单增李斯特菌比对试验结果与分析_cropped

单增李斯特菌比对试验结果与分析_cropped 单增李斯特菌购自广州环凯公司 英诺克李斯单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌;( Listeria 以下简称单增李斯特菌是一种菌绵羊李斯特菌购自中国菌种保藏中心monocytogenes.L.M) () 、。人畜共患病的病原菌它广泛存在于自然界中猪, , 、 小白鼠2.1.5 牛羊禽类等动物都可感染发病人们食用的肉、、。、 购自南方医科大学实验动物中心体重 , 16~20g。 奶蛋水产品和蔬菜等容易受到该菌污染世界卫 、、。 实验方法2.2 生组织以上肉制品以上的禽 指出( WHO) : 30%, 15%可疑菌株的分离2.2.1 产品的奶及奶制品的水产品受到 , 5%~10%, 4%~8%该次比对试验没有明确规定检验采用的方 该菌不同程度的污染国外常有由单增李斯特菌引。 法 参 照 及 , SN 0184 - 93、GB/T 4789.30 - 2003 ISO/T 等标准相关方法进行检验步骤如下 11290.1- 1996 , : 起的群发性食物中毒 因此不少国家和地区将其与, 测试样品摇匀 静 置 各 取 +5mL BPW?30min ? 沙门氏菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌共列为主要的、、 接 种 肉 汤 和 增 菌 液 中 1mL 1/2 Fraser LB?30?食源性致病菌并作为食品卫生微生物检验中的常 , 1 规检验项目目前该菌被国家质检总局列为进出口 。 24h??35?24h 食品的必检菌或监控病原菌为了提高各检验检疫。 和 平板可疑菌落接 接种 1) Oxford PALCAM ? 种 鉴定TSA- YE?。 实验室对该菌的检验鉴定水平 确保检验结果的准, 接种 肉汤和 增菌液 2) Fraser LB?mini VIDAS2 年 月广东出入 境检验检疫 局组织了确性2005 10 , 快速初筛。单增李斯特菌比对试验我们共检验测试样品 份。4 , 在 平板上挑取 个可疑典型菌落接TSA- YE 3~5 检出 份阳性份阴性取得满意的比对结果现报 2 、2 , , 告如下。 种 和动力半固体同时每一接种的菌落进行镜TSI , 材料与方法 检及过氧化氢酶试验镜检为革兰氏阳性短杆菌并。2 见轻微旋转及翻滚过氧化氢酶阳性斜面和底, , TSI 材料和设备2.1 比对试验样品 层产酸不产 初筛阳性半固体培养2.1.1 , ,HSmini VIDAS 2 由广州出入境检验检疫局食品实验室提供编 基上形成伞状或月芽状生长的可疑菌株再进一步鉴, 号为定: T107、T078、T018、T047。 。 培养基和试剂生化试验2.1.2 2.2.2 增 菌 液 肉 汤 肉 汤 培养物接种生化微量管及用 用 、, 、、TSI VITEK 32 LBLBFraser 1/2Fraser 12 进行生化鉴定同时用单增李斯特菌英诺克李斯特, 、 琼脂琼脂琼脂动力半固体 、、、、Oxford PALCAM TSI 微量生化试验管等同时使用北京 TSA- YE、TSB- YE、菌绵羊李斯特菌的标准菌株作试验对照见 、, 1。 陆桥和广州环凯两家公司产品部分微量生化试验 ; 试验结果符合单增李斯特菌生化特性的可疑菌株再管购自杭州天和血琼脂平板购自郑州博塞广州环 ; 、作溶血试验各个可疑菌株经 检测结果均 。VITEK 32 凯及江门凯林三家公司单增李斯特菌初筛试剂条 ; 判定为 李斯特菌相关生化项目均与表 结果 99%, 1 和 生化鉴定卡均来自法国梅里埃公司GPI 。 一致。 主要仪器溶血试验2.1.3 2.2.3 生化培养箱全自动高压灭菌器显微镜全自的纯培养物刺种血平板并同时用单增李用 、、、TSI , 动荧光免疫分析仪 全自动微生物鉴定mini VIDAS、 斯特菌英诺克李斯特菌绵羊李斯特菌的标准菌株、、 比对试验样品及标准菌株的生化试验结果表 1 试样编号尿素酶硝酸盐还原木糖鼠李糖甘露醇七叶苷葡萄糖麦芽糖MR/VP T018 - - - + +/+ - + + + T047 - - - + +/+ - + + + T107 - - - + +/+ - + + + T078 - - - + +/+ - + + + 单增李斯特菌 - - - + +/+ - + + + 英诺克李斯特菌- - - + +/+ - + + + 绵羊李斯特菌- - + - +/+ - + + + 表 比对试验样品及标准菌株的溶血试验结果2 验标准中 生化试验结果单增李斯特菌和英诺克李, 斯特菌是一致的其余 个菌种与单增李斯特菌的, 5 试样编号结果观察 生化试验结果能相互区别由表 可见 个测试样 。1 4 型溶血环 刺种点周围产生窄小的 βT018 与单增李斯特菌和英诺克李斯特菌标准菌株的生化 不溶血 T047 试验结果都一致我们曾经参考有关资料把生化试。, 刺种点周围产生窄小的 型溶血环 T107 β 验项目扩大至二十多项 单增李斯特菌和英诺克李,不溶血 T078 斯特菌的生化试验结果也无明显差异而在检验过。 单增李斯特菌刺种点周围产生窄小的 型溶血环 β 程中从挑取典型可疑菌落到生化试验 单增李斯特,不溶血 英诺克李斯特菌 菌和英诺克 李斯特菌 的 各 种 试 验 结 果 都 无 明 显 差 绵羊李斯特菌刺种点周围产生大的 型溶血环 β异因此在单增李斯特菌检验中关键是靠 溶血试 。, β 验小白鼠毒力试验来进一步鉴定单增李斯特菌和、 比对试验样品及标准菌株的小白鼠毒力试验结果表 3 和从 英诺克李斯特菌我们在日常检验中 Oxford 。, 试样编号致病只数 死亡只数 未致病只数 存活只数 平板上挑取的可疑典型菌落经最后鉴定 PALCAM , T018 5 4 0 1 为英诺克李斯特菌的多于单增李斯特菌。T047 0 0 5 5 生化试验时还应注意试剂质量不稳定等因素影 T107 5 3 0 2 响试验结果的准确性 有时同一厂家生产的不同批,T078 0 0 5 5 次产品也存在质量差异导致试验结果不准确最好 , 。单增李斯特菌 5 3 0 2 能同时使用二个不同厂家的生化微量管对同一个 , 英诺克李斯特菌0 0 5 5 可疑菌株进行生化鉴定必要时还应重复试验还应 , 。 注意初筛试 剂条生 化 鉴 定 卡 偶 尔 会 发 生 质 量 问 、 绵羊李斯特菌5 4 0 1 题。 空白对照0 0 5 5 小白鼠毒力试验溶血试验2.2.4 4.2 10 刮取 纯培养物在 中制成约 个溶 血 试 验 在 单 增 李 斯 特 菌 的 鉴 定 上 甚 为 重 TSI TSB- YE 10/ β 的菌悬液腹腔注射小白鼠每只约 每个 mL , , 0.2mL, 要是与英诺克李斯特菌相区分的关键在刺种血平 , 。 菌株注射小白鼠 只用单增李斯特菌英诺克李斯5 。、 板时应穿刺至培养基的中层切不可刺穿到底也 , , , 不能穿刺得太浅否则对接种菌株溶血效果的观察 , 特菌和绵羊李斯特菌的标准菌株作试验对照 同时,会产生很大影响溶血是窄小溶血环结果的判定 。β, 用 作空白对照连续观察 天结果见表 TSB- YE , 7 。3。 需要较丰富的经验溶血试验最好同时用单增李斯 。 结果特菌英诺克李斯特菌绵羊李斯特菌的标准菌株作 3 、、根 据 上 述 检 验 结 果 比 对 试 验 样 品 和 , T018 对照并与可疑菌株接种于同一平板上这很有助于 , , 判定为单增李斯特菌阳性比对试验样品 T107 , T047 鉴别不同类型的溶血应注意血平板质量对溶血试。 和 判定为单增李斯特菌阴性T078 。 分析和讨论验结果有很大的影响 我们同时使用了多家公司生4 , 产的血平板作溶血试验比较郑州博赛公司生产的生化试验?, 4.1 血平板试验效果最为理想各种类型的溶血均容易, 李斯特菌的 个菌种在现行 及 检7 , SN、GB ISO 摘 要目的建立水产品中孔雀石绿结晶紫及其代谢产物隐性孔雀石绿隐性结晶紫的高效液相色谱分析[] 、、 方法方法样品以乙酸钠乙腈为提取剂经二氯甲烷反提取再经 柱净化氰基柱分离和柱后衍生化等度洗。[] - , 、SPE 、、 脱测定外标法定量结果各标准曲线相关系数均浓度水平加标回收率为、HPLC- DAD 、。[] ?0.999, 2μg/kg、4μg/kg 为 结论本法简便快速具有良好的重现性和准确性检测低限均为 70.0%,87.7%, RSD 4.9%,8.1%, 2μg/kg。[] 、, 。 关键词 液相色谱水产品孔雀石绿结晶紫;SPE;;; DETERMINATION OF MALACHITE GREEN, GENTIAN VIOLET AND THEIR METABOLITES IN AQUATIC PRODUCTS BY SPE- HPLC ZHANG Lintian, CHEN Xiaoxue, LIANG Xiyang, LUO Huiming, SU Jianhui, ZHANG Shengju (Shantou Entry- Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shantou, Guangdong, 515031) Abstr act: A new SPE - HPLC method for the determination of the malachite green,gentian violet and their metabolites leucomalachite green, leucogentian violetin in aquatic products. Residues in sample were extracted with an acetonitrile- sodium acetate buffer mixture, further purified with methylene chloride and was cleaned up on SPE column. The compounds were separated on an LC cyano column and a PbOpost- column for derivation, equal- gradient eluted, then determined by HPLC- DAD, quantified by external 2 standard method. All the calibration curve ' s correlation coefficients were higher than 0.996with the average recoveries of 2μg/kg, 4μg/kg, spiked recoveries of 70.0%,87.7% , RSD of 4.9%,8.1% , the limit of detection of all compounds was less than 2μg/kg. The method is validated with respect to its simplicity, sensitivity with good repeatability and reproducibility. Key wor ds: HPLC, SPE, aquatic products, malachite green, gentian violet """"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""" 清楚分辨有的厂家生产的血平板溶血试验结果难 诺克李斯特菌和空白对照试验的小白鼠都不发病, 。 以分辨不同类型的溶血不适宜作 溶血试验另外各试验组要有隔离设施防止交叉污染造成的小白 , β。, 天每 鼠感染影响结果的准确性试验应连续观察 7 , 。 溶血试验用的血平板一定要新鲜厚薄适中血平β、, 天至少观察 次并把每次观察结果详细鉴定 4 , 。 板太薄易造成溶血试验假阳性 血平板太厚易造成,菌株与对照标准菌株试验结果是否一致是判定的主 溶血试验假阴性由于协同溶血试验技术难度较大 。,要依据之一因此准确的小白鼠毒力试验结果对鉴 , , 可不作协同溶我们认为能熟练准确做好溶血试验 ,别单增李斯特菌和英诺克李斯特菌甚为重要。 血试验。 小白鼠毒力试验4.3 参考文献毒力试验用清洁级体重 的健康小白鼠16~20g 即可注射菌液时操作要熟练防止对小白鼠的损伤, , 李小春等速冻食品中李斯特菌检测方法探讨与结果分[1] , . 接种后短时间内死亡的小白鼠不能作为试验结果。 析中国卫生检验杂志., 2004, 14( 1) : 88~89 唐珊熙等微生物学及微生物学检验北京人民卫生出 [2] , ..: 单增李斯特菌和绵羊李斯特菌接种小白鼠后 多数,版社年第一版.2000 , .244~245 小白鼠 后出现明显发病症状并于 之24h , 48h~96h