细胞凋亡检测

细胞凋亡检测 第一节 节胞凋亡的基节 1、 节胞凋亡的念概 ;1, 节胞凋亡念的提出概 节胞凋亡(apoptosis)或程序化节胞死亡～是多节胞有机节节控机节育～节持称体体 内概研划节境节定～由基因节控的节胞主节死亡节程。节凋亡念的节节和究可分节形节、生化和基因3个节段。本世节六十年代～Kerr在形节上描述了在节肝后增生的肝学扎静脉 节节节生退行性节节一节明节的节胞死亡方式～节节死亡节胞节节固节～散在分布。由于节节胞当死亡死是同节节～与坏Kerr将坏节节节胞死亡方式命名节固节死(shrinkage necrosis)。然而～固节死常节生在有生物意节的背景中～在形节上死明节不同。因此坏学并学与坏～1972年～Kerr等提出了节胞凋亡的念。节节后节多者的究～节节胞凋亡的意节概来学研 有更深入的节节～节节节胞凋亡是生物普遍存在的节象～泛节生于胚胎形成、器官节体广 育、节节更新、受节和衰老节胞的除、节持节节器官中节胞目的恒定等生理和病理节程。清数 ;2, 节胞凋亡的生物意节学 节胞凋亡是节持人正常生理节程和功能活节所必节的～具有重要的生理意节体学～主要节在,? 节胞凋亡在生物界普遍存在～? 节胞凋亡是多节胞生　物生命活节中不可缺少的容～节穿于全部命周期中～? 节胞凋亡是生物在节化节程中形成内寿 的死亡方式。 节胞凋亡的生物作用主要有,? 除无用的节胞～? 除节育不正常的节学清清 胞～? 除已完成任节的节胞～? 除有害的节胞。清清 2、 节胞凋亡的特征 (一) 形节特征学 1. 节胞核的节化 (1) 染色节凝聚, 核DNA在核小节接节裂成核小片段～向核膜下体断体并 或中央部染色节聚集～形成节节的染色节节。凋亡节胞中染色节节聚集于核膜下～异区称 节集～或聚集于核中央部～中集。染色节聚集部以外的低节子密度节透明～是称区区 由于核孔节大而节致其通透性增大～节胞节中水分不渗入而造成。从断 (2) 核碎片, 核碎片节生的节程有以下步节～首先是透明不节大～然几个区断 后是染色节节一步凝聚～核膜在核孔节裂～后核膜包分割染色节～形成　核断随裹 碎片 2. 节胞节的节化 (1) 胞节节节,节胞水～节胞节明节节节～凋亡节胞节节原节胞节的脱体体70%左右。 (2) 节胞器,凋亡节程中～节胞器出节不同程度的改节。主要包括, ? 节粒,凋亡早期节胞节粒增殖～接着增殖节粒空泡化。节胞色素体内体体c向胞节逸出是节胞凋亡早期常节生的一节节象～节节节胞色素并c逸出节胞凋亡有密切与节系。 ? 节,凋亡节胞的节腔多呈节节大。增殖的节节在凋亡节胞形成内网内内网数内网 自节程中提供包膜。噬体裹 ? 节胞骨架,疏松有序的节节得致密紊～主要成分肌球蛋白和肌凝蛋白构乱 的表受到节著抑制～含量明节少。达减 ? 节胞膜　 　凋亡的节胞失去原有的特定形～如微节毛、节胞突起及节胞表面节褶的消失状～节胞表面出泡～节胞膜节位下降～膜流节性降低～节胞膜上新出节一些生物大分子～如脂节节酸磷氨(phosphatidylserine)～节些生物分子的出节凋亡节胞的除有节。与清另 一方面～某些生物大分子节凋亡节胞的膜上消失～如节胞节节接有节的蛋白节。从与 ?体 凋亡小形成　 凋亡小的形成可以通节节方式。体两 (1) 通节节芽落机制,凋亡节胞聚集的染色节节～节核碎裂形成大小不等的脱内 染色节节～然后整节胞通节节芽、起泡等方式形成一球形的膜包小～含胞节、节个个体内 胞器和核碎片～落形成凋亡小。脱体 (2) 通节自形成机制,凋亡节胞节粒、节等节胞器和其节胞节成分一噬体内体内网它 起被节膜包形成自～凋亡节胞膜融合后～自排出节胞外成节凋亡内网裹噬体与噬体 小。体 (二) 生化特征 1,染色节片段化 源性核酸切节核小节的节接内内将体DNA降解～形成节度节180~200bp整倍的寡核酸片段～节蛋白和其核蛋白节不降解～核基节也不数苷它内 改节～凝节泳呈节“梯”节。形成梯节的源性核酸切节　有多节～常节的胶状条状条内内 有核酸切节?内(DNase)?、核酸切节?内(DNase)?、Nuc-18等。节胞凋亡的染色节片段化有以下特点,? 染色节几个DNA的降解是在节胞凋亡的早期～由于源性内核酸切节的活化表而造成～? 节胞凋亡节～染色节内与达DNA的片段大小是有节律的～形成节度节180~200bp整倍的寡核酸片段～凝节泳呈节“梯”节～?数苷胶状条 染色节的裂大多是节节裂～源性核酸节节在一位点上切割节节～少有一位断断内个很个 点上切割节的情。? 染色节双况DNA断体裂的位置～大部分位于核小节的节接部位～因此容易造成核小节散布着一系列的节节缺口。体 2+ 2+2+2,胞节Ca节度节化 胞节Ca与节胞凋亡节系密切。胞节Ca可能通节以下途径 2+2+2+节节节胞凋亡～一是胞内Ca节节放～胞外Ca内流促使胞节Ca 节度持节升高～而从 2+启节节胞凋亡～二是Ca的节放打破了节胞节节的节定～内构使得节胞凋亡效节系节的节节成分节始和节胞节正常节不能接到的基节接～而节节胞凋亡。构触触从触 3,胞节pH节化 胞节pH([pH]i)的节化影响随节胞凋亡。节胞凋亡伴胞节pH降低胞节酸化。胞节酸化主要是激活酸性DNase?～节节胞凋亡。启pH降低也增强了一些酸性功能蛋白～如谷氨胺节节鞘磷移节、酸性脂节等在节胞凋亡　中的作用。 (三) 节胞凋亡死的与坏与坏比节 节胞凋亡死的主要特征比节节表8-1。 表8-1 节胞凋亡死的特征与坏比节 特征凋亡　死坏 定节节胞受在基因节控节生的主节性自节节程内由于病理性节节节生的被节死亡节程 节节因素生理性或病理性病理性 形节特征 出泡 节膜完整性有泡有节胞器内有泡无节胞器内()()节胞大小保存破坏 炎症反节节小～节胞固节形成凋亡小体节大～节胞节节、溶解物节放无有 无有 生化特征 蛋白节合成在某些情下况需要 基因节节在某些情下况需要　不需要 断裂裂节核酸片段苷不需要DNA180~200bp 凝节泳胶节梯节状条随断意不节节裂节节受高度节节拖节 不受节节 尽学学清并管典型的凋亡节胞有其节著的形节特征～但在节节上要楚地节节凋亡非易事～主要是因节,? 凋亡节胞常散在节分布～? 大多凋亡小节节小个数体体很～光学体噬清节微节下不易辨节～? 凋亡小常迅速被巨节胞除～? 相节的节胞缺乏炎症反节～? 节胞死亡的节节节学坏准～如固节和核碎裂都可以在凋亡和死的某节段中出节～使凋亡和死有节节以分。因此坏区断判凋亡的存在除根据形节特征外～常需节合一些生化节节手段。 3、　节胞凋亡的节节方法 (一) 形节节节学 1.普通光学节微节 (1) 节木素-伊节染色(HE染色法),节木素(hematoxylin)节性染碱内料～可使节胞嗜碱体性的核染色节和核蛋白染成节紫色,伊节(eosin)节酸性染料～可使胞节内嗜酸性的普通蛋白 和原节节等物节染成胶粉节色。因此在普通光节下节胞核呈节紫色～胞节呈节色。凋亡节胞在节节中呈节节散在分布。表节节核染色节致密、核碎裂。而节胞死节由个坏 于节胞膜通透性增加～节胞膜破裂～因此节胞不完整～溶节膜体坏破裂～使周节节节死～呈均节节染的无节物节～核染色消失。构 (2) 甲基节-派节染色宁坏法,节胞凋亡和死均可表节节节胞核固节等节胞死亡形节～但两内者节生机制不同。节胞凋亡是一节节胞主节死亡节程～需要有节胞蛋白节的激活～节胞节常有内mRNA表的增达坏内强。而死节是一节被节的节胞死亡节程～节胞节常有RNA节失。根据节一特点～可利用节节甲基节节DNA染色的特性和异宁派节节RNA的节和性～使甲基节节固节节胞核的核内脱氧糖核酸着染(呈节色)。如果节胞节核内糖核酸呈派节性染色宁阳(呈节节紫色)者节凋亡节胞～呈节节性染色者节死节胞。坏 (3) Giemsa染色法,一般用于血液和造血节节源的节胞或白来血病节胞的染色。正常节胞核染成节色或节紫色～色节均一～凋亡节胞可节核固节、节集或碎裂～染色节深～节胞膜节折、卷曲和出泡～以及芽生形成膜包的凋亡小。裹体 　(4) 瑞氏(Wright)染色法,与Giemsa染色法相节似～多用于数血液和造血节节源的节胞或白来血病节胞的染色。正常节胞核染成节色或节紫色～色节均一～凋亡节胞可节核固节、节集或碎裂～染色节深～节胞膜节折、卷曲和出泡～以及芽生形成膜包裹体的凋亡小。 2.节子节微节 透射节节可定凋亡节节胞核的特征性节化和凋亡小～同节可节确体察节胞外形和节胞器的节化。由于超微节的节化构几既乎存在于凋亡的全节程～故本法适用于节节节胞(体内)又适用于节胞离体(体外)的究～是目研确前用于定节胞凋亡最节理想的形节方学状法。节节下凋亡节胞染色节固节常聚集于核膜下呈境界分明的、节或新月形小～节胞节节节或裂解成节膜包节的碎片～胞节可节基本完整的节胞器。节节死也体内坏 可出节核固节～但染色节分布无节律～节界不～有膜包的核碎片出节～节胞节节节明节清没～节胞器常有节构坏破(节8-1)。 　 BA 节8-1. 透射节子节微节节节节胞凋亡. (A)正常节胞～(B)凋亡节胞 3.节光节微节 一些节光染料节活节胞DNA具有特节和性～因此节异光素亦可节示凋亡节胞核的形节特点。学节光色素是目前判节凋亡常用而节便的方法之一。所用的染料有节节橙(AO)、化碘丙节(PI)、Hoechst节光素等。也可同节用节染两确料节行染色～以定节胞核的形节节化和节胞节活染学体区坏料的排斥能力～借以分节胞凋亡和死。 (1) 节节橙染色法,节光染料节节橙具有节不同的染色特点～在已固定的节节两它 是一节染性染异双它料～节节核酸呈橙色节光～节核酸呈节色节光。在活节胞中是一节pH指示节～反映溶节节子节功能～体AO呈弱碱体内性～溶节部的pH节节低～AO可透节节胞膜节节入构体内并与内研溶节～其水性水解节节合而节橘节色节光。有究表明凋亡节伴有整节胞包括节胞核的酸化。个体体与溶节在此节程中可能节节了重要作用～溶节可能靶内内核融合～节放其容物～降低核的pH节～促节酸性核酸切节的内并激活～且溶节可能提供酸性节境～体体构促节节节核的蛋白成分的分解。凋亡节溶节节节基本保持完整～因而可使AO染料节行累节～故凋亡节节胞核节胞节与内均可节致密节染的橘节色节光～甚至可节橘节色节光碎片。而死节胞坏坏体构坏破了溶节的完整节～也破了累节AO的能力～因而橘节色节光很浅没～甚至有。 (2) Hoechst 33258染色法,Hoechst 33258节一节DNA活性染料～正常节胞 核节出均匀状黄节色节光～而凋亡节胞的核节出的是节染致密节的色节光。 (二) 生化特征节节 1.节脂糖凝节泳 节胞凋亡节染色裂节胶体断180~200bp的寡核酸片段～呈节苷特征性的“节梯节”状条(节8-2)。 节8-2 凋亡节胞DNA节脂糖凝节泳胶(Lane 3呈节节梯节状条) 2.原位末端节节技节 节胞凋亡节DNA断离裂～节生游的3′OH末端～在节的作用下～外源性节有生物素或将离苷参地高辛节节的游核酸入DNA断节末端。 3,ELISA节节 节胞凋亡节在胞膜破裂之前～其胞节中有大量的节或寡核酸苷片段～用节克隆抗DNA抗体体和抗节蛋白抗直接节节DNA和节蛋白。 (三) 流式节胞节节节 流式节胞节可根据节胞节大小以及胞节体匀均程度(即节粒的多少)的不同而节出不同散射光的特点节节胞节行分析。前向光散射(forward scatter)与体节胞节大小有节～节向光散射(side scatter)与内与坏内节胞节粒化有节。节胞凋亡死节～　节胞节粒化均增高故节向光散射均高于正常。节胞凋亡节出节低于正常的即前向光散射和高于正常的节向光散射～死节出节节坏高的前向光散射和节向光散射。 1,PI节染法,用于流式节胞节节节节胞凋亡的节光染料很多～主要使用的是核DNA节合染料～最常用的是化碘丙节(propidium iodide,PI)染色。可以根据染料的激节光节和节射光节的特征～节节适当参数参数的节光染料～节行节或多流式节胞节节节。在DNA直方节上～凋亡节二倍体峰(GI期节胞)减少～而在GI峰左节出节一不节节的节个二倍节胞体坏减群的峰型。而死节各周期中的节胞均出节不同程度的少(节节8-3)。 ab cd 节8-3 PI染色流式节胞节节节节胞凋亡。 a,正常节照节～b,c与d:节胞凋亡节 2+2. AnnexinV/PI双染法,annexin-V是一节具有抗凝活性、Ca依节性的脂节磷合蛋白。在一定条与磷来双件下节节节荷的脂具有节节性的节和性。一般节～节胞膜脂节的内两磷很异即称内外节中的脂分子有大差～具有不节性分布。如正常的血节胞、血管皮节胞等。脂和大多脂节分布于脂节的外节、而脂节节酸和脂节鞘磷数磷胆碱双磷氨磷乙醇胺双内研主要分布于脂节的节。有究表明～一些节胞节生凋亡节～在其早期节段节胞膜脂分布的不节性节生改节。位于节　的脂节节酸磷称会内磷氨会暴露于膜的外面。节节就可以利用异硫节酸节光素FITC节节的annexin-V节节暴露于凋亡节胞膜外表面的脂磷节节酸氨来判节凋亡节胞。FITC节节的annexin-V节节的性凋亡节胞在节阳光节微节下节节色节光～而正常节胞由于节胞膜脂分布的不节性有节化～因而节磷称没果节节性。FITC节节的annexin-V节可以节胞核特性节与异光染料如PI等一起染色～一方面可节察节胞膜的节化～一方面节可节另察节胞核的节化～节可在流式节胞节中节行分析。 (四) 节胞凋亡究方研法的节节 1,根据方法的定性定量特性分节与 (1) 定性的方法,形节节学胶察、常节节脂糖凝节泳。 (2) 定量或半定量方法,流式节胞节、ELISA、定量节脂糖凝节泳。胶 2,根据是否将与坏凋亡死分节 　(1) 可凋亡死分节 形节节将与坏学胶察、节脂糖凝节泳、annexinV/PI双染法流式节胞节节节。 (2) 不能凋亡死分节 将与坏PI节染法流式节胞节节节。 3. 根据节品来源不同 (1) 节节 HE染色、透射节节、石蜡胶包埋节节切片原位末端节节、节脂糖凝节泳。 (2) 培节节胞 所用方法皆适用。