二甲戊乐灵离体诱导酸枣八倍体的研究

二甲戊乐灵离体诱导酸枣八倍体的研究 第33卷第3期 2010年5月 河北农业大学 JOURNALOFAGRICULTURAlUNIVERSITYOFHEBEI V01.33No.6 May.2010 文章编号:1000,1573(2010)03—0042—04 二甲戊乐灵离体诱导酸枣八倍体的研究 路芳,代丽,刘孟军,赵锦 (河北农业大学中国枣研究中心,河北保定071001) 利用浸泡法对酸枣四倍体的茎段进行离体诱变,并摘要:以二甲戊乐灵为诱变剂, 采用流式细胞分析仪鉴定了 形态发生变化的植株细胞染色体倍性.结果表明:二甲戊乐灵诱导酸枣八倍体的最 适时间和浓度为200,300 ~.mol/L的溶液处理8,10d,诱变率为2O.00.在继代1次后,植株形态发生变化.继 代4次后,经流式细胞 仪测定为四倍体和八倍体的嵌合体. 关键词:酸枣;二甲戊乐灵;八倍体;离体诱变 中图分类号:S665.1文献标志码:A Astudyonoctoploidinductionofsourjujube(Ziziphusacidojujuba C.Y.ChengetM.J.Liu)withpendimethalininvitro LUFang,DAILi,LIUMeng-jun,ZHAOJin (ResearchCenterofChineseJujube,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001,Chi na) Abstract:Pendimethalinwasusedasmutagen,theshootsegmentsofthetetraploidplantletof sourjujubeweresoakedinsolutionmedium.Ploidylevelsweredeterminedbyflowcytometr y. Theresultsshowedthattheoptimumcombinationofconcentrationandtimeforoctoploidin — duetionofsourjujubewas2OO一300umol/Lpendimethalinfor8—10days.Thedoublingeffeet is20.00.Thephenotypicvariationwasproducedafteronesubculture.Afterfourshbcul— tures,chimerasoftetraploidandoctoploidwereidentifiedbytheflowcytometry. Keywords:sourjujube(ZiziphusacidojujubaC.Y.ChengetM.J.Liu);pendimethalin;OC- toploid;invitromutagenesis 酸枣(Ziziphusacidoj".ubaC.Y.Chenget M.J.Liu)原产我国,为枣的原生种,广泛分布于 我国北方诸省,是一种具有重要经济价值的野生果 树和药用植物资源口],同时也是加工保健食品和饮 料的优质原料[3].果树多倍体一般具有生长健壮, 枝粗,叶厚,果大,少籽或无籽,产量高等优点,而且 这些优点可通过无性繁殖使其保持稳定而不出现分 离.多倍体育种已成为许多果树育种学家的首 选『4].王娜等已成功利用秋水仙素诱导出枣和酸枣 的四倍体植株l5],并培育出大果,优质,中熟的四倍 体优良鲜食枣新品种"辰光".但迄今未见有八倍体 枣和酸枣的报道. 在果树上,通常用秋水仙素诱导染色体加倍,但 秋水仙素的毒性大,价格昂贵,并且严重干扰愈伤组 织的代谢和分化,死亡率高].近年来,除草剂 类药剂在多倍体诱导中的应用逐渐增多].有研究 表明,二硝基苯胺类除草剂(Dinitrobenzeneherbi— cide,DNH)对植物毒性低,且对人和环境比较安全, 收稿日期:2009一O9—24 基金项目:河北省杰出青年基金项目(C2010000679);河北省科技支撑计划 (06220117D-2);国家科技支撑升划 (2008BAD92B03,2007BAD36B07,2006BAD18B02).' 作者简介:路芳(1984一),女,河北省景县人,在读硕士生,主要从事干果种质资源与 分子辅助育种研究. 通讯作者:刘孟军(1965一),男,河北省望都人,博士,教授,主要从事干果种质资源与 分子辅助育种研究. 第3期路芳等:二甲戊乐灵离体诱导酸枣八倍体的研究43 其作用是通过干扰纺锤体而抑制细胞分裂中期的有 丝分裂l8],在离体情况下对植物微管蛋白的作用比 秋水仙素更有效].二甲戊乐灵作为二硝基苯胺类 除草剂中的一种,国内已在西瓜等作物上有成功的 报道.阎志红[等用二甲戊乐灵对西瓜子叶和 茎尖进行处理,其诱导率均明显的高于秋水仙素. 但诱导果树多倍体还未有报道.本试验尝试用二甲 戊乐灵诱导酸枣的八倍体,以期探索一条更有效,更 经济,更安全的枣树多倍体诱导新途径. 1材料和方法 1.1材料 试材为继代3年的酸枣四倍体组培苗,取自河 北农业大学中国枣研究中心干果种质资源与分子辅 助育种实验室. 基本培养基为MS,增殖培养基为MS+BA1.0 mg/L+IBA0.5mg/L.培养室温度23,25?,每 天光照时间14h,光照强度为1500lx. 1.2诱变方法 选取生长一致的组培苗,将其剪成双芽茎段,浸 泡在过滤灭菌的含有一定浓度的二甲戊乐灵液体培 养液中,二甲戊乐灵溶于1的二甲基亚砜中.二 甲戊乐灵的浓度分别为100,200,300/xmol/L,浸泡 的组培苗,用形态学鉴定方法对继代4代后其形态 变化指标稳定后的植株,包括纯合八倍体和嵌合体. 诱变率一变异植株数/鉴定植株总数×100% 致死率分析:致死植株指用二甲戊乐灵处理后的 组培苗,在继代培养基中培养30d后的死亡植株. 致死率一死亡植株数/接种植株总数×100% 1.4变异植株的倍性鉴定 1.4.1形态学鉴定?叶片形态指标的测定:选取 酸枣四倍体,变异植株组培苗各30株(以下同),取 从基部起第3,5片叶,用美国产Cl一202便携式 叶面积分析仪测量叶长,叶宽,叶形指数;?节间长 度,茎粗的测定:用游标卡尺测量酸枣四倍体,变异 植株组培苗从基部数第3,5节节间长度及茎粗,并 求平均值. 1.4.2DNA含量测定使用德国Partec公司生 产的流式细胞仪(华中农业大学作物遗传改良国家 重点实验室)测定再生植株单个细胞核的DNA含 量,共测定5000个细胞.DNA含量的分布曲线由 倍性分析仪自动测定.同时,测定与再生植株基因 型相对应的四倍体组培苗叶片的DNA含量,做为 对照. 2结果与分析 时间分别为6,8,10d,共9个处理,每个处理3O个2.1二甲戊乐灵不同处理浓度和 时间的诱导效果 茎段,重复3次,以无菌水和l?/6的二甲基亚砜溶液比较 作为对照.处理时封闭保存在组培室弱光处,置于如表1所示,二甲戊乐灵对酸枣茎 段的诱导效 速度为110r/min摇床摇动培养.处理完毕后,将果因处理浓度和时问的不同而 异;100/~mol/L和 茎段用无菌水冲洗3,5次,灭菌滤纸吸干表面水200/~mol/L的浓度均以处理10d 的效果较好,诱 分,接入正常的增殖培养基中继续培养40d.培养变率分别为13.33和20;而 300t~mol/L的浓度 过程中观察,记录植株生长情况及形态变化.处理8d的效果较好,诱变率为20.随着 二甲戊 1.3统计方法乐灵浓度的增加和浸泡时间的延长,致死率逐渐 诱变率分析:变异植株指用二甲戊乐灵处理后增加. 表1二甲戊乐灵对酸枣茎段的诱导效果 Table1InducingeffectsofPendimethalinonshootsegmentsofsourjujube M(u.y处 s 理 of 唰 treatm d 嘉.d致De 死 atR —— !!!!竺!1 690l3.33c0.00d 10089020.00c0.00d 1O9030.00bc13.33bc 69016.67c6.67c 酸枣20089023.33bc16.67ab 1O9O43.33b2O.OOa 69020.00c10.00bc 30089O26.67bc20.OOa 109083.33a3.33d 注:同一浓度内不同处理时间差异显着性检验采用新复极差法.小写字母表示0.05 水平,相同字母表示差异不显着. 44河北农业大学第33卷 2.2酸枣诱变株的形态变异 诱变初期变异株和对照株在整体外观形态上和 生长势上均有明显区别,变异株生长缓慢,矮化,畸 形,根部长出瘤状物,叶片出现裂痕,卷曲皱折,脆易 折断(图版I,A).对照株生长正常,叶片平展,绿 色,有一定的韧性(图版工,C). 变异株在增殖培养基中生长4代后,茎粗显着 高于对照植株(图版I,D),叶长,叶宽,叶面积都小 于对照(图版I,B),节间长度显着小于对照,叶形 指数变大,但差异不显着(表2). A:二甲戊乐灵诱导的部分变异叶片;B:变异株叶片和四倍体叶片;C:酸枣四倍体组 培苗;D:酸枣变异株组培苗. 图版I二甲戊乐灵诱导酸枣多倍体的形态变化 PlateIThemorphologicalchangesinsourjujubeinducedwithpendimethalin 表2继代4代后的变异植株形态 Table2Theappearancesofmutantplantsafterthreetofoursubcultures 注:方差分析采用邓肯式新复极差检验法.小写字母表示0.05水平,相同字母表示 差异不显着 2.3诱变株的DNA含量 为确定变异植株的倍性,采用流式细胞仪和 PartecDPAC软件对部分变异株及其对照植株的细 胞DNA含量测定和分析.结果表明,四倍体植株 (CK)仅在相对荧光强度值为100的位置上出现 1个明显的单峰(图1),而测定的变异株在约l()()的 位置和2O0的位置上分别出现1个单峰(图2),这 表明变异株的部分细胞的DNA含量增加了一倍, 既由4C变成了8C,而部分细胞的DNA含量没有 发生变化,既保持了原来的水平.由此可见,由二甲 戊乐灵诱变处理获得的酸枣变异株是四倍体和八倍 体的嵌合体,要想获得纯合的八倍体植株还需进一 步的分离. IFL1stain 图1酸枣四倍体植株DNA含量分布曲线 Fig.1DNAcontendistributionofthetetraploid plantofsourjujube IFL1stain 图2变异株DNA含量分布曲线 Fig.2DNAcontentdistributionofmutantplantlets 3讨论 近年来,利用低毒,高效,便宜的二硝基甲苯类 除草剂作为诱变剂,取得了很大进展.但由于植物 受基因型及器官组织等影响,这就要针对某种植物 进行探索,找出适合某种植物离体诱导的技术体系. 在进行二甲戊乐灵诱导酸枣八倍体试验中,诱 导的关键是既要获得较高的诱导率,又要保持较高 的成活率.处理时间短,药剂浓度低,加倍效果差, 处理时间过长,药剂浓度过高易发生药害,植株死 亡.因此,选用适宜的浓度和时间是诱导多倍体的 关键.本试验仅仅是对二甲戊乐灵诱导酸枣多倍体 的初步探索.诱导的多倍体均为八倍体和四倍体的 第3期路芳等:二甲戊乐灵离体诱导酸枣八倍体的研究45 嵌合体,可能是由于一些变异在生长过程中的四倍 化所致.形态观察是鉴定多倍体最快捷的方法,可 用于对变异株的初步筛选,能大量减少工作量.本 试验得到的变异体组培苗植株表现了植株矮小,叶 片变小,叶形指数变大,叶片变厚,节间变短等特征. 和二倍体酸枣相比,四倍体表现出一定的巨大性,但 八倍体变异植株在植株形态和叶片形态等特征上却 表现出一定的趋小性.说明并非倍性越高,就越表 现出巨大性. 在多倍体的诱导过程中,嵌合体的产生是难免 的.能否对嵌合体进行及时有效的分离成为获得同 质多倍体的关键因素,因此要想获得纯合的八倍体 酸枣植株还需进一步的分离选育. [5] [6] [7] [8] [9] Elo] 参考文献: [1]曲泽州,酸枣[M].北京:科学出版社,1981:243.,, [2]曲泽洲,王永蕙,刘孟军,等.酸枣的化学成分及其药 理研究[J],河北农业大学,1987,10(2):60—66. [3]中国科学院北京植物研究所,南京地质古生物研究所, 中国新生代植物编写组.中国植物化石[M].北京:科 学出版社,1978:144. [4]石荫坪,果树突变育种[M].上海:上海科学技术出版 社,1971. 王娜,刘孟军,代丽,等.秋水仙素离体诱导冬枣和酸 枣四倍体[J].园艺,2005,32(6):1008—1012. 韩毅科,杜胜利,张桂华,等.利用抗微管除草剂胺磺灵 诱导黄瓜四倍体[J].华北农,2006,21(4):27—30. 赵磷,刘文革,郭金丽,等.除草剂在植物离体染色体 加倍上的应用[J].长江蔬菜,2008(1):30—33. 唐除痴,李煜昶,陈彬,等.农药化学[M].天津:南开 大学出版社,1998:540—544. Mor~ohnLC,BureauTE,Mole-BajerT,eta1. Oryzalin,adinitroanilineherbicide,bindstoplanttub— linandinhibitsmicrotubulepolymerizationinvitro [J].Planta,1987,172:252—264. 阎志红,刘文革,赵圣杰,等.二甲戊乐灵和氟乐灵除 草剂对西瓜茎尖四倍体的诱导[c]//2oo8年园艺植 物染色体倍性操作与遗传改良学术研讨会论文摘要 集,2008. 阎志红,刘文革,赵圣杰,等.二甲戊乐灵和氟乐灵除 草剂对西瓜子?t四倍体的诱导[c]//2oo8年园艺植 物染色体倍性操作与遗传改良学术研讨会论文摘要 集,2008. (编辑:宗淑萍) (上接第36页) [7]蒋新龙.山茶花红色素的提取及其性质初探[J].园艺 ,2006,33(2):344—348. [8]庞海慧,张涛,肖建忠,等.红叶黄栌红色素的提取方 法及稳定性研究[J].河北农业大学,2007,30 (3):94,1OO. [9]史宝胜.紫叶李叶色生理变化及影响因素研究[D].哈 尔滨:东北林业大学,2006. [10]蒋益花.细叶美女樱红色素的提取及性质研究[J].丽 水学院,2007,29(5):42—47. [11]吕福梅,沈向,王东生,等.紫叶矮樱叶片色素性质及其 光合特性研究[j].中国农学通报,2005,21(2):225— 228. [12]朱书香,杨建民,王中华,等.4种李属彩叶植物色素 含量与叶色参数关系的研究[J].西北植物,2009 (8):1663—1669. [13]王光全,黄勇,盂庆杰,等.紫叶稠李色素提取及测定 研究[J].食品科学,2007,28(7):l78—181. [14]李云飞,李彦慧,王中华,等.土壤干旱胁迫对紫叶矮 樱叶片呈色的影响[J].生态,2009,29(7):3678— 3674. [15] [16] [17] [18] [19] [2O] [21] [22] MazzaG,BrouillardR.Recentdevelopmentsinthestabi— lizationofanthocyaninsinfoodproducts[J].FoodChem— istry,1987,25:207—225. BrouillardR.Chemicalstructureofanthocyanlns[c]// MarkakisP.Anthocyaninsasfoodcolors.NewYork: AcademicPress,l982. SweenyJG,WilkinsonMM,IacobucciGA.Effectof flavonoidsulfonatesonthephot0bleachingofantho— cyaninsinacidsolution[J].JA—gricFoodChem, 1981,29:563—567. BrouillardR.Theinvivoexpressionofanthocyanincolor inplants[J].Phytochem,1983,22:1311—1323. 丁锐.国外花色素苷的研究现状与进展[J].汉中师范 学院:自然科学,2004,22(2):73—78. GAFHendrg,JDHoughton.Naturalfoodcolourant [M].1992. 安田齐.花色的生理生物化学[M].傅玉兰,译.北京: 中国林业出版社,1989:68—100. 宁可夫.冬春二梅食疗宴[J].中国食品,1999(1):17—19. (编辑:宗淑萍)