人血浆中全反式维甲酸、13-顺式维甲酸及9-顺式维甲酸浓度监测

人血浆中全反式维甲酸、13-顺式维甲酸及9-顺式维甲酸浓度监测 人血浆中全反式维甲酸、13-顺式维甲酸及 9-顺式维甲酸浓度监测 【摘要】 目的 建立高效液相色谱法同时测定人血浆中全反式维甲酸、13-顺式维甲酸和9-顺式维甲酸浓度。方法 色谱柱为KromasilC18柱(4(6 mm×250 mm，5 μm);柱温为室温。流动相A:甲醇;流动相B:0(01 mol/L醋酸钠缓冲液(pH=5(7)，梯度洗脱，流速1 ml/min;检测波长340 nm。结果 全反式维甲酸、13-顺式维甲酸和9-顺式维甲酸血药浓度在1,200 ng/ml范围内，浓度与峰面积比有良好的线性关系，最低检测浓度为0(5 ng/ml。全反式维甲酸方法回收率为97(22%,108(80%，日内RSD?8(24,，日间RSD?11(34%;13-顺式维甲酸方法回收率为98(62%,104(80%，日内RSD?8(02,，日间RSD?11(70%;9-顺式维甲酸方法回收率为97(74%,102(24%，日内RSD?7(72,，日间RSD?9(17%。结论 本方法简单、快速、灵敏、重现性好，适用于全反式维甲酸、13-顺式维甲酸和9-顺式维甲酸临床血药浓度监测及人体药代动力学研究。 【关键词】全反式维甲酸;13-顺式维甲酸;9-顺式维甲酸;血药浓度;高效液相色谱法 Determination of all-trans,13-cis-and 9-cis-retinoic acid in human plasma by HPLC 1 TANG Lei,HU Jun-yong,CUI Ying-peng,et al.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510080,China 【Abstract】 Objective To establish a HPLC method for determination of all-trans,13-cis-and 9-cis-retinoic acid in human plasma.Methods A Kromasil C18 column (4(6 mm×250 mm，5 μm) was adopted.The mobile phase of gradient elution was composed of 0(01 mol/L sodium acetate buffer (pH=5(7) and methanol.The flow rate was 1 ml/min.The UV detector was operated at 340 nm.Results The assay procedure was shown to produce linear calibration curves over the range of 1-200 ng/ml of retinoic acid in plasma.The detect limitation were 0(5 ng/ml.The recovery of all-trans,13-cis-and 9-cis-retinoic acid were 97(22%-108(80%,98(62%-104(80% and 97(74%-102(24%,respectively.The RSD within day and betten days were less than 8(24, and 11(34% for all-trans retinoic acid,less than 8(02, and 11(70% for 13-cis-retinoic acid and less than 7(72, and 9(17% for 9-cis-retinoic acid.Conclusion This method is 2 found to be reproducible,convenient and sensitive for plasma concentration monitoring and clinical pharmacokinetics study of retinoic acid. 【Key words】 All-trans retinoic acid;13-cis-retinoic acid;9-cis-retinoic acid;Plasma concentration;HPLC 维甲酸是维生素A 的天然氧化代谢产物，有多种立体异 构体，包括全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)、 13-顺式维甲酸(13-cis-retinoic acid,13-CRA)和9-顺式 维甲酸(9-cis-retinoic acid,9-CRA)。其通过维甲酸受体 系统而发挥生物学效应，能抑制多种肿瘤细胞增殖，对肿瘤 细胞具有诱导分化作用，以及促进细胞凋亡[1]。维甲酸体 内代谢异常，可能导致正常细胞分化异常和肿瘤的发生。维 甲酸类药物已用于临床，尤其是全反式维甲酸已成为目前治 疗急性早幼粒细胞性白血病的最有效药物之一[2]。通过对 维甲酸的药动学研究及体内浓度监测，可提高维甲酸类药物 抗肿瘤疗效，有助于开发新的维甲酸类药物抗肿瘤治疗方 案。本文参考文献[3-5]，建立了一种灵敏、准确的维甲酸 血药浓度HPLC测定法，旨在为维甲酸临床血药浓度监测及 人体药代动力学研究提供测定方法。 1 材料与方法 1(1 仪器 Waters高效液相色谱仪(600型低压梯度泵， 3 717型自动进样器，486型紫外检测器，Millennium32色谱工作站);XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂);3K18高速冷冻离心机(Sigma);高速离心机(美国雅培公司TDx仪附件)。 1(2 药品与试剂 ATRA、13-CRA、9-CRA对照品(Sigma,纯度:98,)，阿维A酸(内标，罗氏公司)。甲醇为色谱纯试剂，其余试剂均为分析纯。 1(3 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18柱(4(6 mm×250 mm，5 μm);柱温为室温。流动相A:甲醇;流动相B:0(01 mol/L 醋酸钠缓冲液(pH=5(7)，梯度洗脱见1。检测波长340 nm。 1(4 血药浓度测定法 1(4(1 ATRA、13-CRA与9-CRA混合溶液配制 分别精密称取ATRA、13-CRA与9-CRA对照品适量，置于10 ml容量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得浓度为100 μg/ml的ATRA、13-CRA与9-CRA储备液。精密吸取ATRA、13-CRA与9-CRA储备液适量，置于同一10 ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，制得ATRA、13-CRA与9-CRA浓度分别为0(05、0(25、0(5、1、2(5、5、10 μg/ml的混合标准溶液。 1(4(2 内标液配制 取内标阿维A酸适量，置于10 ml量瓶中，以甲醇溶解并定容，即为100 μg/ml的储备液。精密吸取阿维A酸储备液适量，置于10 ml容量瓶中，甲醇 4 稀释至刻度，制得10 μg/ml内标溶液。 1(4(3 样本处理 精密吸取血浆样品1 ml，置10 ml具塞离心试管中，加入内标溶液25 μl，旋涡混合30 s。加入无水乙醇1 ml，漩涡混合30 s，再依次加入2 mol/L醋酸溶液100 μl、水500 μl，漩涡混合10 s。加入正己烷3 ml，旋涡混合1 min，4 500 r/min离心5 min。转移上层液至尖底试管中，氮气流吹干。残渣加入甲醇100 μl 旋涡混合30 s使溶解，10 000 r/min离心5 min，取上清液20 μl进样，记录色谱图，以ATRA、13-CRA、9-CRA峰面积(As)与内标峰面积(Ai)之比Y代入标准曲线计算ATRA、13-CRA与9-CRA血药浓度。 1(4(4 标准曲线 精密量取空白血浆1 ml，置10 ml具塞离心管中，分别加入不同浓度混合标准溶液20 μl，混匀，使ATRA、13-CRA与9-CRA血药浓度相当于1、5、10、20、50、100、200 ng/ml。按样本处理方法操作，分别以ATRA、13-CRA与9-CRA浓度(C)为横坐标，不同浓度ATRA、13-CRA、9-CRA与内标的峰面积比减去空白血浆中ATRA、13-CRA、9-CRA与内标峰面积比所得差值Y为纵坐标进行线性回归。 1(4(5 回收率及精密度 取健康人空白血浆1 ml，加入混合标准溶液20μL，使ATRA、13-CRA与9-CRA血药浓度分别相当于2(5、25、150 ng/ml。按样本处理方法操作，以 5 不同浓度ATRA、13-CRA、9-CRA与内标峰面积比减去空白血浆中ATRA、13-CRA、9-CRA与内标峰面积比所得差值Y代入标准曲线计算ATRA、13-CRA与9-CRA血药浓度，以测得浓度与配制浓度之比计算方法回收率。以1 d内测得的ATRA、13-CRA与9-CRA浓度计算日内精密度，以1周内5次测定的浓度计算日间精密度。 2 结果 2(1 色谱行为 在上述色谱条件下，ATRA、13-CRA、9-CRA与内标物及血浆其他内源性物质能够较好分离，ATRA、13-CRA、9-CRA与内标的保留时间分别为8(8、7(2、8(2、6(3 min。色谱图见图1。 2(2 线性范围 在1,200 ng/ml浓度范围内，3种维甲酸异构体血药浓度C与峰面积比Y有良好线性关系，其回归方程分别为:Y(ATRA)=0(059 4C+0(009 2，r=0(999 7;Y(13-CRA)=0(058 1C+0(006 7，r=0(999 4;Y(9-CRA)=0(056 8C+0(004 5，r=0(999 7。以信噪比S/N=3?1计，ATRA、13-CRA、9-CRA最低检测浓度为0(5 ng/ml。 2(3 回收率及精密度 ATRA、13-CRA、9-CRA方法回收率分别为97(22%,108(80%、98(62%,104(80%、97(74%,102(24%。ATRA 日内RSD?8(24,，日间RSD?11(34%;13-CRA 日内RSD?8(02,，日间RSD?11(70%;9-CRA 日内RSD?7(72,，日间RSD?9(17%。结果见表2。 6 3 讨论 维甲酸化学性质活泼，见光易异构化或氧化降解，因此在样品提取过程中应特别注意避光操作。维甲酸脂溶性强，与血浆蛋白结合紧密，提取过程中首先加入乙醇去蛋白，使结合型的维甲酸游离，随后加入醋酸溶液，使血浆酸化，可提高萃取回收率。考察了乙醇用量(0(5、1、1(5 ml)，2 mol/L 醋酸溶液用量(25、50、100 μl)对维甲酸提取率的影响，以加入乙醇1 ml及2 mol/L 醋酸溶液100 μl时，维甲酸提取率最高，正己烷一步萃取可使萃取回收率达到80,以上。 ATRA、13-CRA与9-CRA是3种内源性物质，其结构相近，采用等度洗脱难以将3者完全分离。分别考察了pH值为3(0、3(5、4(0、4(5、5(0、5(5和5(7的0(01 mol/L 醋酸钠缓冲液对ATRA、13-CRA与9-CRA分离的影响，结果显示pH值5(7时三者分离度最好。在此基础上，采用梯度洗脱使3种维甲酸异构体获得完全分离。 测定多份健康人血浆，其色谱图仅见ATRA及13-CRA，未检出9-CRA，可能与9-CRA血中含量极微，血药浓度低于0(5 ng/ml有关。因此本方法血中内源性9-CRA无干扰，9-CRA低浓度回收率及精密度结果均优于ATRA及13-CRA。 参考文献 1 GAO F,SONG JD.Colorectal carcinoma cell apoptosis 7 induced by all-trans retinoic acid.Chin J Cell Biol(细 胞生物学杂志),2000,22(1):35-39. 2 TR Evans,SB Kaye.Reinoids:present role and future potential.Br J Cancer,1999,80(1-2):1-8. 3 YU ZC,YAO S,YU RH.Simultaneous determination of all-trans-and 13-cis-retinoic acid in human serum by HPLC.Chin J Pharm Anal(药物分析杂 志),2000,20(4):226-228. 4 M.Michiko,Y Hirokazu,SHaruko,et al.Simultaneous quantification of retinol,retinal,and retinoic acid isomers by high-performance liquid chromatography with a simple gradiation.JChromatogr B,2001,757:365-368. 5 KS Carsten,B Abraham,NHeinz.Chromatographic analysis of endogenous retinoids in tissues and serum.Anal Biochem,2003,315:36-48. 8