亚历山大藻对海湾扇贝受精卵孵化的影响及致毒机制研究

亚历山大藻对海湾扇贝受精卵孵化的影响及致毒机制研究 生态学报 第 29 卷第 4 期Vo .l 29, No. 4 2009年 4月 Ap r. , 2009 ACTA ECOLO G ICA S IN ICA 亚历山大藻属微卫星标记的筛选 1 , 3 1 , 2 1 , 2 , 3 王东东 ,杨维东 ,刘洁生 ( 1. 暨南大学生物学系 ,广州 510632; 2. 水体富营养化与赤潮防治广东省高等学校重点实验室 ,广州510632; )3. 广东省微生物研究所 ,广州 510070 ( )摘要 :采用生物信息学 ,从塔玛亚历山大藻的 ESTs数据库中筛选微卫星 Simp le Sequence R ep ea t, SSR 位点 , SSR 引 () ()物 ,利用毛细管电泳对 4株塔玛亚历山大藻 A lexand rium tam a rense、2 株相关亚历山大藻 A lexand rium aff ine和 1 株链状亚历 ()( ) 山大藻 A lexand rium ca tenella 进行种内 、种间遗传多样性 ,获得以下主要结果 : 1 从 6830 条非冗余的 ESTs中共查找到 222个 SSR ,平均每 18. 5 kb就有一个 SSR ,三核苷酸重复在所有的重复类型中所占比例最大 ,达到 48. 2% ,重复单元 CTG /CA G ( )出现频率最高 。进一步筛选出 12条 SSR 引物 ,用于遗传多样性分析 。 2 种内遗传多样性水平整体偏低 ,多态性引物比率仅 为 41167% , N e i’s基因多样性平均为 0. 2130。种间遗传多样性水平较高 ,多态性引物比率为 75% , N e i’s基因多样性平均水平 ( ) 为 014643;另外 ,种间遗传分化系数较高 ,平均水平为 0. 7051。 3对 7个样品的聚类图分析发现 , A. tam a rense CCM P116 与 A.aff ine CCM P112遗传距离极为接近 ; A. tam a rense A TH K9301、CCM P1598 和 A TDH01 相互聚在一起 ; A. ca tenella ACDH01 与 A. tam a rense分属两枝 。以上结果表明 , SSR 标记在亚历山大藻种内遗传多样性分析方面是一种非常有用的工具 。 关键词 :亚历山大藻 ;表达序列标签 ;微卫星标记 ;遗传多样性 ( ) 文章编号 : 1000 20933 2009 04 22124 210 中图分类号 : X55 文献标识码 : A Screen in g of m icro sa te ll ite m a rker s in A lexa n d r ium spp. 1 , 3 1 , 2 1 , 2 , 3WAN G Dong2Dong, YAN G W e i2Dong, L IU J ie2Sheng 1 D epa rtm en t of B iotechnology, J inan U n iversity, Guangzhou 510632, Ch ina 2 Guangdong P rovinces H igh Educa tion Key L ab of Eu troph ica tion and R ed T ide Con trol, Guangzhou 510632, C h ina 3 Guangdong Institu te of M icrobiology; Guangzhou 510070, Ch ina ( ) A c ta E co log ica S in ica, 2009, 29 4 : 2124 ,2133. A b stra ct: To p rovide mo re info rm ation on the mo lecu lar iden tification m ethod s fo r the genu s A lexanderium , som e SSR we re sc reened from ESTs databa se abou t A lexand rium tam a rense by m ean s of b io info rm a tic s. The genetic d iversity wa s analyzed among 4 stra in s of A. tam a rense, 2 strain s of A. aff ine and 1 strain of A. ca tenella by cap illa ry elec trop ho resis. To ta lly 222 SSR we re d iscove red, one SSR p e r 18. 5 kb in ave rage. The trinucleo tide rep ea ts accoun ting fo r 48. 2 % , we re dom inan t among the rep ea t mo tifs, of wh ich CTG /CA G was the mo st typ e. Twelve of p rim e rs we re fu rthe r screened fo r the ana lysis of gene tic d ive rsity. Low level of gene tic d iversity was ob served in in trasp ecie s of A lexand rium spp. , w ith the ra tio of po lymo rp h ic p rim e rs of 41. 67 % and N e iπs gene d iversity of 0. 2130 in average. In con tra st, h igher gene tic d ive rsity was ob se rved in in te rsp ec ie s of A lexand rium spp. w ith ra tio of po lymo rp h ic p rim ers of 75 % and N e iπs gene d ive rsity of 0. 4643. The in tersp ec ie s gene tic coefficien t of d ifferen tiation was h ighe r w ith the average level of 0. 7051. A cco rd ing to the dend rogram of the se seven stra in s, A. tam a rense CCM P116 and A. aff ine CCM P112 greatly clo sed to each o ther. A. tam a rense A TH K9301 , CCM P1598 and A TDH01 clu ste red togethe r. A. ca tenella ACDH01 and A. tam a rense d istribu ted in the two b ranches. These resu lts sugge sted that the SSR m a rke r wa s a po ten tially u sefu l m ethod in the study of w ith in2sp ec ies gene tic variab ility of A lexanderium spp. ( ) ()基金项目 :广东省自然科学基金重点资助项目 8251063201000001 ; 国家自然科学基金 2广东省联合基金重点资助项目 U0733006 收稿日期 : 2007 210 224; 修订日期 : 2008 208 229 3 通讯作者 Co rrespond ing au tho r. E2m a il: tywd@ jnu. edu. cn Key W ord s: A lexanderium spp; EST; SSR; Genetic d iversity 亚历山大藻属是重要的赤潮藻 ,其属下的 20余种甲藻约一半是有毒种类 ,不仅破坏生态环境 ,而且危害 人类健康 。据报道 ,世界范围内每年由亚历山大藻产生的 PSP 毒素致死的人数多达几万人 。目前对亚历山 大藻进行鉴定 ,采用较多的仍是形态分类法 ,但由于形态分类法受环境变化和藻体不同生理阶段的影响 ,亚历 [ 1 ] 山大藻固定的形态分类学一直难以统一 。针对这种情况 ,人们急需有一个客观的标准用于亚历山大 藻属的分类鉴定和系统进化分析 。近年来 ,随着分子生物学的兴起 ,分子鉴定手段被越来越多的人所采用 ,人 们试图从分子水平上认识藻种的遗传特征 ,以便对其进行更准确的分类 。目前用于藻种鉴定的分子手段主要 [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ][ 5 ]有核糖体 rDNA 序列分析 、R FL P、RA PD等 。 Cho lin和 A dach i等 基于对 rDNA 序列的分析 ,研究了部 [ 5 ]分亚历山大藻的种系进化关系 。唐祥海等 分析了几株自南海及东海分离的亚历山大藻的 rDNA 部分序列 () 信息 ,包括核糖体大亚基 L SU rDNA 的 5 ′端 D1 2D 2区序列 、5. 8 S rDNA 和 ITS区序列等 ,并与来自其它国家 [ 6 ] 和地区的亚历山大藻进行了比较 ,分析了其分子系统进化关系 。王大志等 采用扫描电镜 、ITS区序列分析 及蛋白质组学的方法分析了 A. tam a rense和 A. ca tenella 之间的差异 ,认为两者应归为同种藻 。但 Kam ikawa[ 7 ]等 建立的一种 线 粒 体 DNA 分 子 标 记 却 能 够 有 效 区 分 A. tam a rense, A. ca tenella , A. tam iyavan ich ii, A. aff ine, A. h irano i和 A. pseudogonyau lax 等 6种亚历山大藻 。 ( () ) 微卫星 DNA M ic ro sa te llite DNA ,又称简单序列重复 simp le sequence rep ea t, SSR 或 SR S,是近年来发展 较快 、应用较广的一项分子遗传标记技术 。由于微卫星的多态性以及灵敏度大大超过了 rDNA 序列或 R FL P [ 8 ] 等以 DNA 为基础的分子标记 。因此 ,微卫星标记技术已引起赤潮界的高度关注 。 2000 年 , R ynea rson等 对 [ 9 ] 同一海域不同地点采集的 4 组硅藻样品进行了区域群体的微卫星分析 。 2004 年 , Evan 等 对尖刺拟菱形藻10 ] ( )Pseudon itzsch ia pungens进行了分析 。2007年 , D em u ra等 将微卫星标记应用于针胞藻纲 Cha ttonella an tique、 C. m a rina 和 C. ova ta 的研究 。本研究采用微卫星标记技术 ,对 3种 7株亚历山大藻进行遗传分析 ,以期为建 立一种新的亚历山大藻分子鉴定方法提供参考和依据 。 1 材料与方法 1. 1 藻种来源 () ( ) 塔玛亚历山大 藻 A lexand rium tam a renseCCM P1598、CCM P116 和相 关亚 历 山 大 藻 A lexand rium aff ine ( ) CCM P112由 CCM P P rova so li2Gu illa rd N a tiona l Cen te r fo r Cu ltu re of M a rine Phytop lank ton 提供 ,分别采自中国 大亚湾海域 、西班牙海域和西班牙海域 。塔玛亚历山大藻 A TH K9301、A TDH01 ,相关亚历山大藻 A 7和链状亚 () 历山大藻 A lexand rium ca tenella ACDH01由厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室王大志教授提供 ,分 别采自中国香港海域 、长江口海域 、香港海域和舟山海域 。 1. 2 实验方法 ( ) 1. 2. 1 塔玛亚历山大藻 EST Exp re ssed Sequence Tag序列的查找与去冗余 ()本实验所用塔玛亚历山大藻 EST序列主要来源于 NCB I N a tiona l Cen te r fo r B io techno logy Info rm a tion 主 页的 dbEST数据库 。查找到 EST序列后 ,利用 DNA Sta r软件包中的 SeqM an 程序 ,在 W indow s系统下对所得 EST序列进行拼接 。 1. 2. 2 微卫星位点的查找与 EST2SSR 引物设计 ( )通过 GRAM EN E网站的在线搜索工具 SSR IT h ttp: / /www. gram ene. o rg / db / sea rche s / ssrtoo l进行微卫星 位点的查找 。为进一步利用塔玛亚历山大藻 EST建立微卫星标记 ,在剔除 SSR 两侧序列小于 20 bp 的 EST之 ( )( ) 后 ,对余下的已经去冗余拼接的 EST用 P rimm e r p rimm e r ve rsion 5. 0 设计引物 ,并用 O ligo ve rsion 6 对设计 出的引物进行评价 。引物由上海生工公司合成 。 1. 2. 3 藻的批量培养 () 除 CCM P1598用 f /2 2Si培养基 即是 f /2培养基不加 Si盐 培养外 ,其它藻种均选用 f /2 培养基 。实验所 2126 生 态 学 报29卷 μ( ) 用培养基为 3. 3 %人工海水加营养盐配臵而成 ,经 0. 22m 纤维滤膜除菌所得 。臵于温度在 21 ?1 ?、光照 强度为 4000 lx、光暗循环为 L ?D = 12 ?12的 Xu temp 智能生物人工气候箱中进行培养 。 1. 2. 4 基因组 DNA 的提取 基因组 DNA 的提取采用 TaKaR a公司 U n ive rsa l Genom ic DNA Extrac tion Kit,略有改进 : ?延长 65 ?温浴 时间至 60 ,70m in,并隔 10 m in振荡混匀 1 次 ; ? 增加 1次 R in seA 洗脱过程 。 1. 2. 5 PCR 反应 μ PCR 反应体系为 10l,扩增聚合酶为 TaKaR a的 Ex Taq Ho t Sta rt V e rsion,反应的成分及用量分别为 : 10 2 + μμμμ() () ( ) ×PCR B uffe r M gP lu s1l, dN TP M ixtu re 各 2. 5 mmo l /L 0. 8l, TaKaR a Ex Taq H S 5U /l0. 1l,微卫星 μμ上 、下游引物各 0. 3l,模板 DNA 25,50 ng,用 ddHO 定量至 10l。10000 r /m in离心 10 s,臵 PCR 扩增仪上 2 进行扩增 。采用 Touch down PCR ,具体反应程序如下 : 94 ?预变性 5 m in; 94 ?变性 30 s, 60 ?退火 30 s, 72 ? 延伸 1 m in,循环 2次 。 94 ?变性 30 s, 58 ?退火 30 s, 72 ?延伸 1 m in,退火温度每次下降 2 ?,每个温度 2 轮 循环 ,直至 50 ?。 94 ?变性 30 s, 50 ?退火 30 s, 72 ?延伸 1 m in,循环 29 次 ,于最后 1 个循环后 72 ?延伸 7 [ 11 ] m in。采用许绍斌等 发展的 DNA 银染方法 ,用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 PCR 扩增结果 。 1. 2. 6 荧光标记引物与毛细管电泳检测 选择 PCR 扩增产物清晰的引物进行荧光标记 ,再次进行 PCR 扩增 。 ()μμ( ) μPCR 反应条件 Amp liTaq Go ld为 : 1l GeneAmp 10 ×PCR B uffe r II, 1lM gC l25mmo l /L , 0. 8l dN TP s 2 ( ) μμμ( ) 2. 5mmo l /L each, 1l P rim e r2m ix, 0. 2l Amp liTaq Go ld 5U /l, gDNA 终浓度为 50 ng,最后用 ddHO 补齐 2 μ到 10 l。 ( PCR 反应条件 如下 : 95 ?预变 性 12m in; 94 ?变 性 15 sec, 60 ?退 火 15 sec 每 过 两 个 循 环 降 2 度 , 直 至 ) 50 ?, 72 ?延伸 30 sec。 94 ?变性 15 sec, 50 ?退火 15 sec, 72 ?延伸 30 sec, 循 环 30 次 , 于 最后 1 个 循 环后 μμ 72 ?延伸 15m in。将 H i2D i Fo rm am ide 1 m l和 GeneScan2500 L IZ Size Standa rd 50 l混合后 ,取 9. 5 l 与 0. 5μ l经 20倍稀释的 PCR 产物混合后在 PE9700型 PCR 仪 95 ?变性 5m in,迅速放臵在冰中 5m in以上 。然后在 TM AB I PR ISM310 Gene tic A na lyze r上用 PE公司的 PO P24胶 , 15 kV 于 60 ?下电泳 28m in。 ( ) )( 电泳数据经 Gene scan 软件 3. 7版 、Geno typ e r 3. 7版 处理后得到检测片段大小 ,所用试剂除 dN TP s由 ()宝生物工程 大连 有限公司提供外 ,其他试剂均由 App lied B ioSystem s公司提供 。 1. 2. 7 数据分析 ( 用软件 PO PGEN E V e rsion 1. 31 对 电 泳 结 果 进 行 统 计 , 分 别 计 算 观 测 等 位 基 因 数 O b se rved num be r of ) ( ) ()a lle le s, Effec tive num be r of a lle le s, N e iN a 、有效等位基因数 N e、N ei ’s基因多样性 ’s Gene tic D ive rsity, H 和 ( )群体间遗传分化系数 Gene tic d iffe ren tia tion among pop u la tion s, G等 。用 N TSYS软件计算各个体间的遗传 S T )(相似度和 N e i’s遗传距离 ,再以 U PGMA U nwe igh ted Pa ir Group M e thod w ith A rithm e tic m ean s, 类平均法 算法 进行聚类分析 ,构建系统发育树 。 2 结果与分析 2. 1 ESTs序列去冗余及微卫星位点的筛选结果 经过 DNA Sta r软件聚类拼接 ,从 10885条塔玛亚历山大藻 CCM P1598的 EST序列中 ,共获得 6830 条非冗 余 EST。在 6830条非冗余 EST中 ,共发现了分布于 201个 EST中的 222个 SSR s,占全部 EST的 2. 94 % ,平均 每 18. 5 kb就有一个 SSR s。三核苷酸重复在所有的重复类型中所占比例最大 ,达到 48. 2 % ,重复单元 CTG / CA G出现频率最高 。在 201条含有 SSR s的 EST中 ,只含有 1个 SSR s的有 184条 ,含有 2个 SSR s的有 14条 , 含 3 个和 4个 SSR s的分别有 2 条和 1条 。 2. 2 引物的筛选与扩增结果 根据引物设计标准 ,从查找出的包含微卫星位点的序列中设计了 27 对引物 。用 CCM P1598 对其进行扩 增检测 ,结果共有 20 对引物出现预期扩增产物 ,其中 5 对来源于二碱基重复序列 , 9 对来源于三碱基重复序 列 , 6对来源于六碱基重复序列 。从以上 20 对引物中挑选 10 对条带清晰 、稳定性高 、重现性好的引物与文 [ 12 ] 献 中的两对引物一起作为最终确定的检测位点 ,观察不同藻株间的扩增结果 。 12 对引物在 7 株亚历山大藻中基本都有扩增条带产生 ,而且扩增结果中 ,除样品 A7 用引物 P5 扩出两条 带外 ,其他样品都只有一条带 ,这大体符合当前认为塔玛亚历山大藻是单倍体的结论 ,推测两条带的出现可能 是因为非特异扩增或同一位臵存在两个基因型的原因 。图 1代表性地列出引物 P2、P8、P10 和 P12 的毛细管 电泳检测结果 。 12 对引物的实际扩增片断均在预期扩增范围之内 。其中 ,除 P1、P4 和 P9 只有单一基因以外 ,剩下的 9 对引物均具有多态性 ,占到全部引物数目的 75 % ,说明在所有样品的水平上引物的选取具有一定的代表性 。 2. 3 塔玛亚历山大藻种内遗传多样性的分析 因客观条件限制 ,本实验中链状亚历山大藻和相关亚历山大藻选取的样本量不足以进行种内分析 ,因此 仅对塔玛亚历山大藻进行了种内遗传多样性分析 ,结果见表 1。可以看出 , 12 对微卫星引物在 4 株塔玛亚历 ()山大藻中共扩增出了 36 个位点 ,其中 5对引物的 17个位点 每对引物产生 2 ,4 个位点 具有多态性 ,多态性 引物比率为 41. 67 % , N e i’s基因多样性平均为 0. 2130。在 5 对具有多态性的引物中 ,每对引物观察到的等位 表 1 A. tam a ren se 12 个微卫星标记的遗传多样性统计 tam a ren se Ta b le 1 Gen et ic d iver sity sta t ist ic s of 12 SSR pr im er s in A. 观测等位 有效等位 πs基因 N e i基因数 基因数 ( )引物序列 5 ′—3 ′ 多样性 引物编号 核心序列 产物范围 O b se rved Effec tive N um be r R ep ea t mo tif P roduct N e iπs Gene tic P rim e r sequence num be r num be r D ive rsity of a lle le s of a lle le s A GTCACAA GAA TGGTGGAA G ( ) P1 CTC5 1 1 239 - GGTGA TAACCTGGGA GTGT GCCAACTCACGA TCCTTCA ( ) P2 CTT5 1 1 272 - A TGGCTTGTTCCTTTGCTCT A GA GCAA GGA TGTTGGTTCG [ 12 ] ( ) CA 14 3 3 0. 6667 159 ,173 P3 GCAACGCTTTCGTTACCA GCA A GCCTCACTTCGCCA TCA T ( ) P4 CCCGTC3 1 1 261 - TCGACTTTCCCGACTTCCT ( ) ( )GTG CGTGTG CGT 11 4 CTCA TGA GCA TCGCTTCA TTG [ 12 ] 1 1 243 - P5 ( ) ( ) CTTAA GGGA TCCTGCAAA TTG GCG CGTGTGCGTG 5 3 TGGCTTGA GACCGACTTT ( ) TGC P6 2 1. 8 0. 4444 263 ,266 29TGCTGTTGCGA GAA GGAC GCTCTTA TCCTGGGAA TGG () A G P7 2 1. 8 0. 4444 11250 ,252 A TTGA GGTGCCTTGGGA GT TACTGAAA TCTTGGGCTTCG ( ) GCA P8 2 1. 6 0. 3750 220 ,261 5TACA GGTGACGGGCTCTA TG CA TCTCCGACA TGA GCTGGA T ( ) GTC P9 1 1 167 - 5ACGA GGACTCCGACA TGGAA TGGTCGTTGTCGTGGTTG ( ) TGTGCT P10 1 1 288 - 5CTGGCGGACTTGTCGTTT ( ) ( ) CTTGTCV3C TG TGTTTCGCCTCTGAA TGC 3 P11 1 1 215 - ( ) CCTTG TCCTTT GCAAA GACAAA GA TGACGG 3 A TGCCCTGCTAAAA TGGG () AC P12 3 2. 6667 0. 6250 11278 ,290 GCGTCTGGTGAA TCGGTA 平均值 1. 5833 1. 4889 0. 2130 A ve rage 多态性引物数目 The num ber of po lymo rp h ic loc i: 5 多态性引物比率 The num ber of po lymo rp h ic loc i: 41. 67 % 2128 生 态 学 报29卷 基因分别为 2,3个 , N e i’s基因多样性范围为 0. 3750,0. 6667 ,总体平均等位基因数为 115833 个 ,平均有效 等位基因数为 1. 4889 个 。 2. 4 种间的遗传多样性分析 为了解亚历山大藻整体的遗传差异 ,对实验的 3个物种间也进行了遗传多样性分析 ,结果见表 2。 ( )表 2 亚历山大藻 3 个物种 7 个藻株 间的遗传多样性统计 ( ) Ta b le 2 Gen et ic d iver sity sta t ist ic s of 3 spec ies 7 samp le sin A lexa n d r ium 群体间遗传分化系数 引物编号 观测等位基因数 有效等位基因数 基因多样性 N e i’sGenetic d iffe ren tia tionamong N um be r O b served num be r of a lle le s Effective num be r of a lle le s N e i’s Gene tic D ive rsity pop u la tion s 2 2 P1 1 1 P2 3 2. 2727 0. 56 1. 0 0. 72 0. 6667 P3 4 3. 5714 2 2 P4 1 1 0. 6667 0. 6 P5 3 3 P6 3 2. 6667 0. 625 0. 6364 0. 64 0. 7692 P7 3 2. 7778 P8 3 2. 3333 0. 5714 0. 4878 P9 1 1 2 2 0. 72 0. 7692 P10 4 3. 5714 0. 375 1. 0 P11 2 1. 6 0. 6939 0. 449 P12 4 3. 2667 平均值 A ve rage 0. 4643 0. 7051 2. 6667 2. 3383 物种间多态性引物数 The num be r of po lymo rp h ic loc i: 9; 物种间多态性引物比率 The num be r of po lymo rp h ic loc i: 75 % 2. 5 对 7 个样本的聚类分析 为进一步探讨微卫星标记在藻种鉴定方面的可行性 ,在假设不知样本遗传背景的前提下 ,利用得到的微 ( )卫星多态性的结果 ,重新对 7个样本进行聚类 。 7个样本的遗传相似度矩阵和根据 N e i’s 1978 遗传距离构 建的树状图如图 2所示 。 图 2 7 个样本间 N ei’s遗传距离聚类图 F ig. 2 The dend rogram ba sed on N ei’s gene tic d istance of 7 samp les 从遗传相似度矩阵可以看出 , CCM P1598、A TH K9301 和 A TDH01 之间具有相当大的遗传相似性 ,分别达 到 0. 625000、0. 656250和 0. 65625 ,符合这 3种藻按形态学分类属于同一种的结论 ;但 CCM P116 与 CCM P112 之间相似度为 0. 78125 ,却与传统分类学相差较大 。依据传统的形态学分类方法 , CCM P116 属于塔玛亚历山 大藻 ,而 CCM P112 则 属 于 相 关 亚 历 山 大 藻 。链 状 亚 历 山 大 藻 ACDH01 与 塔 玛 亚 历 山 大 藻 CCM P1598 和 A TH K9301 之间的相似度均为 0. 59375 ,表明 ACDH01与塔玛亚历山大藻具有较大的遗传相似性 。从遗传聚 2130 生 态 学 报29卷 类图上可以更直观地观察到这几点 : A TH K9301、A TDH01 和 CCM P1598 首先聚类在一起 ,然后又与 ACDH01 聚在一枝 ,表明这 4种藻的遗传距离彼此比较接近 ; 有所不同的是 ,聚类图上 ACDH01 与其它 3 种藻虽然接 近 ,却仍然有差异 ,具有自己独立的分支 ;其它 , CCM P112 和 CCM P116 聚在一枝 ,二者与 A 7 一起与其他 4 种 藻区分开来 。 3 讨论 3. 1 微卫星位点的筛选 ( )目前 ,微卫星位点查找方法主要分为两大类 : 1 直接分离 ,从研究对象的基因组中分离出微卫星位点 ; ( )2 从已有数据库中查找微卫星位点或根据近缘物种基因组设计引物来扩增研究对象基因组 。本研究采取 从 EST数据库中筛选 SSR 位点的方法 ,不仅得到了实验所需的 SSR 位点 ,而且克服了传统筛选方法效率低下 的问题 ,同时节省了大量的人力 、物力和财力 ,一定程度上也验证了应用 ESTs2SSR 在藻类鉴定中的可行性 。 值得注意的是 ,因为 ESTs数据来自单轮测序 ,序列的错误率可高达 2 % ,5 % ,且 ESTs数据库中并未包 含序列的质量信息 ,有时序列在提交到网上前未能完全去除来自基因组 DNA 的污染 ,所以从 ESTs数据库中 查找 到的目标物种的 SSR 直接用于后续实验可能造成结果的假阳性 ,为了确保 SSR 序列的准确性 ,需要对序 列进行前处理 ,主要包括 :低质量序列和载体序列的去除 、真核生物 mRNA po lyA 尾巴的去除和冗余序列的拼 接等 。本研究中对下载的所有 EST序列进行了检测 ,结果发现这些 EST序列在网上提交之前已处理得较为 干净 ,因此仅仅对其进行了冗余序列的拼接 。 [ 13 ] 关于 ESTs2SSR 的查找标准 ,目前尚无一个确定的标准 ,不同的研究者有不同的选择 。 Saha 等 采用的 标准是二核苷酸重复次数 n ?10 ,三核苷酸重复次数 n ?6 ,四核苷酸重复次数 n ?5 和五核苷酸重复次数 n ? [ 14 ]4; B ecke r和 H eun所用的依据是单核苷酸重复 n ?10 ,两核苷酸重复 n ?5 ,三核苷酸重复 n ?4 和两个四核 [ 15 ]苷酸重复 n ?3;而 Sco tt采用的标准是单核苷酸 n ?10 ,两核苷酸重复次数 n ?7 ,三核苷酸重复次数 n ?5。 一般来说 ,核心序列重复次数越多 , 其相关的多态性就越高 , 更利于实验结 果的 检 测与 分析 。本实 验 采用 Sco tt等的标准 。 3. 2 ESTs2SSR 的密度及其分布情况 塔玛亚历山大藻的 EST序列在经过去冗余拼接后 , 10885 条原始序列组装成了 6830 个 con tig,约有 37 % 的 EST序列被整合或屏蔽 ,说明这些 EST序列在提交至网上数据库之前并未经过质量检测 ,仍然存在大量的 冗余及低质量序列 。经过 con tig分析后 ,有些断裂的 SSR 又重新被拼接起来 ,不仅提高了 SSR 在 EST序列中 的含量 ,而且增加了实验的可靠性 。 [ 16 ]() Eu jay从苜蓿 M ed icago trunca lu la 的 147000 个 ESTs中发现了 4384 个微卫星位点 ,约占序列总数的 [ 17 ] 2. 98 % ; Kan te ty等 对大 麦 、小麦 、水 稻 、高粱 和 玉米 EST中 SSR 的含 量 的统 计 发 现 , SSR 的 含 量 分 别 为314 % 、3. 2 % 、4. 7 % 、3. 6 %和 1. 5 % 。本实验共从 6830条塔玛亚历山大藻 EST con tig序列中查找到各种类型 的微卫星序列 222个 , SSR 数目约占全部 EST序列的 2. 94 % ,这与其它物种筛选出的微卫星比例大体相符 。 (塔玛亚历山 大 藻 的 SSR 密 度 较 低 , 大 约 为 每 18. 5 kb 出 现 一 个 SSR , 这 与 棉 花 每 20 kb 出 现 一 个 [ 18 ][ 18 ] (() ) SSR 相仿 ,却远远低于其它已知的多数物种 ,如水稻 每 3. 4 kb出现一个 SSR 、小麦 每 1. 67 kb出现 [ 19 ]()) 一个 SSR 和拟南芥 每 6 kb出现一个 SSR 等 。 在塔玛亚历山大藻的 ESTs中 ,三核苷酸重复所占的比例最高 ,达到 48. 2 % ,这与大部分物种的报道一[ 18 ] 致 ,据推测可能是因为三核苷酸重复数目的变化导致缺失了基因组的移码突变 ,从而避免了三核苷酸重复 [ 20 ] 单元的消失 。本实验中二核苷酸重复数目为 31 个 ,占全部 SSR 的 13. 96 % 。其中 ,出现频率最高的重复 [ 18 ]) ( 单元是 CT /A G 7 次 ,这与其他物种的研究结果类似 。 Ca rd le在研究拟南芥时指出 , A G / TC 在所有的微卫 [ 17 ] 星序列中所占比例最大 ,并且为 A T / TA 重复的 8 倍 ; Kan te ty等证明 GA /CT在 5 种禾本科植物中比例最 [ 21 ]高 。刘必谦等 研究条斑紫菜时发现 , A G /CT重复的次数最多 。 3. 3 荧光标记引物 2毛细管电泳检测微卫星 DNA 多态性的优越性 关于微卫星 DNA 的检测方法 ,国内目前发展较为成熟的是聚丙烯酰胺凝胶电泳加银染 ,因其程序简单 , [ 22 ] 易操作 ,故大部分文献上采用此法 。但该方法耗时 、耗力 ,而且在大规模 、多批次的数据收集和分析时存在 相当大的难度 ;加上判读带型时不同等位基因的识别完全靠经验 ,主观性太强 ,造成了实验结果的不可靠 。因 此 ,这种方法已逐渐被毛细管电泳所替代 。毛细管电泳作为一种快速分析方法 ,具有高效 、快速 、高灵敏度的 特点 ,已广泛用于医学 、生物学等领域 ,在核酸 、多肽和蛋白质等生物大分子的分析检测方面显示出巨大的优 [ 23 ] 越性 。本实验用聚丙烯酰胺凝胶电泳首先判断引物的质量 ,再以毛细管电泳作为最终微卫星 DNA 多态性 的检测手段 ,使得二者优势互补 ,既节省时间 ,又保证了实验结果的准确性 。 3. 4 微卫星位点多态性的分析 本研究的 12个微卫星座位在 3种 7 株亚历山大藻中共检测到了 32 个等位基因 ,平均每个座位有 2. 66 个等位基因 。塔玛亚历山大藻种内基因多样性为 0. 375,0. 6667 ,总体低于国外已发表文献中的塔玛亚历山 [ 12 ] [ 12 ] 大藻种内基因多样性水平 。究其原因 ,样本量小是一个主要的影响因素 。N aga i等 曾经选用 20 个样品 对 13个微卫星位点检测 ,基因多样性高达 0. 632,0. 974 ,而本实验仅有 4个样品 ,材料较少 ,造成了数值的偏 低 。除此之外 ,与材料的选择 、引物的来源也有关系 。实验中所用塔玛亚历山大藻大部分采自同一海域或邻 近海域 ,光照 、温度 、盐度等各种环境因素相差较小 ,很大程度上造成了塔玛亚历山大藻各株之间基因结构的趋同与遗传变异的缓慢 。同时 ,由于此次实验的微卫星引物是从 EST序列设计得来 , ESTs2SSR 来源于基因转 录编码区 ,而一些与生物基本生理 、生化和代谢密切相关的基因在物种内和物种间高度保守 。 相对于种内来说 ,物种间微卫星位点的基因多样性表现的较为丰富 ,平均达到 0. 4643 ,并且遗传分化系 数也较高 ,这说明不同藻种间由于不同的地理环境 、不同的遗传背景可能造成其具有较高的多态性 。 实验中 ,个别样本对于一些微卫星位点表现为条带缺失 ,其原因有二 : 一是引物扩增位点不存在目的基 [ 24 ] 因 ;二是存在无效等位基因 。除了条带缺失 ,个别位点还出现产生多余条带的现象 ,如 P5 在样品 A7 中扩 出两条带 ,这与目前认为亚历山大藻是单倍体的推断有悖 。研究表明 ,甲藻除了生殖期为二倍体外 ,其他时间 均为单倍体 ,而如果为纯培养 ,则即使处于二倍体时期仍然为纯合子 ,因此在做微卫星实验的时候 ,应该只能 [ 25 ] 有单一条带出现 。迄今已有不少研究证实了这个推断 ,如 Sco tt等 用微卫星方法证实了甲藻属于单倍体 ; [ 12 ][ 25 ] N aga i等 对 A. tam a rense进行微卫星扩增 ,只有单条带出现 。关于出现多于一条带的现象 , Sco tt等 推测 可能是由于该位点包含至少两个基因型的缘故 。在设计引物时 ,如果两侧序列相差过远 ,有可能核心序列不 [ 8 ]止一个 ,在电泳图上就可能出现多于预期数目的条带 , R ynea rson等 在研究硅藻时也发现类似现象 。硅藻为 二倍体 ,本应出现一至两条带 ,但结果显示有 3条带出现 。本实验中引物 P5 选自文献 ,对其引物筛选过程缺 乏了解 ,不排除存在两个基因位点的可能 ,至于具体情况需进一步研究 。 3. 5 用微卫星标记对亚历山大藻属进行分子鉴定的初步探讨 本实验应用微卫星技术对选用的 7 个样品的进化关系进行了初步分析 ,从聚类图可以看出 ,分离自西班 牙海域的 A. tam a rense CCM P116与 A. aff ine CCM P112 非常接近 ,无显著差别 。造成这种情况的原因可能与 [ 26 ] 共生细菌的干扰有关 。两种藻均来自西班牙海域 ,可能携带相同的细菌 ; 另一方面 ,可能与本文所用的微卫星数量有限有关 。从中国海域分离的 3 种塔玛亚历山大藻 A TH K9301、CCM P1598 和 A TDH01 在进化距离 上相互接近 ,符合传统分类学标准 ; 同样分离自中国海域的 A. ca tenella ACDH01 在聚类图上与 A. tam a rense [ 27 ] [ 7 ] 的距离较近 ,但没有完全聚在一枝 ,而是拥有自己独立的分枝 ,这与陈月琴 、Kam ikawa 等 的研究结论相[ 27 ] 似 ,说明微卫星标记可以区分这两种藻 。陈月琴等 发现 , A. tam a rense和 A. ca tenella 种间 ITS区序列有显 [ 7 ]著差异 ,核苷酸差异值大于 20 % ,应作不同种处理 。 Kam ikawa等 建立的基于线粒体 DNA 的分子标记 ,也将 A. tam a rense和 A. ca tenella 有效区分开来 。然而 ,许多学者却认为二者实为一种藻 ,有人为了方便 ,干脆将其 [ 6 ]统称为 ”A lexand rium com plex ”。王大志等 根据 ITS序列和蛋白质组成的差异提出 , A. tam a rense DH01 和 A. ca tenella DH01 应归于同一藻类 。 从聚类图上 ,还能观察到一个现象 ,即分离自相同或相近海域的藻种在遗传距离上相互接近 。实际上 ,根 () ( ) ()据 A lexand rium L SU rDNA 的序列 ,可以将塔玛亚历山大亚历山大藻分为北美 NA 、中亚 TA 、西欧 W E 和 2132 生 态 学 报29卷 [ 6 ] ()地中海 M E等不同的地理进化枝 ,却难以区分 A. tam a rense、A. ca tenella 和 A. fundyense之间的差异 。这 一方面可能是在分离藻种时 ,误把同种藻定为不同种 ;另一方面可能由于基因流的存在 。基因流是指基因在 群体中的运动 ,当一些个体从一个群体迁移到另一个群体时 ,他们把自身的基因带到新的群体中 ,使新的群体 [ 28 ] 的基因组成 、基因频率等都有较大的变化 。基因在群体间流动的水平越大 ,群体就会越均匀 ,或普遍相似 。 [ 26 ] 另外 ,由于赤潮藻的无菌培养比较困难 ,不能忽略共生细菌对结果的干扰和影响 。 4 结论 从 6830 条非冗余的 ESTs中共查找到 222个 SSR ,平均每 18. 5 kb就有一个 SSR ,三核苷酸重复在所有的 重复类型中所占比例最大 ,达到 48. 2 % ,重复单元 CTG /CA G出现频率最高 。进一步筛选出 12 条 SSR 引物 , 用于遗传多样性的分析 。遗传多样性分析结果显示 , 种内遗传多样性水平整体偏低 , 多态性引物比率仅为41. 67 % , N e i’s基因多样性平均为 0. 2130。种间遗传多样性水平较高 ,多态性引物比率为 75 % , N e i’s基因 多样性平均水平为 0. 4643;另外 ,种间遗传分化系数较高 ,平均水平为 0. 7051。聚类分析发现 , A. tam a rense CCM P116 与 A. aff ine CCM P112遗传距离极为接近 ; A. tam a rense A TH K9301、CCM P1598和 A TDH01相互聚在 一起 ; A. ca tenella ACDH01与 A. tam a rense分属两枝 。S SR 标记在亚历山大藻种内遗传多样性分析方面是一 种非常有用的工具 。 Referen ce s: ( ) [ 1 ] Q iu X Z, Chen Y Q. 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