克咳片中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量测定

克咳片中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量测定 12* 郑英昊，鲁寅生 (1.延边大学，吉林 延吉 133000;2.江苏省食品药品检验所，江苏 南京 210008) 摘要:目的 建立克咳片中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定。 方法 采用高效液相色谱法同时测定克咳片中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量。色 谱柱:phenomenex Synergi Polar-RP柱(4.6mm×250mm，4μm)，以甲醇-0.092%磷酸溶液 (含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺)(1.5:98.5)为流动相，流速:1.0mL/min，柱温:30?， 检测波长:210nm。 结果 在一定浓度范围内，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积与浓度呈良好的线性关 系，平均加样回收率分别为102.26%和103.71%，RSD分别为0.34%和0.22%。 结论 本文所建立的方法简便、准确、可靠、稳定，专属性强，适用于克咳片中盐酸 麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量测定。 关键词:克咳片;麻黄;盐酸麻黄碱;盐酸伪麻黄碱;含量测定;高效液相色谱法 Determination of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride in Keke Tablets 12*Zheng Yinghao,Lu Yinsheng(1.Yanbian University,Jilin Yanji,133000;Jiangsu Institute for drug control Jiangsu Nanjing,210008,China) Abstract: Objective To establish an HPLC method for determination of ephedrine hydochloride and pseudoephedrine hydrochloride in Keke Tablets. Methods The samples were analyzed by a phemomenex synergi Polar-RP colum(4.6mm ×250mm,4μm),with mobile phase methanol-0.092%phosphoric acid(0.04% triethylamine and 0.02%second butylamine) (1.5:98.5) at flow rate 1.0mL/min and detection at UV wavelength of 210nm. Results In a certain concentration range, the peak area of ephedrine hydrochloride, pseudoephedrine hydrochloride and concentration showed a good linearity relationship, the average recovery was 102.26% and 103.71%, with RSD 0.34% and 0.22%. Conclusion This method is simple,accurate, reliable, stable, specific,and can be used as determination of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride in Keke Tablets. Key words:Keke Tablets; ephedrae herba; ephedrinehydrochloride; pseudoephedrine hydrochlorid; content determination; HPLC 克咳片由麻黄、罂粟壳、甘草、苦杏仁、桔梗、莱菔子、石膏等七味药组成，有止咳， 定喘，祛痰之功效，用于治疗咳嗽，喘急气短等病症。目前国内有3家不同省份的制药企业 生产该品种。 麻黄是本方中的君药，其主要有效成分为生物碱类物质，尤其盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄 碱含量较高，采用高效液相色谱法(HPLC)法测定麻黄药材中的盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄 碱含量已有很多报道，但均未见有关克咳片中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量测定方法的报 道，且未见《中国药典》收录克咳片的质量。为了保证药物的安全性，有效性和可控性， 本文对制剂质量进行研究，采用HPLC法同时测定克咳片中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的 含量，并测定了不同厂家不同批次克咳片中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量，为更准确、 有效地控制克咳片中麻黄药材的质量提供科学可靠的试验数据参考依据。 1 仪器与试药 ThermoFisher Dionex U3000超高液相色谱仪，Chromeleon 6.80中文版;JL-720DT超声波清洗器，上海杰理科技有限公司，上海吉理超声仪器有限公司;TG16-WS台式高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司 ;C300真空泵，北京桑翌科技发展有限公司;HSE-12固相萃取装置，天津市恒奥科技发展有限公司;Cleanert PCX-SPE(混合型阳离子交换固相萃取小柱) 60mg/3mL，Agela Technologies。 盐酸麻黄碱(171241-201007)和盐酸伪麻黄碱(171237-201208)，中国药品生物制品检定所。 克咳片，中山市恒生药业有限公司(批号:A、B、C、D)和江西民济药业有限公司(批号:E、F)提供。 甲醇为色谱纯;其余试剂均为纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱:phenomenex Synergi Polar-RP柱(4.6mm×250mm，4μm)，以甲醇-0.092%磷酸溶液(含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺)(1.5:98.5)为流动相，流速:1.0mL/min，柱温:30?，检测波长:210nm;进样量为5μL。 2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液的制备 分别取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱适量，精密称定，加新鲜配制的5%氨甲醇溶液溶解并制成浓度分别为130.2，125.4μg/mL的对照品溶液(S，S)，精密吸12取S和S适量，加新鲜配制的5%氨甲醇溶液稀释至浓度为13.02和12.54μg/mL的混合对12 照品溶液(S3)，备用。 2.2.2 供试品溶液的制备 取本品，研细，取约0.4g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入1.5%磷酸溶液50mL，密塞，称重，超声45min，放冷，称重，加1.5%磷酸溶液补足重量，摇匀，6000r/min离心5min，取续滤液2 mL，通过已被活化的PCX-SPE(水约10 mL?甲醇约10mL?0.1mol/L盐酸约20mL)，用甲醇5 mL洗脱，弃去洗脱液，再新鲜配制的5%氨甲醇溶液5mL洗脱，收集洗脱液，即得。 2.2.3 阴性样品溶液的制备 按2.2.2项下方法制备缺麻黄的阴性样品溶液。 2.3 系统适用性试验 盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按2个生物碱色谱峰计均大于9000，说明盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱在此色谱条件下均得到较好的分离。 2.4 专属性试验 取混合对照品溶液S3、供试品溶液、阴性对照溶液按2.1项下色谱条件测定，HPLC图见图1，结果表明，阴性对照溶液在2个生物碱出峰位置处无干扰。 A B C A.对照品;B.阴性样品(缺麻黄);C.克咳片样品(批号:C);1.盐酸麻黄碱; 2.盐酸伪麻黄碱 图1 专属性试验的HPLC图 Fig.1 HPLC Chromatograms of specificity test 2.5 线性关系考察 分别精密吸取S，S适量置量瓶中，用新鲜配制的5%氨甲醇溶液稀释2，12 3，5，10，15，20，25，50，100倍，摇匀，即得系列浓度的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的混合对照品溶液。按2.1项下色谱条件依次进行测定，以浓度(X，μg/mL)为横坐标，色谱峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程分别为:盐酸麻黄碱Y= 0.1177X + 0.0878，r=0.9999，线性范围为1.302~130.2μg/mL;盐酸伪麻黄碱Y= 0.1182X + 0.0176，r=1，线性范围为1.254~125.4μg/mL。 2.6 精密度试验 精密吸取样品溶液(批号:C)，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，计算各组分峰面积的RSD，结果盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的RSD分别为0.26%和0.27%。 2.7 稳定性试验 取供试品(批号:C)，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，精密吸取供试品溶液5μL，分别在0，2，4，8，12和24h各进样一次，测定峰面积，计算各组分峰面积RSD，结果盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的RSD分别为0.56%和0.65%。2种生物碱在24h内基本稳定。 2.8 重复性试验取供试品(批号:C)，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱 条件，平行测定6次，结果盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的平均含量分别为3.6634和3.8904mg/g;RSD分别为1.77%和2.37%。 2.9 加样回收率试验 取已知含量的样品6份，各0.2g，精密称定，分别精密加入一定量的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的对照品溶液，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1。盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的平均回收率分别为102.26%和103.71%;RSD分别为0.34%和0.22%。 表1 加样回收率试验结果 Tab.1 Results of recovery tests 组分 原有量/mg 加入量/mg 测得量/mg 回收率/% 盐酸麻黄碱 0.7329 0.7225 1.4705 102.10 0.7329 0.7225 1.4749 102.71 0.7329 0.7225 1.4711 102.17 0.7329 0.7225 1.4706 102.11 0.7329 0.7225 1.4685 101.82 0.7329 0.7225 1.4746 102.67 盐酸伪麻黄碱 0.7643 0.7815 1.5775 104.06 0.7643 0.7815 1.5746 103.69 0.7643 0.7815 1.5734 103.53 0.7643 0.7815 1.5753 103.77 0.7643 0.7815 1.5757 103.83 0.7643 0.7815 1.5724 103.41 2.10 样品含量测定 按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，分别测定两个厂家6批克咳片中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量，结果见表2。 表2 样品含量测定结果 Tab.2 Contents of two alkaloids in samples 含量/(mg/g) 批号 盐酸麻黄碱 盐酸伪麻黄碱 1.6237 A 4.0832 B 3.6032 3.9745 C 3.5942 3.8044 D 3.6643 3.8214 E 1.5982 2.2434 F 1.5345 2.1262 3 讨论 [2-5]参考有关麻黄入药的止咳平喘祛痰类中成药文献，提取方法考察了蒸馏法、碱化萃取法和超声提取法，结果表明蒸馏法难以控制蒸馏速度，一部分生物碱成分随水蒸气而丢失， 且蒸馏液收集的体积过多，实际操作不简便;碱化萃取法杂质虽少，但2个组分不易萃取完全，且色谱峰的峰形很不对称;超声法2个组分的色谱峰峰形对称，提取较完全。 提取溶剂考察了70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、20%甲醇、0.1mol/L盐酸、甲醇-1.5%磷酸溶液(20:80)、甲醇-1.5%磷酸溶液(10:90)、1.5%磷酸溶液，在相同体积相同超声时间条件下，比较各提取溶剂对2个组分的提取率，结果表明2个组分的色谱峰附近虽均有杂质峰，但1.5%磷酸溶液较其它溶剂提取完全。对于杂质峰的处理，选择过柱的方法去除，考察了中性氧化铝柱及PCX-SPE，结果表明1.5%磷酸滤液通过中性氧化铝柱后杂质峰仍在;而通过PCX-SPE后杂质峰少，尤其包含在盐酸麻黄碱色谱峰内的杂质已被去除。通过比较不同超声提取时间、不同上样过柱体积、不同洗脱液及洗脱顺序、收集洗脱液的体积等条件对盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的提取率，最终确定供试品溶液的制备方法为加1.5%磷酸溶液50mL，超声45min，取续滤液2 mL，通过已被活化的PCX-SPE，用甲醇5 mL洗脱，弃去洗脱液，再用新鲜配制的5%氨甲醇溶液5mL洗脱，收集洗脱液。作为供试品溶液的制备方法，其提取效果优于2010年版《中国药典》(一部)中的酸性条件提取，便于测定。 在柱温的选择中，分别考察了35?、30?、25?，最终确定采用柱温为30?，再此温度下盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的色谱峰对称性好，尤其包含在盐酸伪麻黄碱色谱峰内的杂质峰得到有效的分离，没有干扰。 本试验建立了克咳片中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量的高效液相色谱测定方法，并对来自不同厂家不同批次的克咳片中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量同时进行了测定，结果发现不同厂家不同批次的克咳片中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量差别较大，其中药材来源、制剂生产工艺等均有可能是其影响因素。 本文为克咳片中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量提出了一种测定方法，为克咳片的质量控制提出了一种准确、灵敏、稳定和快速的方法，同时也为国家未来进一步提高麻黄相关制剂的质量标准工作提供了科学可靠的试验数据。 参考文献 [1] 国家药典委员会. 中国药典2010年版[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:300. [2] 肖建春,陈帅,等. RP-HPLC测定小儿清热止咳颗粒中盐酸麻黄碱的含量[J]. 四川中 医,2011,29(10):48-49. [3] 王朋义,张海呜,等. HPLC测定艾芩止咳颗粒中盐酸麻黄碱的含量[J]. 中国中医药信息杂 志,2012,19(1):56-57. [4] 董自波,李超. HPLC法测定三拗片中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量[J]. 西北药学杂 志,2011,26(5):329-330. [5] 刘永利, 李冬梅,等. 固相萃取-多波长超高效液相色谱法同时测定咳喘宁中5种生物碱类 成分的含量[J]. 药学学报, 2011, 46 (5): 581-585. 表1 加样回收率试验结果 Tab.1 Results of recovery tests 组分 原有量/mg 加入量/mg 测得量/mg 回收率/% 1.4705 102.10 盐酸麻黄碱 0.72250.7329 102.71 0.7225 1.47490.7329 102.17 0.7225 1.47110.7329 102.11 0.7225 1.47060.7329 101.82 0.7225 1.46850.7329 102.67 0.7225 1.47460.7329 盐酸伪麻黄碱 1.5775 104.06 0.78150.7643 103.69 0.7815 1.57460.7643 103.53 0.7815 1.57340.7643 103.77 0.7815 1.57530.7643 103.83 0.7815 1.57570.7643 103.41 0.7815 1.57240.7643 表2 样品含量测定结果 Tab.2 Contents of two alkaloids in samples 含量/(mg/g) 批号 盐酸麻黄碱 盐酸伪麻黄碱 A 4.0832 1.6237 B 3.6032 3.9745 C 3.5942 3.8044 D 3.6643 3.8214 E 1.5982 2.2434 F 1.5345 2.1262 A B C A.对照品;B.阴性样品(缺麻黄);C.克咳片样品(批号:C);1.盐酸麻黄碱; 2.盐酸伪麻黄碱 图1 专属性试验的HPLC图 Fig.1 HPLC Chromatograms of specificity test 作者简介:郑英昊，女，满族，在读硕士研究生，研究方向:药剂学; 鲁寅生，。。。。。。。。。