ES细胞克隆动物技术研究进展

ES细胞克隆动物技术研究进展 一 第26卷第4 20O0年8.蹦一 V0l_26No.4 Jun.2000 文章编号:1001—9111【2000)04.0040.05 ES细胞克隆动物技术研究进展 效梅.安立窦忠英.隔-————一———一一 (西北农林科技大学动物科学与动物医学学院,陕西橱陵712100) f 摘要:ES细胞克隆动特在提高良种动特繁殖率和保护动特遗传费源领域具有重要的 作用.ES细胞棱移植是生产克隆动特的重要,ES细胞克隆率低和克隆动柏生话力 低是其存在的主要问题. 关键词:胚胎干细胞抚隆拔移植 -_’’’..一?..’.一?.’一 中囤分类号:$827.36Q954.432文献标识码:A 白Ev哪和I(a曲nan从延迟着床胚胎中分离 出小鼠胚胎干细胞(EcStefllcel1.ES细胞) 以来,包括小鼠在内的各种动物细胞的分离受 到国内外科学家的关注】.其主要原因在于动物 ES细胞具有发育全能性,能参与包括生殖腺在内 的各种组织的发育.目前.动物ES细胞在克隆动 剖建人类遗传疾病动物模 物.生产转基因动物, 型.研究细胞分化.细胞与细胞的相互关系以及人 类ES细胞定向分化与克隆制造用于器官移植的 组织器官等领域具有较为广阔的应用前景.本文 对动物ES细胞克隆动物的优势,方法,存在的i可 题以及应用前景作以述评和展望 1利用ES细胞克隆动物的方法 1.1方法 利用ES细胞核移植技术.就可在短期内克 隆大量的遗传同质型动物.所谓ES细胞核移植 技术就是将具有发育全能性的ES细胞导人去除 染色质的成熟的卵母细胞.经过电泳冲作用使卵 母细胞质和导人的细胞融台和激活,使细胞分裂 发育形成胚胎的过程.将重组胚通过胚胎移植 的方法移植给受体母畜,使其妊娠产仔,就可获 得克隆动物. 1.2进展 ES细胞既可以在体外培养大量增殖传代,冷 冻保存,又能保持全能性,是进行细胞核移植的 理想的供体材料.用从绵羊(威尔士山地羊)胚 胎中分离的ES样细胞作供体进行核移植.重构 胚发育桑(囊)胚的比率为18.3%.有5个ES样 细胞核移植羊出生J.甩绵羊和山羊的ES类细 胞进行核移植,获得了发育至8,12细胞期的重 构胚J.将小鼠ES细胞用不具活性的sendai病 毒导人去核卵母细胞,并用乙醇激活,100V或 140V电脉冲融台,重构胚发育至2--细胞,4--细 胞,桑椹胚和囊胚的比率分别为41%,60%. 25%,44%,12%,24%和12%,18%【4】.小 鼠ES细胞重构胚在受体体内发育至16d,但无 ES细胞核移植后代产生】.兔类ES细胞重构 ?收稿日期:1999—10—28 基金项目:国家自然科学基金资助(批准号:39670359),国家攻关课题资助(编号96.co1.03),较 青年教师专项基金资助. 作者简介:效梅(1965一),女,西北农林科技大学动物科学与动物医学学院讲师. 第4期效梅等:ES细胞克隆动物技术研究进展?41 胚经培养后,发育至桑椹和囊胚的比率为23%和 26%【引.Modlinski【将牛Es细胞导人去棱的卵 母细胞中,重组胚大多数死亡退化.Strelchenko (1994)将发育至囊胚的ES细胞重构胚移植给受 体.重构胚发育至45d时,胎儿心跳清失_8J. Sfice(1994)将牛类ES细胞核移植胚和嵌合胚移 植给受体,核移植胚最长妊娠80d,嵌合胚最长妊 娠200dJ.Myioshik(1998)以传24代的猪类ES 作供体进行细胞核移植,融合宰和卵裂率分别为 44%和31%【州.MichelleSirn5和N.LHrSc【1] 将培养6,101d的牛ICM细胞棱移植到去棱卵 母细胞,卵裂宰为70%,囊胚率为24%,经胚胎移 植有l3头妊娠,出生了4头牛犊.KeeferC-- L_】在25个实验中有12个实验可观察到ES细 胞棱移植胚胎发育至囊胚.将发育至囊囊胚的 26枚ICM细胞进行棱移植,获得了4头核移植 牛.但至今为止,尚未有ES细胞棱移植牛出生 的报道. 2用ES细胞克隆动物的优势 2.1ES细胞克隆动橱的特性 在自然情况下,高等动物只有有性繁殖,高 等动物有性生殖周期长,产仔数少,这给优良品 种的繁殖和培育带来困难.寻求具有全能性的 细胞,井利用全能性细胞繁殖动物,成为加速动 物良种培育的重要途径.近年来的研究明,动 物早期胚胎细胞,胚胎内细胞团细胞,ES细胞和 原始生殖细胞均具有全能性和多能性.动物早 期胚胎细胞数量少,在体外培养易分化.动物原 始生殖细胞具有和ES细胞相似的特性,在体外 诱导分化可形成多种组织,但PGCs细胞数量有 限,这也限制了PGCs细胞在动物克隆中的应用. 动物ES细胞是由胚胎内细胞团或PGCs中分离 的具有全能性和多能性的细胞.由于其在体外 抑制分化培养中的保持全能性和多能性,并可以 在体外增殖,玲冻,因面是克隆动物的理想材料. 2.2用ES细胞克隆动物的意义 (1)大幅度提高良种家畜的繁殖效率 ES细胞胚胎嵌合,细胞棱移植技术可使一头 良种家畜在短期内生产无效的具有遗传同质型 的动物.这不但可以充分发挥良种动物的生产 潜力,而且可以迅速扩大良种动物群体规模,加 速动物良种化进程,提高目的基因在动物群体中 的频率. (2)抢救濒危动物,保存稀有动物遗传资源 利用ES细胞克隆动物一方面在短期内可以 繁殖大量的濒危动物,迅速扩大濒危动物的群体 效量,另一方面可以通过玲冻保存胚胎细胞,ES 细胞和体细胞的方法保存具有发育全能性的细 胞,需要对用玲冻的全能性细胞作供体进行核移 植克隆稀有动物. (3)剖造新物种 用异种动物的ES细胞棱移植和异种动物胚 胎嵌合方法可获得异种动物嵌合体,这样有可能 克服种间繁殖障碍,创造出新物种,获得用传统 交配方法无法获得的新性状. (4)为实验生物学提供新材料 利用ES细胞棱移植技术可以同对克隆遗传 基础完全相同的生物个体.这些生物个体用于 遗传的估测,饲辩营养价值的评定及环境与动物 关系的研究领域,采用胚胎嵌合技术将少量外源 细胞注人囊胚,通过克隆动物组织变化,可 以用来研究细胞分化和细胞免疫,胚胎细胞多能 性和全能性等生物领域的重大问题. (5)建立动物模型 人类许多疾病,大都可以利用嵌合技术和棱 移植技术建立特定的动物疾病模型.如利用基 因工程的技术可以人为制做基因缺失突变ES细 胞抹,将台有突变基因的ES细胞与正常胚胎嵌 合所获得的嵌合体,可以为某些遗传病的研究提 供动物模型. 3利用ES细胞克隆动物存在的问题 利用胚胎嵌合和ES细胞棱移植技术克隆动 物面临的主要问题是: 3+1ES细胞克隆率低 迄今为止,仅在小鼠分离克隆了真正具有全 能性的ES细胞,在牛,羊,猪,兔等家畜,仅获得 了类ES细胞.胚胎附植宰及ICM形成率低(不 超过60%)是ES细胞克隆率低的主要原因.在 Es细胞培养和传代过程中,污染和培养条件的不 42黄牛杂志第26卷 稳定性使ES细胞分离更为困难.在垒世界,仅 有英国,美国,德国,日本和中国等少数国家的实 验室分离到猪,山羊,绵羊,兔的类ES细胞.在 中国,从事ES细胞研究的大多数实验室主要分 离小鼠ES细胞,只有少数单位从事牛,猪和兔等 家畜的ES细胞的分离与克隆的研究.其主要原 因是牛,猪等家畜ES细胞分离的难度更大.虽 然小鼠ES细胞的遗传操作具有美好的前景,但 是由于缺少具有商业应用价值的家畜的ES细 胞,使得该项技术难以在家畜生产中得到应用. 因此,提高各种家畜的ES细胞分离和克隆的成 功率,具有重大的理论意义和实践价值. 32ES细胞核移植技术尚不成熟 尽管刺用细胞核移植技术已成功地克隆了 动物,但该项技术还依然不成熟,其主要表现就 是核移胚发育率低(发育至囊胚比率10, 20%)[1. TstmodaY以牛ES细胞作供体进行细胞核 移植,重构胚发育至2--细胞,4一细胞,8一细胞, 桑椹胚和囊胚的比率分别为41%,60%,25% -- 44%,12%,24%和12%,18%;Campbell将 羊的ES细胞导人去核卵母细胞.重构胚发育为 囊胚的比率为16.3%(8次实验的平均值).Md— neck-Tillmarm将绵羊和山羊类ES细胞导人去核 卵母细胞,发育至8,12细胞的胚胎数只有 n.8%.役有一个胚胎发育至囊胚.Gao_l将山 羊ES样细胞导人去核卵母细胞,重构胚发育使 受体羊妊娠.Campbell用山羊第三代ES样细胞 进行核移植,获得了活的核移植羔羊_l. S~dchenko_l将牛的ES细胞导人去核卵母细 胞.重构胚使晏一体牛妊娠55d.但无ES细胞核移 植牛出生在重构胚的发育过程中,ES细胞的印迹 现象(ES细胞的特异需求)与去核卵母细胞发育 环境不扔调.限制了ES克隆胚的发育. 3.3胚胎细胞核移植动物的生活力低 Campbell将ES细胞重构胚移植给受体羊, 其妊娠率为l6.7,55.0%.重构胚发育至胎儿 的比率为12.5,21.25%.将44枚重构胚移植给 受体母畜.仅有5头羊出生.Keefer将牛的 ICM细胞导人去核卵母细胞,重构胚(948枚)发 育至囊胚的比率不到30%,将发育至囊胚的26 枚胚胎移植给受体牛6枚妊娠至30d.其中2个 胎儿流产,出生犊牛有2个死亡(死亡率为 50%)[12]oSims将培养的ICM细胞导人去核卵 母细胞,重构胚发育至囊胚后,移人受体母牛.牛 妊娠至42d,56d,70d,150d和180d的比率分别 为49%,37%,27%,21%,15%.移植34枚 ICM细胞重构胚,仅有4头活牛犊产生 (11%)”7J. 4动物克隆技术的新发展 4.1方法 将体细胞在体外培养,经过饥饿法或添加其 它药品,诱导细胞使基因组重排,使基因的程序 性表达重新从头起动,这样就使已丧失全能性的 细胞恢复全能性.以具有全能性的体细胞作供 体进行核移植.可获得体细胞核移植重构胚.体 细胞来源广,取材方便,利用体细胞核移植克隆 动物的方莹更为简便,体细胞核移植克隆动物的 成功突破了成年动物细胞分化具有单向性和不 可逆性的传统理论,从实践角度证实了已分化的 体细胞仍具有可塑性,可恢复其全能性的新观 点. 4.2进展 (1)乳腺上皮细胞核移植WilmutI_1用成 年绵羊乳腺上皮细胞,胎儿成纤维细胞和胚胎细 胞作供体进行核移植,获得了体细胞克隆胚胎. 其中,乳腺上皮细胞核移植胚胎桑囊率为 j1.7%.妊娠率7.7%,产羔率(羔羊数/移植重构 胚数)为3.4%;David的DNA微卫星多态型分析 和EislterDNA指数分析表明.多莉”的确是成年 羊乳腺上皮细胞核移植的后代”‘J. (2梅等tES细胞克隆动物技术研究进展?43 构胚移植给受体鼠.有31个克隆鼠出生Kato Yokol笠将牛颗粒细胞和输卵管上皮细胞导人去 核卵母细胞.获得了重构胚.将发育至囊胚的lO 枚胚胎移植给5头牛.受体牛均妊娠,出生8头牛 犊.其中出生时.有3头犊牛死亡,1头牛出生后 3d死亡.解剖死亡牛犊.未发现任何异常.犊牛 死亡可能是环境因素造成的. (3)成纤维细胞CibelliJo8eB】.以CMV (Cytecnegalovlrus)作载体.将乳糖基因启动子 +新霉素抗性基因导人处于G期(非静止期)的 胎儿成纤维细胞.将转染有外源基因的胎儿成 纤维细胞在含有新霉素的培养基中筛选2周.以 具有活力的胎儿成纤维细胞作供体进行细胞校 移植,重构胚培养1周发育为囊胚的比率为 12%.将重构胚进行胚胎移植.有6头牛妊娠 40d以上.5头牛妊娠60d以上,1头妊娠至249d 流产.有4头克隆犊出生.其中1头牛犊牛在出 生后5d.因肺出血死亡.尽管哺乳动物体细胞核 移植研究已取得进展,但体细胞克隆动物胎儿畸 形率和死亡率高.成活率低,且有早衰迹象.体 细胞校移植胚胎发育障碍与培养的细胞的状蒜 及操作有关.体细胞核移植动物发育率低和死 亡率高是操作过程还是其它因子所致.尚不清 楚.总之.体细胞核移植的发展得益于ES细胞 核移植的启迪,体细胞核移植尽管具有取材方便 的优点.但其成功率低,尚有许多问题有待研究. ES细胞不但是动物克隆的材料.而且在研究细 胞分化.胚胎发育过程中具有不可替代的作用. 因而.体细胞不可能完垒代替ES细胞在胚胎工 程及发育生物学中的作用. 参考文献: [1]EvansM】.KaufmanMHEstablishm~tc~ture ofpIpm即ncellsfrommol/s~embryos[J]Na— ture,198l,292(9】:154,156. 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Progressonanimalsclonedbynucleartransfer fromembryonicstemcell XIAOMei,ANLi—long,DOUZhong—ylng,QIUHuai (Cd2a~gAn/ma/Sc~ceand肘自妊.Scmbryonicstemcellisthemo6timportantmethod todoneanima1.ThechiefpfolbemarelowefficenceofisolationanddoneofEScelland lowsurvivalrateofanimalsdonedbynucleartransferfromEScells. Keywords:EmbryonicStemcell;Clone;animal;Nucleartranfer (上接第28页) ReproductivePerformanceofEarlyWeaningReplacementHeifers TANNian-nian,HUANGChun—yllan,RENJi—hu,GUANYun-sheng (An/too/Husband~t~reau?i-f岛龃Prod’nee,M,f?一埘044000,) Abstract:Eighteenreplacementheiferswereselectedanddividedinto2groupswith6 heiferseachtoStUdytheearlysupplement,earlyweaningandsuitablematingtech— niques.Thefeedingexperimentshowedthatthepubertyageofheifersingroup1aver— aged10.3months.thepregnancyrateofheifersin1stand2ndestl~ouswas83.3% withreproductivesurvivalrateof83.3%:thecorrespondingvaluesingroup2were 11.1months.66.7%,and66.7%respectively;incontrolgroupwere12.7months, 50%.and50%respectively. Keywords:Replacementheifer;Reproductionperformance 加n