_3_4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞上的表达

_3_4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞上的达 ??研究论文 α3β4 乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞上的表 达 *,,,,,,,李宝珠陈 心朱晓鹏胡远艳于海鹏 晖邴长孙东亭罗素兰 ( ,,57022)8海南大学 热带生物资源教育部重点实验室海南大学海口市海洋药物重点实验室海南 海口 34 nAChR) 。( 摘 要 建立以哺乳动物 αβ乙酰胆碱受体为分子靶标的药物筛选模型将大鼠乙酰胆碱受体 3 4 3 4 1? 13 4 ,cRNA,的 α与 β亚基基因分别进行体外转录获得 α与 β亚基基因的 按 的比例将适量 α与 β的 cRNA ,,ND96 、17 ? 24 h ,混合后显微注射到新鲜分离的非洲爪蟾卵母细胞中在 溶液中下培养 后通过双电极电压钳技 ( TEVC) 34 nAChR 3、4 cRNA ( Ach) 。术检测受体 αβ的乙酰胆碱门控电流同时注入 αβ的非洲爪蟾卵母细胞孵育 24h 后,可到明显的 Ach 门控内向电流,未注射或只 注 射 ddHO 。34的对照组细胞则没有任何电流产生αβ 2 ,, 乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞膜上成功表达以此为药物作用靶点可用于大量生物毒素等物质的活性筛选 。 实验模型 3Q48 11005-8915( 2011) 06-0471-04; A; ; 关键词 αβ乙酰胆碱受体双电极电压钳非洲爪蟾卵母细胞药物筛选模型 中图分类号 文献标志码 文章编号 ,、、-离子通道是众多疾病治疗药物作用的重要生物靶点 五羟 色 胺γ氨 基 丁 酸等多种神经递质的突触释 上腺素 以离子通道为靶点的药物筛选模型是发现新药的重要途径 ,。, 放具有非常重要的生理作用和临床研究意义因此烟碱。,。之一离子通道的 开 放 和 关 闭称 为 门 控根 据 门 控 机 制 ,型配体已成为最有希望治疗一大类重要疾病的新型药物 ,3 、: 的不同离子通道可以 分 为 大 类配体门控离子通道电 、、、、、、这些疾病包括智障成瘾疼痛帕金森症精神病抑郁重 ,1,。压门控离子 通 道 及机械门控离子通 道乙 酰 胆 碱 受 体 。症肌无力等疑难杂症至今对于上述疾病还没有对症治疗 ,2,( nAChR) 5 ,由围绕水中央通道的 个跨膜 亚 单 位 构 成属 于。的药物目前神经型乙酰胆碱受体的各种亚型已作为相关 ,3,。,配体门控离子通道的一个超家族对应于不同的亚组 件。疾病治疗新药研发的重要靶点 ( 1 : 10,1 : 4,,) nAChRs ,还存在各种受体亚型 ααββδγ 和 ε哺乳动物大 脑 中 表 达 了 大 量 的 亚 型它 们 具 ,4,,10,。 nAChRs ,作为配体门控离子通道在中枢神经和外周神经、、。 有不同 的 亚 型 结 构表 达 位 置药理和功能性 质在,11,,系 统中具有基本生理作用并且被认为是尼古丁上瘾最主nAChRs 34 ,,中αβ表达 于 自 主 神 经被发现于哺乳动物 ,5,,12,,13,。nAChRs ,要 介质神经型 与各种神经疾病有关如 老 年 痴 ,。34 脑中并且是脑中存在的最 普 遍 的 亚 型αβ受 体 ,6,,14,、、,呆症帕金森综合症癫痫以及精神分裂症 等且 这 些 疾 ,,可以控制低钙的 渗 透并 且 受 到拮抗剂激活时具 有 迅 ,7,,15,nAChRs 。病都与 的表达或分布的改变有关尼古丁止痛 的。34 ,速脱敏的生 理 功 能在自主神经系统中αβ是 调 ,13,nAChRs 性能引起研究人员研发神经系统中以 为特定靶 点的nAChR 。节 类胆碱作用的 中最丰富的类型合成的苯丙 ,化合物的兴趣且目标是得到具有尼古丁止痛效果而 没有其,34 胺 类似物中大多数都表现出与苯丙胺相似的对人类 αβ,8,。,MA( 副作用的化合物到目前为止毒素肽 ?即 34 ,受 体的选择性抑制作用且 对 αβ受体具有更强的亲 ,16,Zconotde) Prat,iiil已经被化学合成并命名为 其 具 有 很 高 的 。AuIB 34 ,合 力同时芋螺毒素 对于 αβ也是一种选择,17,,镇痛活性且不成瘾并且已经作为一种治疗顽固性疼痛的 商,AuIB 性拮 抗剂且 的球状和带状同分异构 体都对其具,9,,18,。业化药物上市 。有抑 制作用而两种同分异构体在抑制机制上有所不 ( nAChRs) 烟碱乙酰胆碱 受 体 是 一 种 神 经 递 质 介 导 的 离,AuIB 3? 4 RNA 10? 1同带 状 只竞争性抑制 αβ为 的烟碱 ,( CNS) , 子通道受体介导众多中枢神经系统 的生理功能包,AuIB 型乙酰胆 碱受体而球状 主要是通过非竞争性抑制作、、、,括学习记忆应答镇痛和运动控制等这些受体既存在 于,3、4 用抑 制 无论任何比例注射的 αβ烟碱型乙酰胆碱受体,18,,,、突触后也存在于突触前及其末端激 活 多 巴 胺去 甲 肾 。 Xenopusl aevis ( South African是一种南非生长 的 爪 蟾 2011-05-302011-07-14: : 收稿日期修回日期 : ( 2009ZX09103-644) ; ( 30860368) 。基金项目重大新药创制国家科技重大专项课题国家自然科学基金 Clawed Toad) 。1. 0 :30 min,,,其卵母细胞是一种巨大细胞直径可达 在冰冻麻醉状态下于下腹部正中碎冰中低温麻醉 1. 2 mm。1971 Gurdon 9S0. 5 cm 0. 5 cm ,自 年 首先将兔的网织红细胞 偏外 左右纵 向 切 开 一 约 的 小 口取 出 足 量 ,19,mRNA ,,导入其中成功地表达出珠蛋白后作为一种功能。OR2 的卵母细胞在含 胶 原 酶 的 溶液中室温下振荡消化 ,、、, 性表达系统因其具有操作简单易培养表达稳定等优点1. 5 : 2. 0 h,。待大多数细胞呈单个细胞时终止消化用 ,20,。,卵母细胞表达技术已被国外实验室普遍应用至今国 OR2 ND96 ,溶液反复清 洗 后置 于 含 适 量种类抗生素的 缓 内外已有一些 研 究 工 作 者将外源性基因注入爪蟾卵母细 ( 96. 0 mmol / L NaCl,2. 0 mmol / L KCl,1. 8 mmol / 冲 液 ,,胞通过翻译将膜蛋白整合到活细胞膜中并 显 示 一 定 的 L ,19,21-23,。 功能CaCl,1. 0 mmol / L MgCl,5. 0 mmol / L HEPES,pH 7. 1 : 2 2 7. 5) 17 ? 。,,中于 培养箱中培养成熟的卵母细胞呈球形 1 材料 ,“”“饱满由灰褐色的动物极半球和近白色的植物 ” 极半球1. 1 、、菌种质粒实验动物及培养基 。1. 0 : 1. 5 mm 、、构成挑选直径 大小动植物极境界分明表 DH5,7 0 ? ; 3、α 大肠杆菌甘油管保存于 分 别 含 有 α ,面清洁不残留纤维组织及毛细血管及有一定张力的健康 4 S, Heinemann ( Salk Insti-β乙酰胆碱受体基因的质粒来自 ,3、4 细胞用微量注射器将制备好的 αβ乙 酰 胆 碱 受 tute,San Dego,C) ; iA的实验室成熟的雌性非洲爪蟾为美国 ; LB 。cRNA ,进口大肠杆菌培养基为 液体或固体培养基 体 等量混合后注射到爪蟾卵母细胞的胞质中每个细1. 2cRNA 5 : 10 ng。胞 注射 的量为每个亚基 注射后的卵母细试剂及仪器 、、 ND96 17 ? 24 h 。,质粒中量抽提试剂盒限制性内切酶分子质量等胞 置于 溶液中培养 后用于电流检测 常规分子生物学试剂购自上海碧云天生物技术有限公司或 2. 4 ( Ach) 乙酰胆碱门控电流记录 TaKaRa SanPrep ; PCR 大连宝生物工程有限公司柱 式 产 物 纯34 nAChR 利用双电极电压钳系统测定 αβ的乙酰胆碱 ; cRNA 化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。30 L 门控电流将卵母细胞固定在容积为 μ的 细 胞 槽 mMESSAGE mMACHINE SP6 、T7K it、 MEGA clear 合 成 试 剂 盒 ,中 Kit Ambion ; 购自美国 公司检测电 流 的 电 生 理 仪器为双电, 将电流电极与电压电极同时插入细胞中设置钳制电压为 ( MDC,: AXOCLAMP 900A) ; ( 极电压钳型号微电 极拉 制 仪 美 国 , 70 mv。1 mol / L atropine 0. 1 gm / 细胞灌流液为含有 和 Sutter ,P-97 ) ; 公 司研究级体视显微镜 mL BSA ND96 1 :2 ) mL / min,,( 的 缓冲液灌流速度为每分 钟( OLYMPUS,SZX-ILLD2-200 ) ; ( Sutter ,显 微 注 射 仪 美 国 公 司1s 100 mol / L Ach 25? Ach ,给 的 μ的 脉冲室温下记录 脉 3 结果 Nanoter 2000) li。等 ,cRNA 冲产生的电流同时以没有注射 和注射等量双蒸水 的 。卵母细胞为对照 3. 13、4 nAChR αβ基因的质粒提取含有 2 方法 9 mL 3、用中量抽提试剂盒从 菌液中分别提取含有 α 2. 1 、3、4 αβ乙酰胆碱受体基因质粒的转化提取和线性1 1. 0% 4 nAChR ,L β基因的质粒分别 取 μ质 粒 于 琼 脂 糖 化 ,1 。1 L 凝胶电泳如图 所 示取 μ质粒用分光光度计检DH5,用氯化钙 法 制 备 α 大肠杆菌感受态细胞用 于 = 1 DNA 260 nm A ) ,A( 测 时 相 当 于在 波 长 的 吸 光 度 260 3、4 。αβ乙酰胆碱受体基因质粒的转化转化子活化后培养 50 g / mL DNA,3、4 μ双链 由此计 算 出 αβ质 粒 浓 度 分 别 LB ,9 mL 在 液体培养基中用中量试剂盒从 菌液中提取质 为 ,1 1 L ,L 粒取 μ质粒电泳检测其质量取 μ质粒用分光光0. 542 6 g / L 0. 556 3 g / L( 1) 。μμ和 μμ表 度 。EcoR、Xho3、4 计测定浓度和纯度分别 用 ??对 αβ乙 酰 , 胆碱受体基因质粒进行酶切使之线性化线性化质粒电泳 ,cRNA 。检测后用于体 外 反 转 录 合 成 的 模 板酶 切 反 应 体 。系参照说明书进行设定 2. 2 3、4 αβ乙酰胆碱受体基因的体外转录 mMESSAGE mMACHINE SP6 、T7K it 分别用 对纯化后 3、4 ,的线性 αβ乙酰胆碱受体基因进行体外转录操作步骤 ,20 L,37 ? 参照说明书进行转录体系的反应体积为 μ水浴 2 h。MEGA clear Kit 3、4 用 对 转 录 得 到 的 αβ乙 酰 胆 碱 M1,DL2000 DNA Marker; M2, ,H indDNA Marker;λ ? 受 1, plasmid; 2, 4 plasmid3 αβ cRNA 。cRNA 体 进行纯化用分光光度计测定纯化后 的浓 Extraction of plasmids 3 and Fg 1iα ,, 70 ? 。度和纯度然后分装保存于 4β 3. 2 3、4 Concentration and purity of 3 and 4 Tab 1αβ质粒的酶切线性化αβ plasmids, 3、4 coR、XhoE对所提质粒 αβ分 别 用 ??进 行 酶 切 线 linearied DNAs andc RNAs ,2. 5 h 3 1. 0% ,L 性化酶切 后分别取 μ酶切液于 琼脂糖PurityConsistency Type ( g / ( A/ A)μμ凝 260 280 L) 。2 ,DNA ,胶电泳如图 所 示酶 切 后 的 线 性 化 为 一 条 带说 3Plasmid0. 542 61. 733 3α 。明酶切完全4Linearized plasmid0. 556 31. 771 7β 30. 453 32. 071 5α 40. 298 92. 207 9β 3cRNA0. 454 01. 974 3α 40. 805 41. 923 2β 3. 534 Ach αβ乙酰胆碱受体 门控电流的检测 34 nAChR 经双电极电压钳系统测定 αβ的乙酰胆碱门 ,( 1 ) 控电流发 现未注射空白对照组 对 照 组 和 注 射 等 量 ddHO( 2) Ach ,,对照组 的卵母细胞进行 脉冲激活时没有 2 ( 4 34 A B) ,任何电流产生 图 中 的 和 而 注 射 了 αβ乙 酰 胆 M, DL2000 DNA Marker; 1, nearzed pasmd 4; 2, 4 liilicRNA Ach ,ββ碱受体 的卵母细胞进行 脉冲激活时产 生 了 明 3,linearized plpalsamsimdi d;3; 4, 3 αα ,( 4 34 C) ,显的内向电流且很稳定图 中的 说明 αβ乙酰Fig 2inearized plasmids 3 and Lpasmdαli 胆 4β , 碱受体在卵母细胞膜上表 达 成 功可用作大通量生物毒素 3. 3 线性化质粒的纯化 。 等物质的活性筛选实验模型SanPrep PCR ,用 柱式 产 物 纯化试剂盒纯化酶切液取 3 1. 0% 3 L 。,μ于 琼脂糖 凝 胶 电 泳如 图 所 示纯 化 后 的 线 DNA 1 ,。L 性化 为一条 带说 明 纯 化 成 功取 μ纯 化 后 的 线 DNA 260 nm DNA 性化 用分光光 度 计 检 测 在 波 长 的 吸 光 Control 1; B Control 2;A ( A) ,3、4 0. 453 度计算出 αβ酶切液纯化后浓 度 分 别 为 C Current traces o3f 4 nAChR gated byA ch. pulseαβ Fig 4 Current traces 3of 4 nAChR gated byA ch. αβ3, pusel 0. 298 9 g / L( 1) 。μμ表 4 讨论 ,cRNA 。实验过程中体外转录 的步骤很关键应注意控 ,20 L 制转录过程中的量每 μ体系的体外转录反应所用 DNA 1 g ,线性化 模板量约 μ左右过多或过少都会影响转录 ,24,,cRNA 。效果质 量的好坏直接影响卵母细胞的表 达此 , 外含有受体基因的质粒线性化结果一定要在琼脂糖凝胶电 ,,。,泳上检测确保酶切完全才能进行后续的实验否则在进 ,,行酶切液纯化回收时把没有酶切的质粒也回收回来这样 purification of linearized plasmid 1, 。就会影响到下游体外转录的效率和转录产物的纯度对于 2, purification of linearized plasmid 4;β 3,,,α酶切体系的选择由于所需酶切的质粒量较大因此可以选 Fig 3 Purification of linearized plasmids 3 α,,择多个较小酶切体系也可选择一个较大酶切体系但最终 3. 43、4 cRNA β乙酰胆碱受体 浓度测定α and 4β ,都要电泳检测后确定酶切已完全线性化线性化质粒需纯化 3、4 ,以上述纯化后的线性化 αβ质粒为模板进行 体 ,DNA 后回收集中到一管中以确保回收后的线性化质粒 具 3、4 1 cRNA。L 反转录合成外了 αβ乙酰胆碱受体的 取 μ纯 。400 1 h L ,有较高浓度对于 μ的 酶 切 体 系酶 切 已 酶 切 化 ,DNA 。完 全酶切时间过长可能会导致酶切后 片段的降解 cRNA 260 nm ,A= 1 ( A) 后 检测在波长 的吸光度时相当 260 cRNA 制备过程中,必须测定质粒、线性化质粒 DNA 模 40 g / mL RNA,3、4 于 由此计算出纯化后的 αβ受 体 亚 μ 、cRNA ,板反转录合成的 产物的浓度和纯度以确保实验过 基 cRNA 0. 454 0, 0. 805 4 g / L; ,A浓度分别 为 μμ同 时测 260 neurons,J,, J Physiol,2000,527: 515.、DNA RNA ,质以及 酶污染降解才能达到注射 量 和 表 达 成 ,13, CostaV ,Nstr A,Cavalli ,et a, A structura mode of iiAlll。 功的要求agonsti binding to the lapha3beta4 neuronal nicotinic receptor,J,, Br 参 考 文 献 J ,1 , ,, ,J,, ,张宗明裘法 祖离 子 通 道 与 疾 病世界华人消化杂志 Pharmacol,2003,140( 5) : 921. 2005,5( 13) : 585. ,14, Haghighi A P,Cooper E, A molecular link betweeni nward recti- ,2 , Itier V,Bertrand D, Neuronal nicotinic receptors: from fication and calcium permeability of neuronal nicotinic proteni acetylcho- structure tofun ction,J,, FEBS Lett,2001,504: 118. line α3β4 and α4β2 receptors,J,, J Neurosc,2000,20: 529.i ,3 , Barnard E , The transmttergated channes a range orfe ceptorAi-l: ,15, ChavezNoriega L E,Crona J H,Washburn M S,et a, Pharmaco-l- types and rsutctures,J,, Trends PharmacoS ci,1996,17: 305. logical characterization of recombinant human neuronal ,4 , Changeux J P, The TIPS Lecture The c ontnc iiinicotinic acetylcholine acetylcholine receptors hα 2β2,hα2β4,hα3β2,hα3β4,hα4β2, receptor: an allosteric protein prototype olif gand-gated ion hα4β4 and hα7 expressedin Xenopus oocyte,sJ,, J Pharmacol chan- Exp Ther,1997,280: 346. nels,J,, Trends Pharmacol Sci,1990,11: 485. ,16, Carroll F I,Blough B E,Mascarella S W,et al, Synthesis and bi- ,5 , Benjamin Free R,Mckay SB ,Gottlieb P D,et a, Expression ofl ological evaluation of bupropion analogues as potential Native α3β4 Neuronal Nicotinic Receptors: Binding and pharmaco- Func- therapies for smoking cessation ,J,, J Med Chem,2010,53 tional Studies Investigating Turnover Surface and ( 5) : 2204. 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