NK细胞促进小鼠MHC半相合骨髓移植后造血重建的实验研究

NK细胞促进小鼠MHC半相合骨髓移植后造血重建的实验研究 NK细胞促进小鼠MHC半相合骨髓移植后 造血重建的实验研究 中华血液学杂志2004年5月第25卷5期一ChinJHematol,May2004,Vo125No.5 NK细胞促进小鼠MHC半相合骨髓移植后 造血重建的实验研究 王春燕郭坤元吴秉毅吴岚晓姜振宇潘兴华 【摘要】目的探讨将纯化的供鼠NK细胞加入预处理对主要组织相容性复合物(MHC) 半 相合小鼠骨髓移植(BMT)后造血重建的影响.方法以BALB/c×C57BL/6(CB6FIH-2d,)小鼠 为受者.以C57BL/6小鼠为供者.5O只受鼠经9.0Gy致死剂量照射后随机分为5组,每组1O 只. ?对照组:分别为单纯照射组,MHC半相合BMT组.?实验组:CB6F.小鼠在完成照射后1h 内 首先经尾静脉输注纯化后的MHC半相合供者NK细胞,分为1×10/只,5×10/只,2×10/只3组, 在照射后4h移植MHC半相合骨髓细胞.以血常规,体重,生存时间,病理组织学等变化为观 察指标 和进行组间比较.结果?生存期:单纯照射对照组为(5.15?0.66)d,其他组小鼠生存期均 >30d ?移植后第1O天时白细胞及血小板计数:MHC半相合BMT对照组为(0.99?0.22)×10/L, (61.00?7.27)×10/L.实验组中3个不同NK细胞输注剂量组白细胞及血小板计数分别为(2.01 ?0.21)×10./I一(101.50?16.34)×10/L;(1.98?0.29)×10/L,(99.50?16.41)×10/L; (1.97士0.21)×109/L,(98.00士16.19)×10/L,同对照组比较差异有显着性(P<O.01).组织学 检 查.各组均无移植物抗宿主病病理表现.结论在MHC半相合BMT模型上证实,移植前输注纯 化 的供鼠NK细胞能促进移植后造血重建. 【关键词】杀伤细胞,天然;主要组织相容性复合物;造血干细胞移植;造血重建;小鼠 ExperimentalstudyonNKcellspromotingdonormarrowengraftmentandhematopoieticreconstitutionaf- terMHChaploidenticalBMTinmiceWlANGChun—yan,GUOKun—yuan,WUBing—yi,WULan —xi— ditioningregimenonhematopoieticreconstitutionafterMHChaplotype-mismatchedBMTinmice. MethodsMurinemodelofMHChaplotype-mismatchedBMTwasestablishedbyusingBALB/c× C57BL/6”.(CB6F)mouseasrecipient,andC57BL/6mouseasdonor.Fiftyrecipientmice weredividedinto5groups.Themiceinthefirstthreegroupswereeachinfused1×1O,5×1O,2× 1O/mousedonor-derivedNKcells,respectivelybeforeTBI(Co,9.0Gy)andthenconditionedwith TBI,followedbyinfusionofC57BL/6micebonemarrowcellsfourhourslater.Themiceinthe fourthgroupreceivedTBIonly.andinthefifthgroup,TBIandBMTatthesomedosesasthefirst threegroups.Hematopoieticreconstitution,survivaltime,bodyweight,histopathologyoftherecipi— entswerefollowedup.Results?Survivaltimewas(5.15?O.66)daysforthefourthgroup,and> 30daysfortheother4groups.?Leukocyteandplateletcountsatday10afterBMTwere(O.99? O.22)×1O./1and(6l_O?7.27)×1O/Lrespectivelyforthefifthgroupand(2.O1?O.21)×1O/L, (1Ol_5O?16.34)×1O/L;(1_98?0.29)×1O./L,(99.5O?16.41)×1O/Land(1.97?0.21)× 10/L,(98.O?16.19)×1O/Lforthefirstthreegroups,respectively.HistopathoIogydisplayedno GVHDinallthegroups.ConclusionDonor-derivedNKcellscouldpromotehematopoieticreconstitu— tionafterMHChaplotype-mismatchedBMTinmice. [Keywords]Killercells,natural;Majorhistologiccompatiblecomplex;Hematopoieticstem celItranspIantation:Hematopoieticreconstitution;Mice ? 论着? 作者单位:510282广州,第一军医大学珠江医院血液科[王春燕(现在吉林大学第一医院血液 肿瘤科130021),郭坤元,吴秉毅,吴岚晓, 姜振字,潘兴华] 通信作者:郭坤元 中华血液学杂志2004年5月第25卷第5期ChinJHematol,May2004,Vol25No.5 异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是治疗恶 性血液病的主要手段,但是主要组织相容性复合物 (MHC)完全相合的供者越来越少.因此,建立新的 技术进行MHC半相合HSCT越来越重要.与 MHC完全相合HSCT比较,MHC半相合移植难 题之一是移植失败率高及移植后造血重建延迟.近 年研究表明,NK细胞能够通过直接和间接的方式 调节正常造血功能【1].在allo—HSCT后造血和免 疫重建过程中,CD.阳性的NK细胞比其他淋巴细 胞恢复快,说明NK细胞对移植后的造血及免疫重 建起到重要的作用].因此,我们将纯化的供者 NK细胞作为预处理方案的组成部分,在C57BL/ 6H.小鼠移植给(BALB/cH.×C57BL/6H.) CB6FH.小鼠模型上,观察移植前输注供者NK 细胞对半相合骨髓移植(BMT)后造血重建的影响, 借此评价其解决MHC半相合HSCT中造血重建 困难的潜能. 材料和方法 1实验动物C57BL/6H.小鼠为供者,雄性,6, 8周龄,体重18,22g;BALB/cH.×C57BL/6H. (CB6FH.)为受者,雌性,6,8周龄,体重18,22 g.所用鼠均为清洁级,由第一军医大学实验动物中 心提供. 2辐射小鼠制备采用?Co放射治疗机(法国 CGRmev公司ALCYON型SERIE40A系歹0)全身 照射CB6F小鼠,总剂量9.0Gy,剂量率0.5Gy/ min.照射当天小鼠开始饮用加有庆大霉素(32× 10U/L)和红霉素(250ms/L)的灭菌蒸馏水. 3NK细胞分离,纯化及检测选择C57BL/6H’ 小鼠骨髓为MHC半相合NK细胞来源,无菌条件 下取C57BI/6小鼠股骨,胫骨,用【)_Hank’S液冲 洗细胞.制成骨髓细胞悬液,用红细胞裂解液溶解 红细胞,计数细胞数,调整细胞浓度为1×1O个细 胞/90l缓冲液(磷酸盐缓冲液,pH7.2,加入5g/ L白蛋白,MiltenyiBiotec公司产品),按每1O个细 胞加入1Ol抗NK细胞免疫磁珠(MiltenyiBiotee 公司产品),6?孵育15min后用MiniMACS (MiltenyiBiotec公司产品)进行分选NK细胞,分 选后的细胞进行流式细胞仪(SouthernBiotech公 司产品)检测,NK细胞的纯度由分离前的(7.51? 2.56)上升到分离后的(93.80?2.45).用8.9 g/LNaC1洗2次(1500r/min,5min),调整细胞数 4×10./ml,照射后1h内按实验设计的剂量经尾静 脉注射给受鼠体内. 4骨髓移植按文献E33方法,常规取C57BL/6 小鼠骨髓制成细胞悬液,溶解红细胞后调整细胞数 1×10/ml用于半相合BMT. 5实验分组照射的5O只受鼠随机分为5组,每 组10只. 5.1对照组:?对照1组为单纯照射组(即照射 组):不进行移植.?对照2组为单纯MHC半相合 BMT组(即BM组):每只CB6FH.受鼠经尾静脉 移植C57BL/6H.供鼠3×1O.个骨髓细胞. 5.2实验组:?实验1组为半相合NK细胞和 BMT1组(即NK+BM1组):照射后1h内移植纯 化NK细胞1×1O./只,4h后,移植C57BL/6供 鼠3×1O.个骨髓细胞.?实验2组为半相合NK 细胞和BMT2组(即NK+BM2组):方法同实验1 组,移植纯化的NK细胞量为5×10/只.?实验3 组为半相合NK细胞和BMT3组(即NK+BM3 组):方法同实验1组,移植的纯化NK细胞量为2 ×1O/只. 6判断指标参照文献[2]方法,观察造血重建动 力学;长期(生存期>3Od)生存率及移植物抗宿主 病(GVHD). 7病理学观察各组长期生存小鼠共观察60d,每 只小鼠处死前或临死前均取肝,脾,肠,皮肤组织,用 4的中性甲醛溶液固定,石蜡切片,苏木精一伊红染 色,光镜下观察. 8嵌合体检查参照文献E43方法,作染色体检查 9统计学分析采用SPSS统计软件包处理,结果 用?s或百分率()表示,两样本均数的比较用 Student’S检验,2个以上样本均数的比较采用方差 分析(F检验),多个样本两两比较采用q检验(LSD 法),样本率的比较采用Y.检验,小鼠生存结果采用 乘积限估计方法和时序分析法. 结果 1生存期及死亡率观察对照1组1O只小鼠于照 射后第5天开始死亡,7d内全部死亡,均死于造血 衰竭,生存时间为(5.15?0.66)d;对照2组移植后 10只小鼠全部存活,生存期均大于30d.实验1,2, 3组3O只小鼠存活均超过30d.但实验1组有2 只小鼠移植后第18天(+18天)出现轻度腹泻,共 持续3d,自行缓解,上述2只小鼠生存超过30d后 即处死取肠道作病理检查.3O只受鼠均无弓背体 中华血液学杂志2004年5月第25卷第5期ChinJHematol,May2004.Vol25No.5 位,无脱毛现象. 2移植后小鼠外周血白细胞及血小板计数结果 见表1.+10天时,实验各组(NK+BM组)白细胞 及血小板计数明显高于对照2组,具有统计学意义 (P<O.O1).+30天时,实验各组(NK+BM组)白 细胞及血小板计数均高于对照2组,具有统计学差 异(P<0.05). 3染色体检测结果在移植后的不同时间点随机 抽取存活小鼠进行染色体检测.+30天时,随机抽 取对照2组3只小鼠,观察20个分裂相,Y染色体 出现率分别为95,9O,95.+6O天时,随机抽 取实验1组4只小鼠,Y染色体出现率分别为 80%,90,95,80.实验2组(NK+BM2组)5 只小鼠,Y染色体出现率分别为75,70,90, 8O,95.实验3组5只小鼠,Y染色体出现率分 别为65,90,85,7O,75.说明移植的 MHC半相合造血干细胞在受者体内长期生长. 4病理学变化各组小鼠(每组均10只)病理标本 均未显示GVHD病理改变.实验1组出现腹泻 (+18天出现,持续3d)小鼠的肠道病理显示轻度肠 黏膜水肿,未见异常淋巴细胞浸润及肠黏膜上皮细 胞坏死. 讨论 C57BL/6H.移植给CB6FH.是国内外研究 MHC半相合HSCT常用的动物模型,具有实用性 和代表性l4].虽然小鼠骨髓中也存在一定数量的 成熟T细胞,但是单独移植骨髓细胞不会发生 GVHD.我们观察到在三个NK细胞剂量组,只有 l×10/只剂量组中的2只小鼠有一过性腹泻,均无 GVHD的表现和组织病理学证据.说明将供者 NK细胞作为MHC半相合HSCT预处理方案的组 成部分是安全的. 我们以移植后白细胞和血小板的计数为观察指 标,以+10天和+30天为观察时间点,分别反映早 期造血再建和持久性造血再建的速度和程度.结果 显示,在上述两个时间点,NK细胞预先输注组受鼠 白细胞及血小板计数比单纯BMT组升高明显,差 异具有显着性.说明先输注供者的NK细胞可以加 快MHC半相合HSCT后早期造血重建和持久性 造血重建的速度和程度.结果显示2×l0/只剂量 组与1×10/只剂量组具有同样的效果.与每只鼠 移植3×10个骨髓细胞相比,比例的NK细胞就 可促进MHC半相合HSCT的造血重建.3个NK 细胞剂量组之间比较差异无显着性,可能同3个剂 量差距不大有关. 采用密闭性的免疫磁株阳性筛选分离NK细胞 可以做到无污染,高纯度,高活性,方便,快捷,将分 离到的供者NK细胞加入到预处理方案中具有良好 的临床实用性.我们从理论和技术上为解决MHC 半相合移植失败率高及移植后造血重建延迟提供了 一 个可尝试的新方法. 参考文献 1MorettaL,BottinoC,PendeD,eta1.Humannaturalkiller cells:theirorigin,receptorsandfunction.EurJImmunol, 2002,32:1205—1211. 2ImamuraM,TsutsumiY,MiuraY,eta1.Immunereconstitution andtoleranceafterallogeneichematopoieticstemcell”~ransplanta— tion.Hematology,2003,8:19—26. 3段连宁,郭坤元,刘明,等.异基因骨髓移植中T细胞表达Ly49A 与移植物抗宿主病相关.中国免疫学杂志.2000,16:552—553. 4段连宁,郭坤元,袁进,等.同种异基因Th2细胞移植对GVHD 和GVL效应的作用.中国实验血液学杂志,2000,8:57—60. 5RuggeriL,CapanniM,UrbaniE,eta1.Effectivenessofdonor naturalkillercellalloreactivityinmismatchedhematopoietic transplants.Science,2002,295:2097-21OO. 表1BMT后各组小鼠白细胞及血小板计数(×10/L,?) (收稿日期:2003—07—17)