【doc】自然杀伤细胞在人淋巴器官内的分布

【doc】自然杀伤细胞在人淋巴器官内的分布 自然杀伤细胞在人淋巴器官内的分布 第22卷第4期 1091年l0月 解剖 ACTAANATOMICASlNlCA Vo1.22.No.4 0ct1991 自然杀伤细胞在人淋巴器官内的分布 葛振华王若愚万集今" (福建省中医药研究所,福州35000~,?福建中医学院组织学胚胎学教研室) 摘要本文用Lcu7单克隆抗体.对淋巴结,扁桃体,脾和胸腺内自然杀伤细胞(NK细胞)盼 分布,进行兜痉组织化学研究.结果证明.NK细胞主要分布在B细胞的分布区.如淋巴结和扁桃 体改毂淋巴小结的生发中心.在副应质区和髓质部,也有少数散在的NK细胞.脾畦的NK细胞 主要见于脾小结的中心或自髓外周的边缘区,但动脉周圈淋巴鞘为【!Il性.此外,少数NK细胞也见 于红髓.胸腺内的NK细胞仅见于髓质部.随年龄增长.胸腺内的NK细胞数目减少.Leu7抗体 也能与胸腺小叶皮质部外周上皮细胞内的角蛋白有交叉反应.淋巴器官的NK细胞形态上颇相似, 冰冻和石蜡切片的染色结果一致. 关键词自然杀伤细胞(NK细胞)淋巴器官免痉组织化学人 人的自然杀伤细胞(NK细胞)是一种较大的淋巴细胞,胞质内含有嗜天青颗粒[1.它册 虽然缺乏一般T细胞膜表面的标志物,但具有T细胞的功能特性.为了探讨NK细 胞在机体 内的生物学作用和免疫功能,近年来,对NK细胞已进行了免疫学,形态学和免疫电镜的观 察[.Steven等用免疫组织化学方法,比较研究了反应性淋巴组织和恶性淋巴瘤内NK 细胞的分布.本文利用能显示NK细胞的Lcu7(HNK1)单克隆抗体,在冰冻和石蜡切片 上,利用免疫组织化学技术,观察正常人不同淋巴器官内NK细胞的分布,为近一步了解其 功能,以及NK细胞与T畴胞之间的可能关系作一初步探讨 和方法 (一)标本材料人扁桃体和淋巴结备10例,淋巴结取自胃溃疡手术时肠系膜处.脾脏 5例(年龄24~46岁,取白猝死者).胸腺8倒(6例年龄在5,16岁之间,另2例年龄分别 为28和39岁,均自先天性心脏病患者外科手术肘获得).所有标本用异戊烷和液氨冷冻, 3%羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose)包埋,恒温冷冻切片机切片,切片厚5I.tm,置 于明胶处理过的玻片上,放4~C冰箱保存.部分组织用Bouin液固定,常规石蜡包埋,切片 厚5v,m,用于HE和NK细胞免疫组织化学染色 (二)试剂:3,3t-二氨基联苯胺(DAB)为美国Aldrich公司产品.本文所用的抗体的来 源,反应特性及稀释度见表1. (三)免疫组织化学染色法:NK细胞和T细胞冰冻切片染色法按Hsu的方法进行,但 稍加改良,用磷酸缓冲液替代Tris缓冲液用于NK细胞染色的石蜡切片,经脱蜡入水后, 再按冰凉切片的染色法进行. 对照片用小鼠稀释(1:40)血清代替第一抗体,其他步骤与实验片相同. '丰岍究由福建省自蠡!;科学基金资助 4期葛振华等.自然杀伤细胞在人淋巴器自内的分布400 表1抗体来源反应特性和稀释度 抗体反应特性稀释度来源 Leu7NK1:30BcctonDicklason Leu3a辅助T细咆1:40BeCtORDLckinSOn Leu2a抑制T细胞l:40BeCtORD【ckLnSOn 生物寨标记的马抗小鼠lgG1:1000VectDr 生物素标记的马抗小鼠IgM1:1O0OVect0t- 结果 NK细胞的阳性反应,主要在细胞质膜上或胞质内呈棕黄色.细胞的外形不规则,体积 比T细胞大.NK细胞在冰冻或石蜡切片上,染色结果相似,背景清晰,无非特异性染色.T 细胞反应亦呈棕黄色,仅在质膜上,胞质阴性,故细胞外形呈环状.对照片为阴性NK细 胞和T细胞亚群在淋巴器官内的主要分布见表2. 表2NK细胞,辅助T细胞和抑制T细胞在人淋巴器官内的分布 细胞淋巴结扁桃体脾脏胸腺 辅助T细胞主要分布在刮皮质区淋巴小锆间和弥散淋劫脉周围琳巴鞘边皮质部和髓质部 和淋巴小结之阿,少戴巴组缎,少数位于生发缘区和生发中心红髓 位于生发中心中心 抑制T细拖副皮质区和琳巴小结琳巴小结问和弥散淋动脉周围淋巴稍和红皮质郝和髓质部,在 之间巴组织髓髓质部辅助T细胞多于 抑制T细胞 NK细胞生发中心和骷质部生发中心和弥散淋巴生发中心,脾小结外髓质部 组织周的遵壤区和红髓 一 ,T细胞 淋巴结的辅助T细胞主要分布在副皮质区和淋巴小结之间,次级淋巴小结的生发中心也 有少数辅助T细胞(图1).抑制T细胞的分布与辅助T细胞相似,但在生发中心看不到抑制T 细胞(图2)j此外,在淋巴结的髓质部也有少量T细胞.扁桃体内T细胞亚群的分布与淋巴 结相同.但增生肥大的扁桃体内,抑制T细胞数量较一般扁桃体少.脾脏内T细胞亚群主要 集中在动脉周围淋巴鞘(图3),少量T细胞也见于脾小结外周的边缘区,生发中心和红髓. 胸腺皮,髓质基本为T细胞所占据(图4),但髓质部辅助T细胞,抑制T细胞的数量不等,辅 助T细胞一般多于抑制T细胞.本研究中两例成人的胸腺,由于胸腺组织萎缩,组织结构改 变,虽然保留部分皮质,但皮质内的T细胞显着减少. =,NK细胞 淋巴结的NK细胞,数目少,主要位于次级淋巴小结的生发中心(图5),也有位于生发 中心的一端,呈极性排列(图6).有的淋巴小结则完垒缺乏NK细胞,但在淋巴小结之间未 见有NK细胞.扁桃体内NK细胞分布与淋巴结基本相似(图7).增生肥大的扁桃体,不但 生发中心的NK细胞数目明显增加,而且淋巴小结内的NK细胞也显着增加(图8),此外, 在弥散淋巴组织和上皮内也散在有少数NK细胞.脾脏内的NK细胞常位于脾小结的生发巾 410解翻船卷 心,及脾小结外周的边缘区(图9).红髓内的NK细胞则位于脾索和血窦;动脉周围淋巴鞘 处未发现有NK细胞.胸腺内的NK细胞数量较少,分布仅限于髓质部,皮质部为阴性.2 例成人胸腺内的NK细胞,数量较儿童和少年期的胸腺更为减少.此外在胸腺小叶皮质外周 及小叶间隔的边界处,与Leu7抗体有交叉反应,外观呈线条样结构(图10). 讨论 本研究显示淋巴器官内Leu7抗原,不仅用于冰冻切片,石蜡切片也同样可保留抗原活. 性,两者对NK细胞的染色效果相似;但石蜡切片较冰冻切片更便于操作.Tanakac曾采 用福尔马林固定切片,虽可显示NK细胞,但切片背景非特异性染色很深,不便于对结果评 价.为消除背景非特异性染色,必须经过透明质酸酶或蛋白酶处理,以去除背景的非特异性 染色.经长时间酶消化,既使染色程序复杂化,又会影响Leu7抗原的活性,从而降低了NK 细胞的染色效果.而Bouin液固定,则较好的克服了这一缺点. NK细胞与T细胞分布不同.NK细胞主要分布在B细胞分布区,如淋巴结和扁桃体的 NK细胞主要位于次级淋巴小结的生发中心.脾的NK细胞主要位于脾小绪的生发中心,或 脾小结外周的边缘区Leu2a和Leu3a的阳性T细胞,主要分布在扁桃俸的弥散淋巴组织和 淋巴结的副皮质区,脾畦的动脉周围淋巴鞘'9.虽然Leu3a阳性细胞也见于生发中心, 但Leu7抗体与Leu3a阳性细胞无交叉反应,这证明Leu7抗体在生发中心显示的 只是NK 细胞,而不包括Leu3a阳性细胞.少数Leu2a阳性细胞虽然与Leu7抗体有交叉反应…】, 但Leu2a阳性细胞主要分布在次级淋巴小结问和淋巴结的副皮质区,生发中心几乎阴性,而 且两种细胞的体积也有所不同.因此,目前Leu7抗体仍然被用于流式细胞光度计来分析细 胞悬液内的NK细胞,或用免疫组织化学技术来研究NK细胞.Leu3a阳性细胞经常出现 在淋巴小结的生发中心,与B细胞的分化和淋巴小结的形成有关.但NK细胞与Leu3a 阳性细胞同时位于生发中心,两者间的关系目前还不清楚.有的次级淋巴小结虽然缺乏NK 细胞,但常存有Leu3a阳性细胞,逸说明NK细胞在免疫功能上,有别于Leu3a阳性细? 胞.Ritchie等"认为,位于生发中心的NK细胞,在调节B细胞分化或淋巴小结增大方面 起作用.Tanaka在研究人脾内NK细胞时,发现NK细胞数量多少,取决于生发中心发. 育状态.如发育早期的生发中心,NK细胞多,而静止期的生发中心NK细胞少.我们的资 料证明增生肥大的扁挑体,淋巴小结内的NK细胞,比静止或正常淋巴小结有明显增加.选 些NK细胞在病理状态下显着增加的原因还不清楚,可能是由于抵御外来的微生物],或 抑制淋巴小结内B细胞的增生.然而,对分布在生发中心以外的NK细胞(脾脏的红髓, 淋巴结和胸腺的髓质部等)的功能了解得更少.Abo等已经证明,Leu7抗体能与两个或 三个不同NK细胞亚群起反应,这些不同的亚群代表着NK细胞在成熟过程中的不同阶段. Abo等报道外周血中的NK细胞,成熟比例高于淋巴结内的NK细胞.免疫电镜证实, 人类外周血内的细胞有两个亚群,大部分Leu7阳性细胞核/浆比例小,外形不规则,有发 育好的内质网以及致密颗粒,小部分NK细胞核/浆比例大,细胞规则,胞质内无致密颗粒…. Tanaka…报道,脾脏内NK细胞虽然对Leu7抗原的表达无区别,但在光镜下,按照它们的 分布和细胞的形态特征,可分为两组.一组是未成熟的,位于生发中心;另一组是较成熟的, 分布在红髓和自髓周围的边缘区,其形态与外周血中的大颗粒淋巴细胞相似但我们的资料 ,因为在光镜下,看不出在生发中心和红髓的NK细胞形态上不支持Tanaka的报道 或抗原 表达上有何不同.我们的资料显示,分布在不同淋巴器官内的NK细胞群,虽然形态多样, 4期葛振华等.自然杀伤细胞在人淋巴器官内的分布4l1 细胞大小不一,而这些细胞常混合分布,没有看到按照NK细胞的体积或形态而有各自的分 布区. 因为胸腺髓质有胸腺髓质内有少数NK细胞,其功能可能与B细胞分化有关…】,少教 B细胞.此外还证明,28~29岁成人胸腺内的NK细胞,已明显减少.值得注意的是,Leu7 抗体的阳性反应也出现在胸腺小叶间隔和皮质外周的上皮细胞,外规呈线条状,逸 与Chan 所报道的一致.Wirt用免疫组织化学染色证实,Leu7阳性上皮细咆内含有角蛋白成分, 推测线条样结构可能为上皮细胞内的角蛋白成分,因为在小叶周围的上皮细胞是一种特殊的 上皮细胞,这些细胞构成了胸腺主质和周围结缔组织的边界"1.胸隙瘤时,这些Leu7阳 性的线条样物质,4成为弥散或局灶状.这可能由于上皮细胞内结构分化紊乱所致15.本 实验证明,成人胸腺小叶周围的线条样结构消失,可能是由于上皮细胞退化所造成的结 果 本文照片由龚远芳协助,谨此志谢1990年4月收稿1991年4月修回 本文图1,l0见插周第5,12而 翻版说明 PC副皮质IZ,GC生发中心 周1^淋巴结.辅助T细胞主要分布在副庄埂区,生发中也有少数T细胞津寐切片Leuga抗体 染色x100 圈2^淋巴结撺制T细胞分布在副庄质医和帽状IZ(Mz),生发中心为阴性冰冻切片Leu2a抗 体色×1O0 匿3^脾脏动脉周围淋巴鞘处有大量辅助T细胞CA中央动抹冰冻切片Leu3a抗俸染色 ×200 国^胸腺切片(18岁)在髓质(M)和皮质(c,有大量Leu3a阳性细胞.HC胸腺小体LeuSa抗 体垫色×200 匿』.淋巴绪生震中心有许多探絷的NK细胞石蜡切片Leu7抗俸色x190 图6人淋巴结.NK细胞位千生发中心的上方石蜡切片Leu7抗体染色x150 固7^扁橇体生发中J.有数在的NK细胞冰冻切片×130 图8人增生肥大扁桃体.淋巴小结(LN)内有较多的NK细胞t此外,在豫敌群巴组 织和上皮内也有 N罡细胞(t)涑冻切片x209 圉9人脾脏生曼中心和生发中心外周的边缘区(Mz)有NK细胞冰冻切片x150 图10^胸穰.sP.小叶阐隔.小叶度质部(c)外周有线条棒结构ft)泳陈切片x100 参考文献 [I]PopPem丑S,etalReacdvity0fpresumedantinatural蚓】 ercellantibodyLeu7withintrafolli~ularT lymphocytes.ClinExplmmunol1983I84:834. 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Fjj?CollegeolTradltionalChineseMedicine) Leu7monoclonalantibodyandimmunohistochemicaltechnicwereusedtostudy thedistributionofNKcellsinhumanlymphnode,tonsil,spleenandthymusThe resultsindicatedthattheNKcellspredominatelydistributedinBcellarea,such asgerminalcenterofsecondaryfollicle,whichoccuredinlymphnodeandtonsil. AfewNKcellswereoundintheparacortexandmedullaoflymphnode. In thespleen,theNKcellsmainlylocatedinthegerminalcenterofsplenicnodulesand intheperipheryofwhitepulp.However,theNKcellswerenevershowninthe perarteriallymphaticsheath,someNKcellsalsoscatteredinthepulpcordand sinusesofredpulp.Inthethymus,theNKcellswererestrictedinthemedulla, andthenumberofNKcellsreducedintheagedthymus.Inaddition,theLeu7 antibodywasreactedwithepithelialcells,whichlocatedinthecorticalperipheryor thymiclobule.ThemorphologyofNKcellsindifferentlymphoidorganswassimilar. ThestainingintensityofLeu7antibodywasidenticalbothinthefrozenand paraffinsections. KEYWORDSNaturalkillercells;Immunohistichemistry;Lymphoidorgans; Huinan 张进路等.大鼠脊髓小脑前束起始细胞——脊髓边缘细胞突触形态学的电镜研究 (正文见371页,图酏明见插罔6页) 葛振华等.自然杀伤细胞在人淋巴器官内的分布 L{fI;