TaqmanMGB探针检测慢性骨髓增殖性疾病患者的JAK2V617F突变

TaqmanMGB探针检测慢性骨髓增殖性疾病患者的JAK2V617F突变 TaqmanMGB探针检测慢性骨髓增殖性疾病 患者的JAK2V617F突变 作者:孙雪梅,徐祖琼,于慧,赖仁胜,谢玲,顾香芳,夏珺,李建勇 【摘要】目的:采用不同方法检测慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)患者的JAK2V617F突变率,评估临床应用的可能性。方法:提取84例Ph阴性CMPD患者单个核细胞DNA,利用RealtimePCR联合TaqmanMGB探针检测骨髓增殖性疾病患者的JAK2V6A7F的发生率,并利用限制性片段长度多态性(RFLP)对照检测CMPD患者的JAK2V617F突变率,用基因测序验证两种结果。结果:RealtimePCR联合TaqmanMGB探针检测84例Ph(-)CMPD患者,42例存在JAK2V617F,突变率为50%;其中PV、ET、IMF患者的突变率分别为76.7%(23/30)、25.9%(7/27)、42.5%(9/20),经RFLP检测84例Ph(-)CMPD总的突变率为33.3%,测序结果验证了RealtimePCR联合TaqmanMGB探针检测结果。结论:TaqmanMGB探针联合RealtimePCR方法有较高的准确率,可以作为检测JAK2V617F突变的方法。 【关键词】慢性骨髓增殖性疾病;JAK2突变;检测方法 慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)是以骨髓过度增殖为特点的一类疾病,Ph阴性CMPD包括真性红细胞增多症(PV)、慢性特发性骨髓纤维化(CIMF)、原发性血小板增多症(ET)、不能分类的骨髓增殖性疾病 1 (CMPDU)和慢性嗜酸性粒细胞白血病(CEL/HES)等。2005年开始多个研究小组发现Ph阴性CMPD患者中存在JAK2V617F突变,1,2,,功能研究以及模式动物研究显示该突变可引起JAK2激酶及下游信号通路的持续活化,导致细胞恶性增殖和凋亡抑制,3,。最新的WHO诊断强调了JAK2V617F突变的重要性,JAK2V617F应用于临床诊断要求有简便而灵敏的检测方法,4,。TaqmanMGB探针是一种新型检测单核苷酸多态性的探针,我们利用这种探针联合RealtimePCR方法5检测CMPD患者的JAK2V617F突变率,并与限制性片段长度多态性以及基因测序相比较,以寻找一种方便快捷的检测手段。 1材料和方法 1.1材料 84例Ph阴性CMPD患者,中位年龄51岁,其中PV30例,ET27例,IMF20例,CMPDU7例,其中男47例,女37例,6例骨髓移植供者作为正常对照,中位年龄为32岁,男3例,女3例。诊断标准符合2001年WHO标准,6,。 1.2.1样本收集和单个核细胞分离 患者外周血或者骨髓经肝素抗凝后收集,外周血经上臂静脉、骨髓 2 经髂前上棘或髂后上棘采集。利用人淋巴细胞分离液分离外周血/骨髓单个核细胞。 1.2.2JAK2V617F突变检测 提取单个核细胞DNA,保存于-20?;利用紫外分光光度计检测DNA浓度;利用RealtimePCR联合TaqmanMGB探针检测样本JAK2V617F突变:MGB探针:FAMCCACAGACACATACTMGB;TETCCACAGAAACATACTCMGB;Taq引物:FP:5TGCTCTGAGAAAGGCATTAGAAAG3;RP:5GCAGCAAGTATGATGAGCAAGC3;按下列体系加样(20μL体系):2×HoTaqPCRReactionMix10μL,探针mix(10μmol/L)0.6μL,引物mix(20μmol/L)0.5μL,模板(25mg/L)2μL,ddH2O水6.7μL。反应条件:2min50?、10min95?,30s95?,34s62?,50个循环。利用AppliedBiosysterm软件观察结果。限制性片段长度多态性检测JAK2V617F突变:利用引物F:5′GGGTTTCCTCAGAACGTTGA3′;R:5′TCATTGCTTTCCTTTTTCACAA3′经PCR扩增样本DNA,扩增出的DNA片段经提纯后利用Bsa?酶酶切,利用琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。比较上述两种方法检测的结果,将结果不同的样本DNA经PCR扩增后送基因测序。 1.2.3统计学分析 3 使用SPSS10.0软件,利用配对卡方检验以及Kappa检验,比较两种检测手段的检出率。 2结果 2.1TaqmanMGB探针联合RealtimePCR检测结果 84例PhCMPD患者中有42例患者有突变,突变率为50%。其中30例PV患者中有23例患者有突变,其中两例为纯和突变,其余21例为杂合突变,突变率为76.7,(23/30);27例ET患者中有7例患者有突变,均为杂合突变,阳性率为25.9,(7/27);其余患者无突变。20例IMF患者中有9例患者有突变,均为杂合突变,突变率为42.5,(9/20),其余患者无突变。7例CMPDU中有3例有突变,均为杂合突变(3/7),其余患者无突变。6例骨髓移植供者均无突变(图1)。 2.2限制性片段长度多态性检测JAK2V617F突变结果 84例Ph阴性CMPD患者中有28例患者检测到JAK2V617F突变(33.3%),其中30例PV患者中有16例有JAK2V617F突变,即53.3%(16/33),27例ET患者中有5例有突变,突变率为14.8%(5/27);20例IMF患者中有5例有突变,突变率为25%(5/20),7例CMPDU中 4 2例有突变(2/7),6例骨髓移植供者均无突变。 2.3测序结果 84例患者中有18例患者检测结果不一致,其中16例为经RealtimePCR检测到有JAK2V617F突变,但经RFLP方法未检测出突变,2例经RFLP方法检测有突变但经RealtimePCR检测提示无突变,将这18例样本重新扩增后送测序,并将2例纯合突变样本也扩增后基因测序。16例RealtimePCR检测为有JAK2V617F突变的患者,经测序也提示有JAK2V617F突变,但均为杂合突变,野生的碱基G的荧光强度高于突变的碱基T的荧光强度,与相应样本的的RealtimePCR检测中荧光强度一致;2例经RFLP检测提示有突变患者,经测序后提示无JAK2V617F突变(图2)。 3讨论 国外研究组报道JAK2V617F突变在PV中发生率为65%,97%,ET为23%,57%,IMF为35%,50%;我们利用RealtimePCR检测的PV、ET、IMF患者的突变率分别为76.7%(23/30)、25.9%(7/27)、42.5%(9/20)。获得性突变使jak2基因编码的蛋白质第617个氨基酸从缬氨酸转化为苯丙氨酸,使JAK2介导的包括促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、白细胞介素3 5 (IL3)、生长因子(GH)在内的多种细胞因子的信号转导在没有信号刺激下能持续激活,引起细胞持续增殖,这是骨髓增殖性疾病发生的重要环节。 目前,用于JAK2突变的研究与临床检测方法众多,7,,我们采用的TaqmanMGB探针是联合传统的Taqman以及MGB探针组成的新型探针,是单核苷酸多态性的检测中常用的探针,MGB探针可以结合在DNA双螺旋的小沟里,从而起到稳定DNA双螺旋的作用5,使探针更加稳定以及更具特异性,实验中所用的MGB探针因其长度较短,使淬灭分子与基团在空间位置上更接近,使实验的结果更精确,另外由于探针3′端结合了MGB,使得探针的Tm值提高,大大增加了探针的杂交稳定性,提高了配对与非配对模板间的Tm值差异,使非特异性杂交显著降低。我们检测的总的检测率(50%)高于限制性片段长度多态性的检出率(33.3%),而且与测序结果一致,检出率较高。国内阮氏8曾用同样的方法检测了MPD患者JAK2V617F突变,其中76例PV、115例ET和19例MF患者JAK2V617F突变的检出率分别为70,、51,及58,;而在其他恶性血液病及16例正常供者骨髓细胞中的检出率均为0。认为JAK2V617F突变在我国MPD患者中是广泛存在的。利用TaqManMGB探针进行实时定量PCR的方法可快速、准确地检测JAK2V617F突变。Elizabeth利用RealtimePCR方法检测CMPD患者的JAK2V617F突变率为39%,可以在含有含2.5%突变的DNA中检测到突变9,Poodt也利用RealtimePCR方法但使用的探针为MGB探针,可以在含有0.8%的突变的 6 DNA中检测出突变,敏感度比其他实验组所用的方法高10。我们利用 TaqmanMGB探针联合RealtimePCR方法我们检测的总的检出率 (50%)高于限制性片段长度多态性的检出率(33.3%),而且与测序结 果一致,检出率较高。而且此方法所需实验步骤少,减少了污染发生的 可能。另外RealtimePCR可以进行定量检测,为患者临床随访提供监测 手段,为疾病的发生发展以及发病机制的研究提供平台。 【参考文献】 ,1, 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