。当归注射液可显著降低肝硬化患者的脂质过氧化物、腺苷脱氨酶 [19]和门冬氨酸氨基转移酶，保护肝硬化患者的肝细胞。 2.2.5 改善肺功能 当归有较强的抗自由基作用，能够明显减轻肺泡炎的严重程度及肺间质纤维[21]化。 2.2.6 其他作用 此外，当归还有增强免疫功能、抗肿瘤、抗辐射损伤、抗氧化、降血脂及对脏器的保护等作用。 3 防风 本品为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata (Turcz.)Schischk的干燥[23]根，味辛、甘，微温，归膀胱、肝、脾经。始载于《神农本草经》，谓:“防风，味甘，温。主大风头眩痛，恶风，风邪，木盲无所见，风行周身，骨节疼痹，烦满。” 3.1 化学成分 3.1.1 香豆素类成分 目前采用气相-质谱连用分析鉴定出的挥发性成分如下表: 防风果实中也含有多种挥发性成分。 3.1.4 其他成分 防风中还含有聚乙炔类、多糖类、有机酸类、甘油酯类及微量元素Se、Mo等[22]。 3.2 药理作用 3.2.1镇痛作用 药理实验研究表明，防风提取物能明显提高小鼠的痛阈值，在对防风镇痛机理的研究中,发现纳洛酮能够拮抗防风的镇痛作用,由此表明防风的镇痛部位在 [25]中枢。 3.2.2 抗炎作用 [23] 在药理造模用巴豆油涂耳致炎的实验中，防风水煎液可明显抑制小鼠耳廓的肿胀，对醋酸所引起的炎症亦有明显的抑制作用。 3.2.3 抗菌作用 防风及含防风的处方的水煮煎液对流行性病毒，如流感病毒在一定的程度上 有抑制作用;采用平板法进行体外抑菌实验，结果表明防风对金黄色葡萄球菌、二型溶血性链球菌、肺炎双球菌及两种霉菌(产黄青霉菌、杂色曲霉菌) 等有抑 [24]制作用。 3.2.4 解热作用 防风95%乙醇提取液给小鼠腹腔注射后半小时，对三联菌苗(百日咳、白喉、 [26]破伤风杆菌)引起的发热有显著解热作用。 3.2.5 其他作用 此外，药理实验表明的防风还有镇静、抗癫痫、提高免疫功能、抗凝血、抗 [23]惊厥、抗过敏等作用。 4 茯苓 [27] 茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.)Wolf的干燥菌核，为利水渗湿的要药，味甘、淡，性平，归心、肺、脾、肾经。 4.1 化学成分 4.2 药理作用 茯苓多糖具有抑制肿瘤，调节机体免疫等功能，有利尿、抗菌、抗肿瘤、预防溃疡、解毒、除湿等作用，多用于治疗小便不利、水肿、泄泻、心悸等症。 5 猪苓 猪苓为多孔菌科真菌猪苓Polyporus umbellatus(Pers.)Fries的干燥菌核[30]，味甘、淡，性平，归肾、膀胱经。 5.1 化学成分 据报道，猪苓的化学成分主要有甾体类、非甾体类(除多糖类外)、多糖类、 [31]维生素类、氨基酸类及微量无机元素等。 5.2 药理作用 5.2.1 利尿作用 ++- 猪苓提取物对肾结石大鼠实验表明:猪苓具有明显促进肾排除Na、K、Cl， 2+而抑制尿Ca排泄及抑制尿草酸钙结晶的生长与聚集作用，表现出显著的利尿和 [32]抑制尿结石形成作用，并具有明显的肾功能保护作用。 5.2.2 免疫调节作用 复方猪苓多糖具有激活和提高非特异性杀伤肿瘤细胞等能力，是一种具有提 高细胞和体液免疫能力的中药方剂，且对脐血造血干细胞有明显扩增作用，并能 [32]促进脐血造血干细胞移植小鼠免疫造血重建。 5.2.3 抗菌与抗炎作用 猪苓的醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制作用，猪苓中的 [33]poly-oroidA、B、C具有抗炎作用。 5.2.4 抗辐射作用 猪苓中的多糖成分能够提高机体对于外界的抗辐射能力，通过对机体的调节还能修复辐射损伤。 5.2.5 其他作用 此外，还有抗肿瘤、抗诱变、保肝、促进头发生长等作用。 6 乌药 [34] 本品为樟科植物乌药Lindera aggregata(Sims)Kosterm.的干燥块根，味辛，性温。归肺、脾、肾、膀胱经。乌药是重要的止痛温胃理气药之一，为传统常用中药。 6.1 化学成分 6.1.1 挥发油 乌药含有挥发油，在其根、叶、果皮及种子所含成分不同，见下表: 表7 乌药中的挥发油类成分 部位 根 叶 果皮 种子 成分 龙脑、柠檬烯、罗勒烯、聚伞花单萜和倍半萜类呋喃倍半萜类化 α-蒎烯、茨烯等 素、10a-八氢菲、化合物 合物 乙酸龙脑酯等， 注:其组分随着产地的不同也产生变化 6.1.2 异喹啉生物碱 乌药中所含生物碱较少，以异喹啉型生物碱为主，如波尔定碱、牛心果碱、 [35]新木姜子碱等。 6.1.3 黄酮类成分 从乌药叶中分离鉴定了山奈酚、山奈酚-3-O-L-鼠李糖苷、槲皮素、槲皮素 [35]-3-O-吡喃鼠李糖苷、槲皮素-3-O-L-鼠李糖苷等黄酮类化合物。 6.1.4 倍半萜类化合物 这类成分是乌药中被研究得最多的成分，也是乌药的特征性成分，有着很强的专属性。该类化合物可分为乌药烷型、桉烷型、榄烷型、吉马烷型四种类型。此外，乌药中还有香樟内酯、双香樟内酯、羟基香樟内酯及异吉马呋内酯和羟基 [36]异吉马呋内酯等倍半萜内酯类化合物。 6.1.5 其他成分 乌药中还含有脂肪酸、植物甾醇、豆甾醇、胡萝卜苷等成分。 6.2 药理作用 6.2.1 镇痛、抗炎作用 乌药的水、醇提取物均有明显的镇痛、抗炎活性，乌药LEF(抗炎活性组分)组分是乌药的活性组分，研究表明:构成该组分的化学成分主要为缩合鞣质类成分，该组分能有效地抑制风寒湿痹证肿胀、继发性肿胀以及炎性组织中前列腺素 [37]E2(PGE2)的生成，显示乌药有良好的抗风湿应用前景。 6.2.2 抗菌、抗病毒作用 乌药对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、甲型溶血链球菌、大肠杆菌、变形杆菌均有抑制作用，其水提和醇提物对单纯疱疹病毒(HSV)也有明显的抑制 [38]作用，亦属高效药物。 6.2.3 对消化系统的作用 乌药能增加消化液的分泌，促进胃肠动力和缓解胃肠痉挛，还能对抗临床应用大黄引起的腹痛;乌药的水提取液能够预防和抑制溃疡，有效的保护因乙醇引发的细胞损伤，且随着计量的增大，保护作用越强。 6.2.4 其他作用 乌药对心肌有兴奋作用，还有促进血凝、抗氧化、抗疲劳和抗微生物等作用。 7 延胡索 延胡索为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎，又称 [39]为元胡、玄胡、玄胡索等，味辛、苦，性温，归肝、脾经。《本草纲目》记载:“本名为玄胡索，因避宋真宗讳，故改玄为元也。”故后来人们在处方中多以“元胡”代称延胡索。 7.1 化学成分 延胡索主要成分为生物碱，主要有叔胺、季胺类生物碱;此外，延胡索中还含有大量淀粉，少量有机酸，如棕搁酸、油酸、亚油酸、亚油烯酸等，还有一些无机元素、皂苷类、粘液质、树脂、皂醇类等。 7.2 药理作用 7.2.1 镇痛作用 延胡索历来是大家公认的镇痛良药，起镇痛作用的成分主要是延胡索乙素，其镇痛作用也最强，另外，延胡索乙素与巴比妥类药物功能相近且能起到协同作用，具有明显的催眠作用。《本草纲目》中记载:“能行血中气滞，气中血滞，故专治一身上下诸痛，用之中的，妙不可言，盖延胡索活血化气，第一品药也。” 7.2.2 对消化系统的作用 延胡索的一些成分能保护对药理模型实验中小鼠的胃溃疡，其有效成分主要为延胡索乙素、去氢延胡索甲素和原阿片碱，能减少胃液、胃酸分泌量，降低胃蛋白酶的活性，对幽门结扎或阿司匹林等多种原因诱发的胃溃疡，有明显的保护 [40]作用。 7.2.3 抗肿瘤作用 实验表明，从延胡索根茎中分离提取得到的元胡多糖YhPS-1能抑制小鼠体内 [41]路易斯肺癌和S细胞瘤的生长。 180 7.2.4 抗炎和抗菌作用 有研究者通过大量的试验对延胡索乙素的抗炎作用的机制进行了探讨。发现延胡索乙素能抑制细胞外信号调节激酶和p38蛋白激酶(MAPK)磷酸化，这表明延 [40]胡索乙素可通过阻断蛋白激酶磷酸化从而抑制炎症介质IL-8的分泌。 7.2.5 其他作用 延胡索还有很好的增强免疫、延缓衰老、镇静催眠、抗心律失常、降压、抗 [42]血栓等作用。 8 荆芥 [43] 荆芥为唇形科植物荆芥Schizone peta tenuifolia Briq的干燥地上部分，又名小茵香, 假苏，为临床常用中药，味辛，微温，归肺、肝经。先载于《神农本草经》:“假苏，味辛温。主寒热，鼠瘘，瘰疬生创，破结聚气，下淤血，除湿痹，一名鼠蓂，生川泽，列为中品。” 8.1 化学成分 荆芥的主要成分有挥发油、有机酸、单萜苷、黄酮、甾体类及三萜等。 8.2 药理作用 现代研究表明，荆芥具有抗炎、解热镇痛、抗病毒、抑菌、发汗、抗氧化和一 [44]定的抗肿瘤作用。 9 伸筋草 [45] 伸筋草为石松科植物石松Lycopodium japonicum Thunb的干燥全草，其味微苦、辛，性温，归肝、脾、肾经。伸筋草在风湿病的治疗中有着较为广泛的应用。 9.1 化学成分 9.1.1 三萜类成分 表8 伸筋草中的三萜类成分 芒柄花醇 石松醇 伸筋草萜醇 千层塔萜烯二21-表千层塔萜 醇 烯二醇 伸筋草醇 石松宁 伸筋草萜宁醇 16-氧山芝烯二21-表千层塔萜 醇 烯三醇 9.1.2 挥发性成分 主要为萜烯类及其含氧衍生物、酯类、醇类和酮类，微量的奈、酸和醛等化 [47]合物。 9.1.3 生物碱类成分 主要有石松碱、棒石松碱、石松定碱、石松灵碱、去氢石松碱、石松毒碱、伸筋草碱、伸筋草宁碱、法西亭碱、乙酰法西亭碱、法西亭明碱、二氢石松碱等碱类成分。 9.1.4 其他成分 [48] 此外还富含有微量元素Fe、Cu、Zn、Mn、Ca等。 9.2 药理作用 伸筋草中所含成分较多，故具有多方面的药理、药效作用。萜类成分及甾体有解热、镇痛消炎等作用，生物碱有兴奋中枢神经系统作用，抑制心血管系统和神经肌肉作用。 10 甘草 为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza [49]inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎，味甘，性平，归心、肺、脾、胃经。中医理论以其中和之性，具调和诸药之功，行佐使之用在方剂配伍中出现频率很高，为临床最常用的药物之一，有着中药“国老”的 [50]美誉。 10.1 化学成分 10.1.1 三萜皂苷类 甘草根和根茎中含有多种三萜皂苷，如:甘草内酯、异甘草内酯、甘草甜素、 [50]甘草酸及甘草次酸，其中甘草酸为甘草的主要活性成分。 10.1.2 黄酮类成分 甘草中含有多种黄酮类化合物，主要包括黄酮类、黄酮醇类、双氢黄酮类、异黄酮类、查尔酮类、双氢查尔酮类等，黄酮类成份主要包括甘草苷、甘草苷元、 [51]异甘草苷、异甘草苷元等。 10.1.3 多糖类成分 甘草多糖组分主要有葡聚糖、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，并以葡聚糖 [50]为主链。 10.1.4 其他成分 甘草中还含氨基酸、生物碱、香豆素和少量的挥发性成分。 10.2 药理作用 10.2.1 抗炎作用 甘草具有皮质激素样抗炎作用，甘草对于湿疹和皮肤瘙痒、囊肿等过敏性皮 [52]炎有显著疗效，其有效成分是甘草酸。 10.2.2 调节免疫作用 有研究表明，甘草的有效成分是甘草酸，对机体的非特异性免疫和体内细胞的免疫有增强和调节作用，而对于辅助性T淋巴细胞甘草酸还能选择性提高其增 [51]殖能力和活性。 10.2.3 抗病毒作用 甘草中的甘草酸有抗病毒作用，医药工作者就甘草甜素、甘草酸作用于艾滋病毒、肝炎病毒及其它病毒做了大量研究和应，用疗效较好，在临床上已被用于 [51]治疗慢性肝炎。 10.2.4 解毒作用 《本草图经》中记载“甘草能解百毒，为众药之要。”甘草具有很好的解毒功效，对于食物中毒、药物中毒等都有良好的解毒能力，起解毒功效的有效成分为 [53]甘草甜素，对毒物有吸附作用。 10.2.5 其他作用 此外，甘草还有抗肿瘤、镇咳祛痰、解痉、保肝、抗心律失常、降血脂、抗氧化、抗过敏、降胆固醇等作用。 正 文 展筋消痹胶囊工艺研究 (一)展筋消痹胶囊的实验室工艺研究 1 处方组成 赤芍、当归、防风、茯苓、猪苓、乌药、伸筋草、延胡索、荆芥和甘草。 2 剂型选择 本处方原来是以汤煎剂形式使用，但汤剂需现用新制，大多味苦，患者大多不愿服用，且不宜久放也不便携带，口服剂量较大，难以满足现代制剂的临床用药要求。胶囊剂是较好的一种剂型，其特点是能掩盖药物的苦味和不良嗅味;防止空气中的氧、湿气以及光线对该制剂的影响，保持药物在有效期内的良好稳定性;胶囊剂在胃肠道内溶出和分散的速度快，吸收利用的程度高，进而能够快速起效;同时利于服用，携带方便，故本方采用胶囊剂。 3 实验药材来源及鉴定 试验所用的药材均由陕西省中医药研究院提供，按2010年版《中国药典》一部检验符合规定。 4 生产工艺 以上十味，按处方比例取茯苓、猪苓和延胡索粉碎成细粉，过筛，混匀;赤芍、当归和防风等其余药材，每次加10倍量的水提取1小时，总共加热回流提取三次，过滤药液，合并滤液，将滤液浓缩至一定的程度(相对密度1.30, 1.35(60?)的清膏)，加入粉碎药材的细粉，进行混合、干燥，再粉碎成胶囊剂 要求的细粉、制成颗粒，装入胶囊壳，即得。 5 工艺流程图及工艺所用仪器设备 5.1工艺流程图 茯苓、猪苓、延胡索 赤芍、当归、防风、伸筋草、 荆芥、乌药、甘草 10倍量水煎煮三次，每次1粉碎成细粉，过80目筛 小时 滤过，合并滤液，浓缩至相对细粉 密度1.30-1.35(60?)的清膏 混合 干燥、粉碎 制粒 装胶囊 5.2 工艺研究所用仪器设备 表9 工艺研究所用仪器设备 仪器 型号 生产厂家 Waters ACQUITY UPLC超高效ACQUITY UPLC 美国Waters公司 分析天平 BP211D 德国赛多利斯天平有限公司 液相色谱 Millipore实验室超纯水仪 SimpIicity实验室超纯水仪 南京权坤生物科技有限公司 架盘药物天平 HCTP11B10 北京市宣武区天平厂 粉碎机 FW135 天津市泰斯特仪器有限公司 电热鼓风干燥箱 101型 北京市永光明医疗仪器厂 6 工艺研究 出粉率的考察 6.1 根据临床经验，将制剂成型和服用量等因素考虑在内，将茯苓、猪苓和延胡索粉碎入药。 出粉率考察:称取茯苓60g、猪苓60g、和延胡索75g，共195g,称取3份，进行粉碎，过80目筛，研细，称重，计算出粉率，见表1。 表10 药材出粉率考察结果 试验次数 1 2 3 药材重(g) 195 195 195 研细重(g) 177.0 179.6 175.1 出粉率(,) 90.8 92.1 89.8 平均出粉率(,) 90.9 结果:平均出粉率在90.9%。 7 提取工艺考察 由以上十味药材所含主要有效成分的性质可知，茯苓、猪苓和延胡索打粉，其余药物均可用水煎煮的方法进行提取。为了体现现代中药“三效”(速效、长效、高效)、“三小”(毒性小、剂量小、副作用小)、“五方便”(方便生产、方便运输、方便贮存、方便携带、方便服用)的特点，除尽可能的提取出有效成分外，还需尽量减少服用量，因此，通过参考文献中各药材的提取方法，选择用水煎煮药材，浓缩提取液、加入过筛细粉、制成胶囊的工艺路线。水提液的考察中，由于处方中赤芍为君药，且芍药苷有较成熟的含量测定方法，故以水提液的芍药苷 含量和干膏重为指标，综合进行考察。 7.1正交实验设计 影响水提取的主要因素有煎煮时间、加水量和提取次数。通过多因素的正交 4实验，选取最佳提取工艺。各选择三个水平，以L(3)表安排试验，因素和水平9 见表2。 表11 因 素 水 平 表 因 素 水平 A: 煎煮时间(h) B: 加水量(倍) C: 提取次数(次) 空白 1 1.0 8 1 1 2 1.5 10 2 2 3 2.0 12 3 3 实验操作:按处方比例称取赤芍15g、当归9g、防风12g、伸筋草12g、荆 4芥12g、乌药12g、甘草6g，共九份，按L(3)正交表(见表3)进行试验，过滤9 提取液，测量总体积，备用。 7.2芍药苷的含量测定 色谱条件 Waters 2690液相色谱仪，色谱柱:C(Diamosil 4.6×250mm，5μ18 m);流动相:乙腈-0.1磷酸(14:86);流速:1ml/min;柱温:25?;进样量:10ul;检测波长:230nm。 对照品溶液的制备 精密称取适量的芍药苷对照品，置于10ml的容量瓶，加甲醇定容至刻度，制成浓度为0.0716mg/ml的芍药苷对照品溶液。 供试品溶液的制备 分别精密量取各正交实验合并的滤液7ml，置于10ml的容量瓶，加甲醇定容至刻度，振摇混匀，通过有机微孔滤膜(0.45um)过滤，即得。 7.3 干膏的制备 精密量取各正交实验滤液50ml于干燥蒸发皿中蒸干，置105?烘箱干燥至恒重，取出，迅速置于干燥器中放冷，称重，得出出膏率。 7.4 芍药苷含量和干膏重的试验结果分析见表3。 4表12 水提L(3)正交试验及数据分析表 9 列 号 评 价 指 标 试验号 A B C D 芍药苷含量(mg) 出膏率(%) 1 1 1 1 1 259.57 10.44 2 1 2 2 2 381.45 15.13 3 1 3 3 3 501.77 15.77 4 2 1 2 3 374.78 14.45 5 2 2 3 1 388.41 16.07 6 2 3 1 2 350.61 11.89 7 3 1 3 2 458.10 15.57 8 3 2 1 3 369.49 12.08 9 3 3 2 1 337.45 15.58 芍 均值? 380.930 364.150 326.557 328.477 药 苷均值? 371.267 379.783 364.560 396.720 提 出均值? 388.347 396.610 449.427 415.347 量 膏? 13.780 13.487 11.470 14.030 出 膏? 14.137 14.427 15.053 14.197 膏 率 膏? 14.410 14.413 15.803 14.100 7.5 方差分析 依据表3正交试验结果的数据分析进行方差分析见表4、5 表13 方差分析表(芍药苷含量) 方差来源 离差平方和 自由度 方 差 F值 显著性 SS 440.113 2 1.000 19.00 A SS 1581.189 2 3.593 19.00 B SS 23743.641 2 53.949 19.00 * C SS 440.11 2 D 表14 方差分析表(干膏) 方差来源 离差平方和 自由度 方 差 F值 显著性 SS 0.599 2 14.262 19.00 A SS 1.742 2 41.476 19.00 * B SS 32.181 2 766.214 19.00 * C SS 0.04 2 D 芍药苷含量测定试验结果表明，提取次数对芍药苷的提取量影响较大，最佳工艺为ABC即:加12倍量水煎煮提取3次，每次1小时。 133， 出膏率试验结果表明，加水量和提取次数对制剂的提取量影响较大，最佳工艺为ABC即:加10倍量水煎煮提取3次，每次1.5小时。 223， 综合分析芍药苷含量和出膏率的正交试验结果，因素A的水平1和水平2差距不大，因素B的水平2和水平3差距也不大，从节省能源角度，结合大工业生产，选取最佳的提取工艺为10倍量水煎煮提取3次，每次1小时。 7.6 工艺验证: 按处方比例称取赤芍、当归、防风、乌药、荆芥、伸筋草、甘草，共三份，按照所选取的最佳提取条件，同正交试验芍药苷的含量测定方法和出膏率的测定方法进行试验，结果见表6。 表15 验证试验结果 名称 芍药苷含量(mg) 出膏率(%) 验证1 575.05 15.10 验证2 511.04 15.17 验证3 506.41 15.08 验证试验结果表明，选取的最佳提取工艺条件相对稳定，基本合理可行。 (二)中试工艺 按照工艺研究结果，制剂处方量放大64倍投料即可满足10000粒的制成总量，试制中试产品三批，结果见表7。 表16 展筋消痹胶囊中试试验结果 结 果 批 号 项 目 20130201 20130202 20130203 粉碎 投料(kg) 2.50 2.50 2.50 部分 细粉量(kg) 2.27 2.29 2.26 出粉率(%) 90.8 91.6 90.4 提取 投料(kg) 5.0 5.0 5.0 部分 稠膏量(kg) 1.47 1.63 1.54 理论量(kg) 3.0 3.0 3.0 成品量(kg) 2.90 2.89 2.92 装胶囊(粒) 9660 9630 9700 成品率(%) 96.6 96.3 97.0 根据中试结果，出膏率和成品率基本稳定，表明该工艺适合大生产。