还原型谷胱甘肽拮抗庆大霉素耳毒性实验研究

还原型谷胱甘肽拮抗庆大霉素耳毒性实验研究 上海第二医科大学 硕士学位论文 还原型谷胱甘肽拮抗庆大霉素耳毒性实验研究 姓名:于爱民 申请学位级别:硕士 专业:耳鼻咽喉-头颈外科 指导教师:赵纪余 2003.4.1临床医学专业硕士学位论文 中文摘要 目的: 比较还原型谷胱甘肽的两种给药方法对庆大霉素耳蜗毒性的拮抗效 果及其作 用机理的探讨。 天, 方法:健康黑日豚鼠只,随机分为四组,组,肌注生理盐水/ 天,组,肌注庆大霉素天后, 组,肌注庆大霉素/. 同时肌注庆大霉素和腹部皮下注射谷胱甘肽/.×天,组,先肌 注庆大霉素天,停药后再注射谷胱甘肽天。各组动物在庆大霉素停药 天后,以脑干听觉诱发电位在、、频率短音诱 发的?波反应阈:扫描电镜观察外毛细胞纤毛与表皮板的形态变化:采用耳 蜗基底膜铺片的方法,对深染的外毛细胞表皮板进行计数。 结果: 组耳蜗三排外毛细胞排列有序,呈字型。组外毛细胞纤毛散乱、凝聚、 倒伏,深染的表皮板数明显增加底回.?./视野,第二回.?. ,为?. , /视野,波反应阈提高为?. 为?. 。组深染的表皮板数较组明显减少底回.?. /视野,第二回.?./视野,波反应阈的提高幅度明显减小为 ?. 、为?. 、为?. .。组深染的表皮板数底回.?./视野,第二回.?. /视野及在士. 、:. 的?波反应阈与 组比较均无统计学差异.,然而: . 的?波反应 阙与组比较有显著性差异.。 结论: 还原型谷胱甘肽与庆大霉素合并应用可以显著地削弱庆大霉素的耳 毒性:庆 大霉素停药后再给予还原型谷胱甘肽,对已受损的耳蜗高频区的毛细胞可能 难以产生保护作用,但是对耳蜗中、低频区的毛细胞可能提供一定程度的保 护 作用。 关键同: 还原型谷胱甘肽 外毛细胞 表皮板临床医学专业硕士学位论文 二、英文摘要 .. , 【/ /./. , , . .?,? ,. ... .. .?, . 、. ? ,?. ,? ?. .. . .?. .?. ,?,?. ,?. . , .. .?. .?. ,..堕堕堕兰童些堡主兰堡丝壅?? ?? 士. 、 ? 士. ? .. ? 士.., . : ..糍寒鲑?嗨照辚士擎挺谂盘 三、蓬 文 《弓富 羹鏊耱蔑囊捺裳豢鏊夸寒蠹?寨晕恭辩纛麓瓣嚣囊,蘧渗紫壤鎏蒜戮靛蓑蒜 漆耨 揽精棱、蠛念毽麟染麓一缝浆麟,羚髓髂揍熊壤四。豳予蕊严璧鹣蟮毒瞧, 袋 裁了毫魏广泛褒添。蔻饕躐投蔑攀添遂劳,霄甄爹麟耪靛靛糯每落察篡露浑 爨程渤。爨 熬蕊羧瘸戡嬲《熬举爆糕鞲鼓瞧魁海参攀黄糖趱爨蕊糖斌燮蕤饕寨溅撂婆稳模燮,鹱巍 嚣撩耳串撵瓣抵糕漩豢繁群串毒瀚辩溥辫撼。 蕊携嚣戆搜黪羧垒粤焱蕤浓寰辩夔麴褰巍霉蠡舞漤蹩每辍饕褰蓑。氮蒺篱斌粪骜 瓣筑飘注徽~矜释毂黼浓艘选瓣蜷豫鞭经搬迷黪麟瓣滋丸内浑熬邀穗褪瓣缓慢。 臻蕊:~枣游燕漤港鼙鞠溱囊骞蕊蜂餐,蘸辩蠹漆邀孛嚣撩滚囊舞菸蘩器瓣瓣~擎姆, 两辨漱懋鲻物浓艘辫囊瓣鹣~麟,露嚣糖魏撵囊塞簧遴潍毂警皴释斑潜黻囊的凝糗。 蜜予慈懿羲蕊爨豫麓,盘鹫靛爨疼漆鍪爨啜霞纛簿潦凌熬簿蒸,蓊瓣纛蠹群漆嚣滚勰雹 缴艨中髂辫蹲鬻越长菇摄姆懿浓凝,骧犍侉蘸髅凑霹授餐熟继续藏鼹淌渤。 爨蕊糠蠛类爨躲鬻薄糕镶誊黼怒爱璧键蒺疯黼,稳瓣满突谶黼逐辩影镌鍪羰颡鳓 四。器嚣髅搀鬟瓤粼波撰蜜嚣蠛黎裁超凌熬鹣蒗溪逡经焱避龄篓?毽整巍誉潦鏊。逡蘧 鬻浓静武瓣擎毒勰糖斌骢磷辩,霄下鞭死糨鬻落潲蠹潆溅濒熬绫粒髂勰舷灸渗辩滋, 爨瀑耱最爨菸鐾蒙蠛羧露鬻魏凑爨泽凌爨汰壤‰套茹溅熬嚣炼毽《藩褰楚甄 缁熬斑辨潞瀵疆数熬藏辫愆予粼壤逯一凇承警黻警;起粼熬藏它?予撼凝麓 代瀚攀 落,蠢蓬蘩黪海粪瓣爨簧蓊穰镶;霉瀑毪蚤羟漾藜,产裳饕簿羧凌,懿莲籍浆鬟 势物鹤曼擞怒缨勰媳,予拨勰蠹墼躺黪挚黻疆鬻鼗淤?锻矮遴黻滞攀说,《泌 聚蕊簇瓣簿蘸氛粼戆鬟穗蒜予,鬣蘩剩?褰粪猁;麓惫糕麓藕褥寨予薅避麓褥藏凑 淤攥繇瀵搬,黪蟪了罨缨憋髂缕檄懿。巍壅螯滋魄斌黢诞嘲状太霉鏊霹娃孽媳惫 缀躯蠹多粹霆熬粼悲稼鬻褴戴》瓣潜藤灞粼獬,鑫糖蓬冒瓣鞣赣熬辩稔貘、、 蘩套嚣蠢搂迄瑾攒蕊,势磐蒗黧了魏蠡拳羚受倦发嶷荚键瓣熬爨稳述器状恋镁瓣黪 潞橼簿祗溅丧失。髓终还糍慕穗瓣辩静擎濑。 蛰经鸯谗多攀溪避嚣鞲襄器爵辘褒袋藤琴鬻嫒蔫囊袭簿事鼙势鑫霉誉爨攮鬟熬莲 糍,照蹙姆满毒:学憔镶护粼大致龄沟拣嚣媳裁,镳馥念粼耱经瓣矮缨麟姆懋瓣摊缀 嚣游疆予,键鸯鬟鞭罄,审蕤獒蕊簿。零潞翡试验鹾冀瑟瓣鑫予辫襞嚣黎潦警暴簸蘩 昝麟营艘嬲食势粼数穗爱燃鼷药磐法对获爽霉索搿凑经静糖蔽皴辩,会势耱稳静黼藤临床医学专业硕士学位论文 是观察还原型谷胱甘肽对应用庆大霉素即刻产生的活性氧清除作用。后继用药的目的 是观察还原型谷胱甘肽对庆大霉素停药后耳蜗内滞留庆大霉素产生活性氧 的清除作 用,减轻庆大霉素对耳蜗的延迟损害,以期为临床找到应用氨基糖甙类药物 产生耳毒 性后及时给予干预性治疗的药物。 二动物实验材料与方法 实验试剂: 盐酸氯胺酮注射液.,支,上海中西药业股份有限公司,沪卫药准字 第号 安定注射液/支,上海旭东海普药业有限公司,沪卫药准字 第号 还原型谷胱甘肽/支,注射用双蒸馏水配制,商品名:泰 特,意大利福斯卡玛生化制药公司 ,批号: 硫酸庆大霉素/支,上海中匹药业股份有限公司,沪卫药准字 第号 .%硝酸银试验试剂 %甘油试验试剂 %戊醛磷酸盐缓冲液试验试剂 实验器材: 光学显微镜及数码摄像系统型日本 公司 扫描电镜型荷兰公司 诱发电位仪型美国公司 双目解剖显微镜.型上海牌 电子天平型上海双豳牌 动物分组: 在仁济医院动物房购得健康雌性黑目花豚鼠只,体重~,耳廓反射临床医学专 业硕士学位论文 均阳性,编号后随机分为四组,正常对照组组只,试验期间死亡只,得 只,死亡只,得只:谷胱甘肽合并用药组 只:庆大霉素组 组只,死亡只,得只:谷胱甘肽后继用药组组只,死亡只, 得只。 给药方法: 正常对照组组肌肉注射生理盐水/天后,观察天:庆大霉素 组组肌肉注射庆大霉素/.,共天后,停药观察天:谷胱甘肽合 并用药组组注射庆大霉素/.,天后,每天先腹部皮下注射谷胱甘肽 /.,分钟后肌肉注射庆大霉素/.,共天,停药观察天: 谷胱甘肽后继用药组组注射庆大霉素/.天后,腹部皮下注射谷 胱甘肽/.天,停药观察天。 全耳蜗基底膜铺片及硝酸银染色法: 耳蜗基底膜铺片采用《耳鼻咽喉科实验技术》姜泗长,翟所强,及《豚鼠内 耳解剖检验手册》丁大连,姜泗长,所描述的方法: ,将豚鼠麻醉后断头,从颅骨背侧取下听泡,打开听泡,暴露耳蜗。 ,用细针于蜗尖处钻孔,并剔除听小骨,开放前庭窗、蜗窗。 ,用玻璃管从蜗尖缓慢灌入.%硝酸银,共~次,蒸馏水漂洗后,再用玻璃 吸管从蜗尖小孔缓慢灌入%中性甲醛,共~次,再将耳蜗浸入相同固定液固定 ~小时。 ,在解剖显微镜下从蜗尖开始,沿蜗壳的鼓室侧骨壁分离,针尖向外用力,逐回操 作至底回,用眼科剪在鼓阶进剪,一点点地剪除附着于岩部的骨质,勿把蜗轴折断。螺 旋韧带可随蜗壳一起被去除,或用显微游丝镊剔除,并同时须剔除前庭膜和螺旋器上 的覆膜,暴露燕个蜗轴和盘绕在其上面夕倒缘的基底膜。剔除前庭膜和螺旋器上的覆 膜时应十分小心,勿损伤外毛细胞。 ,用细微分离针从鼓阶向上轻抬基底膜,使基底膜内侧缘从鼓唇上分离下来。分离 过程从蜗尖向蜗底依次进行,直至取下全耳蜗基底膜。 ,将基底膜网状膜面向上,在截取不同回片段后铺放在载玻片上的甘油滴中,盖 上盖玻片,周围用中性树胶封固,在光学显微镜下观察毛细胞的纤毛和表皮板。 脑干听觉诱发电位:临床医学专业硕士学位论文 ~分钟后进入麻 动物测试前肌肉注射氯胺酮/和安定/复合麻醉 醉状态,一般可维持~分钟。测试过程中如动物稍许骚动,可以追加原药剂量的 ,量,以保证动物完成测试。麻醉后于颅顶耳间中线切开皮肤~暴露颅骨,于 其中点先用细针钻孔,钻通颅骨勿刺破硬脑膜,后插入记录电极,并用缝合皮肤后的线 端加以固定。在测试耳的耳垂上插入参考电极,对侧耳垂插入接地极。检测仪为 ,频率为、、,信号叠加 诱发电位仪,测试声为短音 次,以耳罩式耳机紧贴测试耳给声,须对准外耳道。分别检测、和 各频率的?波反应阙。 【美国诱发电位仪:采用耳罩式耳机,刺激声类型:短音 ,刺激声 极性:正负相声刺激交替,扫描时间:,刺激率:./,高通滤波: ,低通滤波:,敏感度:?,叠加次数:次。】 毛细胞扫描电镜标本制备: 毛细胞扫描电镜标本制备采用《耳鼻咽喉科实验技术》姜泗长,翟所强, 及《豚鼠内耳解剖检验手册》丁大连,姜泗长,所描述的方法: ,标本取材同基底膜铺片法步骤、、、。取材与固定应注意?取材应在分 钟内完成,操作应轻巧细致。取材不及时会造成毛细胞的自溶死亡,试验出现假阳性。 ?步骤结束后应用细针从低回蜗轴处沿蜗轴方向轻推,使整个蜗轴和盘绕在 其上面外 侧缘的基底膜从颞骨上完整脱离下来。这样有利于之后的定位。?固定液为%戊二醛 磷酸盐缓冲液,应灭菌无沉淀,并保存在冰箱内备用。?暴露观察面的器械和器皿 应消毒,基底膜暴露后标本应用固定液充分洗涤,以防骨屑沾染基底膜,影响电镜下观 察。?基底膜上的覆膜必须剔除,否则影响电镜观察。 ,后固定:标本再用%四氧化锇固定小时以上。 ,导电染色:标本缓冲液漂洗后放入%单宁酸溶液中分种,换一次新液,共一 小时,充分漂洗后,再用%四氧化锇固定小时。 ,梯度乙醇脱水,乙醇的浓度分别为%、%、%、%,每次乙醇浓度为 次,标本在每级浓度内停留的时间一般为分钟,并用醋酸异戊酯~小时处理置 换乙醇,以备临界点干燥。 ,临界点干燥。过程包括?装入样品,?注入液体,?置换醋酸异戊酯,? 蒸发,?放气。干燥后样品用双面胶固定在样品台上,周围用导电胶连接样本与金属样盗徕莲学专照磺士学筏论文 本鑫,注意程磐骞最徽辘下保持螟灸淘上定位。 ,标本放入真空室,溅射真空镀膜。 ,扫捺邀镜下鼹察耳瓶各国毛维魏。 三结果 . 豚鬣脑干听觉诱发电位观察 正常豚鼠波形囊个波组成,其中?波振幅最火,最稳定,教以?波反戏阂 反映耳蜗的功能,如图所泳: 强灏霉鞭鬣不嚣叛攀短毒诱发戆波形巍藤医学专鼗磁士学位论文 霆缀凌终在、、诱发懿掰波爱疲瓣絮表爱嚣: 表四组动物各频率的?波反应阕均值? 维 嚣缱 缀 缀均德 标礁差. . . . . . . . . . . 。 样本数靼组动物在的?波反应翊,经转换后,.软彳孛分析如 下: 反应蕊转换 .. . 。 . 国 .:反应闽转换 ?.?? 堕盎堕堂皇些堡主兰垡堡塞 % . . . .. . . . . .... . . . . .. . . . . . . .. ?. ’ . . .一 . 一.?.一. . . 一. 一 . . . . . 一 .. .. .一. . . .. .一 ’分析统计结果提示:维与组、组、组比较频率的 波反应阈 有显著性差异.,维与组比较有显著性差异.,组与组比较没 有显著性差异国. 四组动物的 波反应阈,.软件分析如下: 反应闽 . . . . . . . . :反应阈 ?? 堕堕匿堂童些堡主兰笪笙奎 % .? . . . .... . . ?. . .. .. . 盘 . . . . . . . . . . . . . . ?. . . . . . . ... . . . . . ?. . . . . . . . . . . .. . . .. . 分析统计结果提示:组与组、组、组比较的 /波反应阈有显 著性差异.,组与组比较有显著性差异.,组与组比较没有显 著性差异. 四组动物的 波反应阈,.软件分析如下: 反应阈. . .. . :反应阈 . % .?.临床医学专业硕士学位论文 . ... . .. . . ? . . .? . .一 . . .. . . .. .. . .. . ? . . ? ? . ?. . ?.. . . .. . .. .. . . . . ?. 分析统计结果提示:组与组、组、组比较耳蜗在频率下的? 波反应阈值有显著性差异?.,组与组、组比较也均有显著性差异.。 .豚鼠毛细胞扫描电镜观察 实验四组豚鼠试验结束后断头取听泡,制作电镜标本,结果如下: 图:正常豚鼠组耳蜗基底膜扫描电镜图。外毛细胞纤毛挺直,呈 字型,开口向内,排列整齐,且从第一排起向外逐层增高,纤毛增多,表皮板无内陷。 内毛细胞纤毛呈一字型,排列尚整齐。 一.豁寐医学专鼗磺?学使论交 圈:庆大霉索组组耳蜗基底膜扫描电镜图×。外毛细胞纤毛严重 受损,表现为纡毛脱失、倒饫、变形,表皮叛内鼷。内毛缨瑰也鸯一定程液豹变形、 倒伏。 图:合并用翁组组耳蜗基底膜扫描电铸图×。雏毛播胞纤毛也宥 教农性熬终连翻茯瓣落,表爱板下陪,毽稷度较痰大霉素缀唆显减轻,肉穰缩稳纾笔 形态有散乱。犒寐医学专照磺士学位论文 豳;后继用药组组耳蜗基底膜扫描电镜图×。部分外笔细胞纤毛 虽蔫倒伏,部分脱落,表皮扳下貉。 .豚鼠耳瞒基底耧铸片及深染懿努毛继巍表皮板诗数 本实骏在豚鼠实验期结束后,断头处死动物取孵泡,按实验步骤进行耳蜗基底膜 铺符,在光学显徽镜下进行深染的外毛细臆表皮袄计数。嶷体方法如下: 显微镜视野下,耳烬镳片呈弧线形,将基底骥第一捧外毫缨熬的两端蹩于视野的 直径与圆周的交点上,正常耳蜗铺片在视野下每排外港细胞为个,底嘲毛 缨艨数较第二塞珞多。苓霹耳鼹羚篷缨熬憨数无骥漫差募。每一个浑蜒铺片分裂绫诗 其底回和第二回在倍的视野下深染的外毛细胞表皮极数。 深染的表皮板总数? 稷辩数深染熬表蔽叛数/糖鹭。戳诧漾染嚣表受教数代表该霉甄拜毛鬃魏形态擎摸 伤褪度。此记录方法与《耳鼻咽喉科全书.弹科学》页耳蜗全程计数法大致辐当, 由予本试验珲蜗镳片盼有部分基底媵缺臻,所;不能进行企程计数。由于祷深染的表 皮板数较正常外毛缨胞数少,因此数有深染的表皮板更为方便。 深染衰皮板的确认:袭皮板染色明显较正常外范细胞深,表皮板的面积大予磁常 外魄细魏,纾乏骥爨瓣胀,模糊,甚至缺失,表皮摄破裂,施渥爨瑰象,提零毛 细胞发生变性“”。结果如下:临床医学专业硕士学位论文 图、:组耳蜗基底膜底回与第二回硝酸银染色图×,细胞排列整齐, 纤毛染色均匀,呈字型,开口向内。未见表皮板深染的毛细胞。瞒珠莲学专簸颈士学位论文 图、:组耳蜗基底膜底回与第二网硝酸银染色图×,大部分外毛细胞 字羹纾亳模糊,较多表皮裁深絷。未发鞴成片的表皮袄缺失或瞵状板瘢痰的表现。临床暖学专业硕士学位论文 嚣、:缝器瘸基纛貘底瑟与第二醺磷酸锻染色踅×,捧笔绥麓静纾 毛大致清晰,仅少量惑细胞表皮板深染。晒藤医学专照磺士学位论文 胬、 缀耳蜗熬底膜底闰与第二回硝酸银染色图×,外毪细胞纤毛 模糊,底觋三排外麓细胞均有表皮叛深染,第二网有散在裘皮叛深染。四组动 物深染的表皮板数统计见表,如下 表四组豚鼠深染的表皮板数均值个/视野 底回第二回 分组 底回第二回 底回第二回底回第二回 . . . . . . . . 平均数 : . 士. 士. 士. . . :. . 差样本数 四组豚鼠底回与第二回外毛细胞深染的表皮板数,经转换,. 统计如下: 底网转换 .似 . .. . :底回转换 . % 分组 分组 .... 一..... 一. . .... . . . . .. . . .. . . . . ... 一.... . .. . . .... .. . .. . ..坚壁墨兰童些堡主兰生丝苎 ?? 以上统计学分析结果提示:组底回外毛细胞深染表皮板数与组、组、组 比较表现显著性差异.,组外毛细胞深染表皮板数与组比较法,因 为数据转换后,变量齐性试验.有显著性差异.,与组比较没有显著 性差异.。 四组第二回外毛细胞深染表皮板数经转换,.统计如下: 第:阐转换 怕 . .. :第二回转换 . %奇缎 分组 .. . ? . . . 一. 一.? . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . ? ? . . ., ? . ?.???? . ’ ..弱臻莲学专垃硪士学毽论文 以上统计学分析结果提示:缎外毛细胞深染裘皮板数与组比较法, 因为数据转换后,嶷量齐憔试验.矮有显藩性差异国啪.,与缀组院较 没有显著投差异国.。组外毛缌胞深染表皮扳数与缀比较有姓著性蕤异?., 与组比较没有显著性差弊.。辐藤医学专簸殒?学位论支 论 隧讨 氨基耱裁类撬象素在辫寐主被广泛应耀将近六十年煞掰受,它姥够予捷缍 菌核糖体溺性来抑制蛋白质合成系统,杀菌性很强,并且其价格低廉?。由予 被不恰当 遣瀣惩,潦成了严踅的耳毒往,所黻成秀药锈健群聋静主簧原因。在我嚣氨基耱贰类 临床可鉴定的耳毒性发生零为.%,庆犬霉素造成豹前庭功能紊乱与听力损伤可达 到“’为了预防和拮抗其耳毒性,国内步学者做了很多方厮的研究。同时也为 研究其它耳毒性药物致病撬铡开辟了道路。 部分研究表明,庆犬霉素的耳海性可能在于其代谢物“?墒与外纛细胞膜上的 二磷羧磷艨魏瓤薅缝会翻“?,导致维藏骥瓣遁透缎改交,鼹蠹戆滔牲氧壤麓, 进一步造成对胞内膜的损镶,如溶酶体、线粒体膜破裂,从而导致外毛细胞的死亡、 骄力下降疆鞑。垂予在薛瓣内撩澄不畅,虽然箨莼,毽蹩蘧着辩阋维移仍能对肇细 胞造成损害“粥,因此临床土如何磁发现氨簇糖甙类耳毒性后拮抗其进一步的损害和保 护残余听力,成了必须要解决酶阔越。 程耳蜗病理性损伤中担当着重要作用,它在外亳细胞内是如何形成的,至 今尚没有缩论,其产生的部位可能主鬻来源予线粒体晓”。作用机制也可能是复杂和多环 节瓣。比如进氧化氯是一令无处不在鹣,它较荔透过缨骢貘,在箴珏躲酶 促下参与了与活性趱氧自豳基的反腹,产擞活性羟麓反应物,,, 疆毪襞冒羧与缨蕤貘上琴键黢耱魏羧反瘦,产生瓣,‘,’,逡或维藏貘 损伤“剐。另外还直接破坏了肌渤蛋白微丝,角骚白,中间纤维和微管,还 胃籀是获箕撵镳豹浆貘上离鞭了缀稔骨檠豢鑫嘲。舅有学者谈兔潦嚣还可能是春兴奋 性氨基酸如铸氨酸过度的释放,造成的细胞损伤。假与也不无关系,表现 在?氧纯产物可激增加盼释放鞠?舔氨酸耳毒性可以被清除莉阻止鳓。 另外细胞骥损伤后赡溶性璃予在臆内积聚增加也是造成壤缨瑰避一步损伤的 原因,胞内钙离子的积聚导致的细胞毒性体用包括胞内构架的破坏,断裂形成碎片, 缨瓣器热线粒俸豹攫嫠珏。 对耳蜗备类细胞产生损害的程度能不同。形究对耳蜗组 织黪臻害,发瑗霉蠛瓣孛醚秘臻图不疑类蘩缨貔裔不藤麓爱应,霹糯毒糗最 敏感,敏感性较小,和细胞对无反陂?。簸寐莲擎专澈磺圭学位沦文 、、窍骥 本实骏器组,逝逻庚火霉素之嚣,掰波芨应阙 显提高,扫描电镜下外毛细胞纤毛倒伏,散乱,脱失,可见表皮板下陷,虽空洞状,耳 臻镶冀‘蕊察,魔嚣释第二嚣有较多黧串获豹表皮鬏深染,攥苯该鳃漤掳耳蠛疆嚣耳毒毪 病变. 为’恭抗庆大檬素鹣霹毒往,保护耳龋毛缀簇,藏动耱实验帮狡臻酃傲了大墩实 验。包括铁螯合剂,抗氧化荆,神经胶质细胞衍生的神经营养因子,以及中药黄芪等邯 渤。本动物实验采用了生物体本身卵具有的抗氧纯活性的还原帮;还原型谷胱甘肢, 体钋绘药,以嬲达到接抗依用?,褥不对机体产生副作用,同时蠛不影响庆大霉豢豹 杀蔼性。 辑究续架显示:组动褥合势疲建谷麟鸶获与痰丈霉素之嚣,、窝 的波反威阙提高的幅度明显减小,耳蜗铺片的深染的表皮板数明显下降,扫描电镜 土裘瑷舞筏绥蕊纾氇疆藩藏少,上蔽蔽下貔或至交瀛襻改交减少;毒魏提示还藤壤谷 胱讨肽可能具有拮抗庆大檬素豹耳毒性的你用日邹,此结果与 .等的研究结果一 致?。 还原型谷胱甘股的拮抗庆大霉豢耳毒性作用机剃,作者推测其可能作用于下联几 个环节:?补充镳细胞内消耗的豁胱甘肽水平九四,还原型谷胱甘肤农谷胱甘肽过 氧化物酶珏催化下与腿内戆类过氧化物反应生成,自身转变 为,以清除胞内活性氧,减轻活性氧对细胞内关键酶及细胞器的损伤醐。? 在谷貔嚣麓.。转移酶麓痒爱下,与务释舞潦性或凑源蛙亲彀子复会貔秘 毒性底物避行结合反应,从丽排出体外,达到解毒目的。?剐。?谷胱甘肽可能间接 影穗了藤内离子翡平衡,减少瓷子肉聚,降低稳内超载渤”鞴。?还漾 型符胱甘肽可能同时清除了毛细胞所在的内淋巴液中的活性氧,从而减轻其损害峥。 组动物在淡大霉素符药后寂糟还藤凝谷胱曹放试图降低耳蜗内浅采捧涟代谢的 庆大霉索对外毛细胞的损崧,但是从本实骏结果分析,组耳蜗镶片显示,在底嬲翔 第二回均散在分布有表皮板深染的外毛细胞,深染的表皮板数与组比较统计上光显 著性差异。秘憋?渡反波藏与组毙较瞧无显簧性差舅。提示斌继 用翡方法可能尚不能很好她拮抗庆大霉素的后继损害,难以降低傅药后高频听阈继续 璞蹇熬趋势。毽是豹 渡反盛瓣与缀穗魄窍驻著槛差麓,掇嚣嚣继疲燕 谷胱甘肽治疗也许对耳蜗中、低频区的嘏细胞提供一定糨度的保护作用。凝摩嚣学专监疆?学棱论变 谗老捺涟嚣缝建药效巢苓爨戆鼙戆麓疆嚣为:奉缀试验痰大霉素注射熬爨是 /,共涎,豚鼠耳蜗螺旋器损伤的总稷魔较轻,而且实验中未比较停药时及 魁死嚣匏 波反痰谶变证,薏洼髂本蕴骡鬣势莼器舞耪避露鬻驰程度,嚣燕 不能有效地分辨出谷肮甘肽的保护作用。?本组实验谷胱甘肽只用了一种剂量 /,共天,约蠢箴久裁攘黪倍,爵髓在发生庆大霉素耳毒拣磊嚣黎应雳 受大荆量黝答赋持肢,才鼹阻颧痰大霉素冉留延迟假用。?成用庆大莓素十必后赊融经死 亡的外毛绸臆外,部分罨细胞内缁胞器如线粒体,甚有一定程度损伤,骚岛合成障礴, 这?过程巴茏法搿逆,爨蹲阂魏搂移,这些缨魏瞧不霹牵凳域运濒恁亡。?痰大霉素 礴经促成辩启动了毛细胞的凋亡媳程,还原型谷胱甘肤并不能阻止这一进程,最终这些 躺魏巷会疆镤亡露丧失动穗,导致爨交下降。融耀实骢诞实在痰犬霉素诱导 的前庭毛细胞中观察到凋亡的细胞。其调亡机制可能悬通避不同途径可诱导细 黥穗亡,懿耋揍羧傍,竣鑫关键酶,诱发簸貘藤蜃避襞德,葳嚣影噙缨臆僖睁传 导,激发褥关调控基因,导致细胞凋亡。线粒体在熊中起到至关重骚的作用,因为 对线粒体膜遥透校浚变,弓起线荻体释放缀旅褥亡起始瓣子酶藏缓魏黼亡蛋鑫酶激 滔魏子一,避孺激蜓半虢氮酸蛋彝酶,诱撼缎瓤溯亡的发生。同对,正鬻对停 泊在线粒体膜内魇的内源住抗旖亡分予在作用下与诱导细胞凋亡分予 和分离,捷冀参与髓嚣熬缨骢烫亡过程”。 所以本实验结果提泳还原缴谷胱甘肽与庆大霉素合并应用以拮抗庆大霉索耳 毒性戆律惩,嚣簿蘸螽塞疆还覆爨谷魏黄获莓嫠淡苓戆较辩速甄携莸浑毒缝鹣器蘸。 今后研究方向可能为?应用还原粼谷胱甘肽达到播抗目的的剂量~效应图?探明庆大 霉素等蓊襄胃巯存在翁孺亡缨貔试薅羧箍亡药耨保护静笔缨藏葳者台劳疲震摭溺亡 药物与谷胱甘肽熊否更好地搪抗庆犬霉素耳毒性。 藏外由于还舔垄谷臃留获在空气审不稳定,落诧国矫学者采用的是舜丙酯褡虢营 救,劳虽捡测和比较了还漂墼谷赋曹豉与异嚣酯谷胱彗默渣艟脊渡孛瓣禽量,发现巽 丙黼谷胱甘肽能惨提高脑脊液中谷胱甘肽的含量蝴,然两谷胱甘股在耳蜗内外淋巴液 中鼹羧交歪今巍泰嚣援道。瑟;乏务魅营救在耳蜗渗基滚药穆凄力学或筏谢方嚣邀姨穆 逃一步的探索。 ,临床医学专业硕士学位论文 四 结论 .还原型谷胱甘肽合并庆大霉素使用可以明显减轻庆大霉素对豚鼠耳蜗的毒性,保护 外毛细胞,减缓听阙损害的进程。其生化反应机制可能与还原型谷胱甘肽清除耳蜗 内因庆大霉素而产生的活性氧氧自由基有关。 .庆大霉素停药后应用还原型谷胱甘肽对耳蜗高频区的外毛细胞没有明显的保护作 用,可能与停药后毛细胞的调亡,或与谷胱甘肽的剂量等有关。但是后继应用还 原型谷胱甘肽治疗或许可以对耳蜗中低频区外毛细胞提供一定的保护作用。临床医学专业硕士学位论文 五参考文献. ., . ..: .灏.,,..,..,,..,,... ,, . :. ., ., ., . . ,:?. . .姜泗长顾瑞王正敏《耳鼻咽喉科全书?耳科学》第二版上海科学技术出版社 , .: .,... 。. ..。, .,...,. .: .:.. ., ,.: .. ..,.,, . .:.. ,... ...?. ., ,?.,.,./ ...:..,【.,..,..,....:. .。. .,,..,,” ; ...:?.丁大连赵纪余听毛细胞表皮板的光镜与电镜联合观察听力学及言语 疾病杂志 :?:.】. .堕堕匡兰童些堡主堂垡堡奎 ?? 一 ....:? ,. ,. ,.. ...:? ,. ,, ..,,.. .. .:... ....,:. ,. ,..,.. . . ..: ,..,. ;..,’..,. .. .:.. ,., ... : .. .,.,...,.., ...:. ,...,,.. : ,...,:. ..,.,. ...:. ..,,。.,,..,....:. ,.,.,,. :....,:. ,..,,., , ..,:. ,.,..,,...堕盎垦堂主些堡主兰垡笙塞 ?? . ,:.,..,,.. ..,:. , , . ’. ..:. . ,., ...,:. . . : .. . ,:. . . ..,., . .,,.,. ,. . ..:.......... ..:?. ,..,,..,..,..,. .....: 昏. ,.,,., .,....:. , . , : ...: .,.,....:。. .. ... ..临床医学专业硕士学位论文 .:. ,..,..,..,..,.. ... .. .:. . .,.. . . ,: 彭黎明王曾礼《细胞调亡的基础与临床》北京人民卫生出版社,。. ;;;;;;;. ..;:. ..裕臻医学专娆磺?学位论文 六中文详细攮要 目的: 院较还原燮谷胱帮觖静两种给药方法对痰大霉素洋蜗毒髋的掊抗效 采及其作 用机理的探讨。 方法;健康黑目花豚鼠只,体重~,编号后隧机分为四组,组风, 瓤注生理簸永/天,共天,瑷察天,实验翅死亡只,褥只 缎只,肌注庆大霉素/.天,观察灭,死亡只,得 冀:缀哭,飘注淡大霉素天螽,每次瓿注庆大鬈素蔻,羧罄受下注 射谷胱甘肽/.天,观察天,死亡只,褥只:维只, 毙虢注庚犬霉素天,停药屠菇瘦下注莉谷魏曾获天,藐察天,死亡 只,得只。务缎在动物庆大霉紫停药天后,以脑干片觉诱发电位 稔测在、、短音诱发的?波反应阕:扫描电镜观察外毛细胞纤 蕺和表皮投的形态变化采用耳蜗基底膜镳片匏方法,以.%磷酸锻染色, 计数外罨细胞深染的表皮板数。 缭暴: 盎缀骂瓶三捺秘毫缨憝龚梦紧密存葶,纾藩挺壹,璺字黧。缀三蓑终穗 爨 胞纤毛散乱、凝聚、肿胀、倒伏和缺失,底回与第二回大量外惑细胞表皮板 滚繁,深絷豹表受援鼗兔建霾。./撬努,第二嚣。圭,/褪簿, 反臌阈提商明显为?. ,为?. , 菇?. 。蕴步滋细臆纾毛缺失狻少,赢匿、第二霞有淑在 分布豹深染表皮投,深染的表皮板数为底嘲../视野,第二劂.?./ 视野, 反威闽为盘. ,?. 。 . 。组深染鲍表皮板数为滤圆。?。/褪野,第二回。?。/ ?. ?. 视野, 反陵阙为 , 。 。 。.绞诗获移分辑表赞维深染戆裘疫板数铰錾键銎 降低.,、和的 反应阙提高幅度明显减小 ,,錾深染鳇表瘦援数袋鞋靛 反应阕翔与缀疆: 较光统计学差异.,然而的?反应阈尚组比较却有鼹著 佼差异.。 结论: 还琢型谷胱甘肽墨庆大霉豢合并应用时可以明显延缓庆大鬈素所跛的豚鼠 耳临床医学专业硕士学位论文 蜗的病理变化,显著地减弱庆大霉素的耳毒性,但是当药物的耳毒性已造成 了毛细胞的变性,停药后再给予还原型谷胱甘肽进行治疗,可能己不能影响 其耳蜗高频区受损的毛细胞,而对其中低频区的毛细胞可能有一定的保护作 用。 外毛细胞 表皮板 关键词还原型谷胱甘肽 七英文详细摘要. ? ./, /., /. , . , . .? ,,..%. ; ; : ...临床医学专业硕士学位论文 .. .?. ,.?.. ? ?. ,?. , ?.。 . ...,.?. ??. ,?. . . ?. . .?. ..?. 士. . ? 士. ? 。. . .,, , ? ?,...,,,. : ..簸廉医学专鼗磺圭擎键论文 八综述 耳蜗内活性氧鸯谷胱甘肽抗氧化系统的研究 于爱民膏综述 赵窦已余审校 活憷氧是瘸理状态下细飚臻亡盼关键因素,近年发现珲蜗农缺盘、嗓音暴褥和 耳璨性药物使用后成激性增加。谷觥甘肽及其相关酶作为一种重要的生理性抗氧 化系统,猩机体内怒到了清除活性氯,保护组织不同细胞的作用。 嚣蝇内添性氧 活性裁 ,指生物体内氧的某些代谢产物及其衍生的 会筑携,冀专氧攘魄骞更溪泼熬纯学反农拣,毽撬。,黔:,珏鹞,’潍,竣黎类霆氧 化物等。需氧生物体内均可产生活性氧,商其独特的生理作用,如白细胞释噬作用中, 潘瞧襞哥辩瘸漂体迸行恭骛。壶予产量较低,势纛俸蠹鸯活往氧鹣清除系统,掰苏不 会澍自身产生伤害。 .耳蛹肉活性氧鹩产生 活性氧可以在不同组织病理状淼下大爨产生,从甄导致细胞死亡”。 发现超氧化物歧化酶在豚鼠酥蜗内有较高水平的活性,提示宥过氧化物产生的环 境。研究发现氨基糖二鹫类摭生索耳毒搜蜀能是添性氧参与熬缝募, 至于这些活性氧的形成还不清楚。发现参与了卡铂对三天龄大 聚骣舔戆掇整鞠。发现在爨声暴露嚣越毛缀戆熬撰鬻辫。 利用流式细胞仪和:氯乙髋荧光素过氧化氢荧光标记物的方法发 瑗痰丈霉素治疗屠,浑瓶在?鞠移内底部与奚裔?毛维胞蚜遮速产生了,并且检 测剿顶部蕺细胞随庆大霉素剂量的增加,的产生也显藩增加。 逐速盼产生可能怒由于庶大霉索岛胞浆绷胞膜赢接的反廉,或者魑通过影响 信号传递系统零期的过程。其产生主要是胞浆膜性结构上氧证酶与骥类 过载记物的反应,迸包括黄嘌呤氧化酶或者铁媒触过氧阴离子产物都是可能的竞蟹者 拉。当然体内奏逑裁倔稳酶秘签璇嚣歇或其媲抗氧熊裁豹澄滁终爆,俸蠹系绫孛凌镁低 剂擞与体外系统急性高剂爨会有所不同。 缍藤爽线粒髂珂戆是鼙毒性药携治疗露魏凑过畿话钫产玺静关键来滚,现在滏没 有实验证实。然而流行病学研究发现线粒体失调瘸患者的某一对氨基糖苷类特别敏感妪辩医学专波磺士学位论文 戆鏊爨霹独立遗通过母系遗传,毒疆类不麓瓣交髯游发生淼绫粒体,庆太霉索于 扰了细菌的蛋白系缆,同时可能无选择的干扰了与细菌同源的线粒体的蛋白系 绞,软嚣产生霉毒经。 另外后米也发现在无细胞的铁/庆大霉豢粘和物/ 中有过氧纯裙产黧,提示缁施步魄可髓怒过氧纯物来源乏一蹲。 。耳蜗内活性氧的损害机制 耳蜗在成激情况下如噪声,群毒药物,缺血等产斑的可能会对耳螭多种 缨胞产生损害。研究糕对蓐蜗组织豹损害,发现群蜗兹中题和项题不 同类型细胞有不同的反应,对海性最敏感,敏感性较小,和 缨腿对碣?:无反发。选霉实验其体逢双察了慰攀囊蕊毛缨怒形态馨四 及其功能的改变【“。其作用机制可能是复杂和多环节的。比如过氧化氢悬~个无处不 在戆,它较茹透过缨藏簇,参笃 或怠活蠖趣氧鑫蠢基。懿反瘫, 使铁酶促活性羟基反应物,‘,形成,潍性氧可以姆细胞滕上不饱和脂 肪黢反应,产囊.,’,。,造成缁胞膜损伤。努矫胞膜损伤后熬溶性离 子在胞内积聚也增加甜,胞内钙辫子的积聚导致的细胞簿性作用包括胞内构架的破 坏,断袈形成碎片,细胞器如线粒体的损伤‘”。另有认为损害机制是它破 豁了腿动蛋白徽丝,焦蛋妇中闽纾维秘微铃,还霹髓是从其抛锚静浆膜上离瑟了缨腿 骨架蛋白。另裔学者认为原因还可能照兴奋性氮基酸过度释放,但与 氇不无关系,表褒农?氧纯产鐾可毅壤麓熬释藏辩’?谷氨酸蓐毒性莓戳薮 清除剂阻止【。 近年来,大量骈究表秘逶过不露途径哥诱导缓藤添亡,熬壹接攒伤, 攻谢关键酶,诱发胞膜脂质过氧化,从而影响细胞信号传导,激发有关调控基 因,导 致缃胞凋亡。线粒体在其中起到至关重要的作用,因为对线鞍体膜遁透性改 变, 弓越线粒体释放细胞凋亡起始因予壤缨胞凋亡蛋白簿激活鞭子.,避越 激活半胱氨酸蛋白酶,诱导细胞凋亡的发嫩。同时,正常时停泊禚线粒体膜内 层的内 滚热挠凋亡分子在终援下与诱强细胞璇亡分子襄分蹇,使焚参 与蒴后的细胞凋亡过程 已用实验证实在庆大糕素诱静的前庭龟细胞中观 察裂凋亡熬缨藏嘲。 谷胱甘黻抗氧化豢统貉臻医学专照疆士学位论文 。答麟营熬黪念成,攘关酶,疑英生壤佳用 谷胱甘肽在生命机体内广泛存在,由三种氨基酸个谷氨酸,半胱氨酸,甘氨 袋缝藏,在羟内会畿,谷糕羧擎鼹氨酸连接酶怒麸其蔻体合或的羧速 酶。胞内存在两种形浅,还暇型和氧化型。在谷胱甘肽过飘化 秘酶,舔依赖蘩分子蘩约舞,至水溶佳霞聚体蛋鑫, 每个亚基食一个原子作用下熊与活性葳应转变成水,绒者与胞内酯类过氧 纯物.反应缴成,自身转交为。在谷胱曾肽还藤酶粉作 用下由供氯,循环转变为。谷胱甘嚣.转移酶,叉称为非硒依赖 型是一种聚体酶类,根据其氨基酸的顺序和底物的特辫性可分为,, ,家羧。在大鬣髂蠹至少有静不嗣豹嚣工黪已被检测出来,每一秘存在予特异 的组织和细胞中。在的作用下,埒各种外源性或内源性亲电子复合物和毒性 疯物遗嚣终合爰寂,麸磊捺窭体雏,这鬓解毒蓦豹。 在生命机体内担当的角色包括:?一种还原剂:?一种妁毒物或代谢物在生 穆转运中的结合秘:?过裁亿合豹帮自由麓的清除帮:?许多酶的辅助因予 泌。避麓 研巍发现,还可能是~种待定豹神经递质, 首先发现当料离 子诱导的去极化时,可有捅应的从神经组织中释放,在耳蜗内像 套类似发现,势璐黎到摄入煎腿疼是离予依赖性的,矛可以于挽它豹摄入。 。耳螭内答黢彗蕊拳拳,援关酶类静表达及影鞫因素 动物耳蜗内谷胱甘肽表达相对串富,利用免疫胶体金细胞化学电镜技 寒发瑗免疫添性在纛管纹静凌皮壤稳,墓底释中阉缩耱,螺旋耘带纤维缩藏, 蘸 庭内膜优先表达,其分布与有相当大的重叠。虽然在内外毛细胞亦有表达, 毽建含量糯对较低游。同时也有报道谷氨酸半胱氨酸连接酶在外整组织袭达 黼 研究了胄龄的大鼠,在耳蠛听神缀上皮。 外璇组织,血管组织,听神经均有,的表 达,其中在活性蟪对较低,奁其锻耳蜗缀织与野缀织攘似,在各缎织串 表达相似, 依赖型在耳蜗组织中的表达显著低于肝组织。 谷麓嚣获帮稳关酶承乎在不弱静懿动绣,苓麓性爱,苓霹组织缓熬,淡及随颦龄 和机体状态不同,外源性损害类型不同,衾有不同表达和对环境刺激作出相应反殿。缓窳莲掌专、盈颟?学经论文 戳了不慰落葵状淼下对庆大霉素耳毒性的保护终慰,发 现低蛋白饮食的动物给予治疗,可以减轻庆大霉素的耳毒性。提示给与的 麓掇藩谷魏曹获在嚣甄蕊羧蒙,谷魏萤获豹勰毒终震与谷魏营歉东霉媛内窳平毒关。 商蛋白饮食的动物体内自舟保护机制没有蹙到抑制以及给与更多的会受到体内平 衡税稍静黼褥,敖没有这样孵保护俸雳鳓。 ,,在耳蜗神经上皮,外壁组织,听神经,胤管纹的裘达可随年 。提示抗氧化系统的混瓿眈 龄增长而发生退行性改变,而酶的活性尚保持不交 机体全身黢年龄的改变遥鬻更显著。丽太鼠的发育过程,初生豹幼鼠其主簧的 同工酶是,第二周和第四周其含量两倍增长,但增长了八倍, 或必成年羝酶主要形式,搀当了耳螟鑫隽绦护魏爨要角色,麸瑟鳞释了幼年丈鼠瓣琴 毒性药物敏感的原因。 琴毒健药蘩舔榉会影穗摅氧纯系统。一般麓量黪茨大霉素耨卡镰导致稼鬣轻 度辉聋不会影响耳蜗神经上皮谷胱甘肽水平。。而高剂量耳毒药物如卡钢能引起豚鼠 和犬鬣耳螭稀经上泼谷胱诗获永平遂著性下降,活性下降,活性不受影响澜。 庆大霉素不能引起艇个耳蜗谷胱甘肽水乎照著性下降,与耳蜗内较低的谷胱甘肽水乎 会增加耳毒性药物辩耳蜗的毒性作用拉’似乎相悖,推测可能是庆犬霉素作用的靶目标 主要局限在外毛缨腮,孬搀经上疫蠹其他缨愍掩馋了它鹩终用。 目前对噪声的研究发现在噪声暴露小时耳蜗外壁缀织内水平最著提澍, 奎辩嚣羧笈歪攀,穗反褒戮辜睾经主瘦秘蠛辘熬渡动劳无曼蒜改交滞。 .耳蜗内谷胱甘肽的保护性作用机制 耳蟥肉谷虢彗歉辩纲熬矮有一定静保护律矮圭罄是壹接与在酶键下生成榴关 的惰性可溶性自由基,其可结合形成谷胱甘肽二硫化合物茅?过氧化氢,因此为. 和提供了底秘,从而清除了的纲施毒性。其次细胞被暴露于过氧化飘后, 会罨起具裔巯基的氧化蛋是族的增加。在藏黪促下对这些蛋囱族 维持其还臌状态极其重要。另外巯基的氧化蛋白的氧化还原反威状态还会影响细胞 离子戆警鬻。在纡维母缨照巾熊孪枣剿漤寒矛瓷子熬持续增热,减少 所致的细胞损害。在耳蜗神经上皮的解毒作用中发挥重要角色,亦是可 戆影穗了霹&璃子会每懿雏戆撰害撬裁。临床医学专业硕士学位论文 据目前研究,给与外源性是否也有保护作用尚难定论,首先谷胱甘肽在耳蜗 内的转运路径还不清楚,有作者研究中给与一种半胱氨酸的前药,当胞内 被耗尽时,可以迅速提高水平。或者将乙酯化后形成可被转运入胞 内,并被转变成。 其次细胞内的含量及其相关酶可能也影响耳蜗的细胞对反应。中 的含量低于和支持细胞,从而解释了对较为敏感的原因。 噪声的后继损害也许是因为复合体和酶的减少。谷胱甘肽复合体的抑制剂 .,.能使内耳的谷胱甘肽水平迅速地减少,导致噪声 对耳蜗的损害加重,表明在内耳内的转运是非常迅速的引。 但有作者认为胞内的在产生的早期起到自我的保护作 用,由于在胞内的半衰期较短,对后期的的反应没有保护作用,所以认为 给与外源,是清除了胞外的而起到了保护作用。 对噪声性聋的保护,认为既然噪声暴露后听神经上皮 水平无明显改变,所以推测来源于外壁组织的被释放到内外淋巴液,对器 起到保护作用,而非通过毛细胞或支持细胞自身产生的。 当然给与外源也可能干扰了胞内氧化还原状态即/平衡,引起其 他的生化旁路,造成对细胞的毒性。 因此今后的研究可能应当进一步弄清外源性在耳蜗内代谢过程及发挥作用 的 靶点,为临床治疗提供更好的依据。 其他抗氧化物酶与谷胱甘肽抗氧化系统的协同 生物体内尚有其他的抗氧化物酶,如过氧化氢酶,过氧化物歧化酶 等,都有组织特异性和细胞内分布不均性,如主要存在于细胞微粒体内,丽在 脑 组织和精予中几乎没有, ?主要存在于线粒体和胞浆内,在脑组织和精子中 ?含量却较丰富,也主要存在线粒体内。其三者在胞内共同起到协同作用。 如果胞内有活性氧如产生,进入线粒体后,在酶的催化下生成。,。随后 在?酶的催化下生成水而解毒。多余少量的。可以渗入胞浆,被胞浆 酶催化生成水,或者进入微粒体被过氧化氢酶催化生成水。所以细胞内的抗 氧化系统 可相互协同,对于清除胞内活性氧,保护存活细胞有积极意义‘。显然在耳蜗 这方面 的研究还不多。堕堕墨兰童些堡主堂垡鲨壅 ?? 一一一 参考文献 ,. .,..,,.. ..,: ...... ,.. ...,: .. .... ....,: ’ . .,..,,.,,. ....,: . .,..,,..,,.. ...,: .,.,,..,,.. ...,:..,..,,..,,.. : ....,: ,. .,.. / ...,: ..,., ...,:. .,..,,..,.. ...,:..,..,,., ...,: , .., , . ..,:?,??, ..,:. ..