振动刺激对废用性肌萎缩大鼠肌纤维形态结构的影响

振动刺激对废用性肌萎缩大鼠肌纤维形态结构的影响 1.引言 大量研究明～运动减退,Hyperkinesias,[1,2]、制动,Immobilization,[3,4,5]、肌肉去负荷,Unloading,[6,7]均可使骨骼肌出现废用性萎缩,Skeletal Muscle Disuse Atrophy～SMDA,～而许多运动性损伤,如骨折、韧带撕裂等,的治疗又常常伴有运动减退或要求制动与肌肉去负荷。因此～如何通过减轻骨骼肌萎缩的训练手段来加强运动损伤的康复治疗效果～成为运动康复中的一个新课题。 废用性肌萎缩时肌肉结构形态最直接的变化是肌肉萎缩～表现为肌肉湿重减轻和肌肉及肌纤维体积减少～肌纤维平均横截面积缩小,同时肌纤维类型也发生改变～表现为慢缩肌纤维(?型肌纤维)数量减少的同时快缩肌纤维(?型肌纤维)数量增加～而总的肌纤维数量不变～表明肌纤维在萎缩过程中发生了?型肌纤维向?型肌纤维方向的转化。大多数动物实验研究表明慢缩肌纤维较快缩肌纤维在制动状态的萎缩程度大～而在人类最先受累的是快缩肌纤维～人与动物之间的差别可以解释为制动情况下占较大比例的肌纤维最先受累～这一发现对肌萎缩的康复训练及治疗计划具有重要的意义[8]。 振动刺激,Vibration Stimuli～VS,是一种新的力量训练方法～对肌肉力量和做功能力的提高有急性和长期训练作用。振动刺激训练能够达到肌群之间平衡协调发展～可以用在运动员伤后的康复训 练上～使受伤的运动员能够早日重返赛场进行正常训练和比赛。因此～我们认为振动刺激训练对肌肉萎缩的康复训练～具有一定的应用价值。可以向运动医学、康复医学、航空医学等广大医学领域进行推广。 本研究的目的在于～通过大鼠尾部悬吊方法造成废用性肌肉萎缩～在恢复期实施振动刺激～测定废用性肌肉萎缩湿重变化和骨骼肌类型转化等形态学改变情况～探讨振动刺激对废用性肌肉萎缩的作用及其机制～为振动刺激运用于废用性肌萎缩的康复训练提供参考。 2.材料与方法 2.1 实验动物及处理 本实验采用健康活泼的SD 雌性大鼠40 只,大鼠购于海淀区兴隆动物养殖场～清洁级～均有动物质量合格证,～体重180g,200g。动物适应性饲养3 天后～按随机配对原则分为4组:对照组,A,10 只～振动组,B,10 只～悬吊组,C,10 只～自然恢复组,D,10 只。 2.2 模拟失重模型的建立与训练方法 尾部悬吊模拟失重大鼠模型采用陈杰[9]的方法进行。该模型设置为实验大鼠采用尾部悬吊～后肢悬空～前肢着地～身体长轴与水平面呈300。悬吊同时动物在笼内可以自由活动、饮水、进食,所有动物均为单笼饲养,室温维持于20，25 0C,室内提供12 小时黑暗与照明的交替循环。 尾部悬吊满14 天后～各组大鼠解除悬吊。开始进行振动刺激训练。振动刺激源使用Pneu-Vibe Pro 振动台。对于悬吊振动组,B,予以20Hz 的振动刺激～每次持续10 分钟～每天2 次～间隔5 分钟～ 一周进行6 次～持续4 周。本实验中使用了简易的维持大鼠直立装置～确保使大鼠在振动期间保持直立状态。如图 1所示～振动训练过程中～大鼠以双侧下肢站立在振动台上～身体直立～头可伸向瓶口～不影响呼吸。 振动台使用北京得信佳和医疗科技有限公司出产的Pneu-Vibe Pro 振动力量训练器(专业型,～该振动器使用频率范围在10,60Hz～振幅5,10mm,持续训练时间可达100 分钟～负重:最高可达1200 磅,台面尺寸:100 x 76cm(长 x 宽)。该振动器可调节高频及低频～可作肌肉力量训练及各种放松训练用。如图 2所示。 悬吊14 天后～C 组用戊巴比妥钠腹腔麻醉(45 mg/kg ～ip)后～迅速取出比目鱼肌称量其湿重～所得数据以100 g 体重标化～作为比目鱼肌湿重体重比,称重后～取每一比目鱼肌标本的中段～按垂直于肌纤维的方向取5 mm 厚的肌肉组织～置于液氮中迅速冷冻后～放入,80 度冰箱待测。其余各组在振动训练结束后采用同样方法取材。进行恒冷箱切片～切片厚度为10m m。将切片裱贴在载玻璃片上～空气中干燥后用于mATPase 组织化学染色。染色采用异染性燃料,腺苷三磷酸酶法,ATP 酶法,进行。 2.4 数据采集与统计 采用 image-Pro Plus 6.0,Media Cybernetics,图象分析系统对各型肌纤维的细胞数进行定量分析。对各组动物的每一比目鱼肌组织各随机抽取1 张接近肌腹中部的切片～每张切片在20 倍光镜随机观察3 个视野～测定每个视野内各型肌纤维数～并计算各型肌纤 维的构成比～求出每组动物的均值～使用spss13.0 软件对实验数据进行统计学分析～所有实验数据均以平均数差,meanSE)表示～各组间的差异采用单因素方差分析(显著性水平取P0.05。 3.研究结果 3.1 比目鱼肌湿重体重比 如所示～各组取出比目鱼肌称量其湿重～所得数据以100 g 体重标化～作为比目鱼肌湿重体重比。 实验测得大鼠比目鱼肌平均湿重体重比各组间比较:对照组湿重体重比,0.05290.0089,最高。振动组为0.04790.0088～自然恢复组为0.04600.0096。上述两组与对照组相比～无显著性差异,P0.05,。上述两组与悬吊组,0.03260.0027,相比显著增加,P0.05,。 3.2 各组大鼠比目鱼肌?、?型纤维构成比例 分别统计各组大鼠比目鱼肌的?、?型肌纤维数和纤维构成百分比进行对比。根据采用image-Pro Plus 6.0,Media Cybernetics,图象分析系统对各型肌纤维的细胞数进行定量分析～切片照片举例如下:根据测定每个视野内各型肌纤维数～并计算各型肌纤维的构成比～计算出每组动物的均值～各组比目鱼肌肌纤维类型百分比例比较见。 如表 2所示～各组大鼠比目鱼肌?型肌纤维所占百分比从小到大依次为:悬吊组、自然恢复组、对照组、振动组。?型肌纤维比例顺序则相反。与其他各组对比～悬吊组大鼠比目鱼肌?型肌纤维所占比例减少为67.50%～?型肌纤维所占比例增加为32.5%～有非常显著性意义,P0.01,。说明悬吊形成的废用状态导致了肌纤维类型的由 ?型向?型方向转换。 振动组,?型89.73%、?型10.27%,、对照组,?型89.27%、?型10.73%,、自然恢复组,?型86.89%、?型13.11%,各组之间相比无显著性差异,P0.05,。表明本废用性肌萎缩模型经过振动刺激～?型和?型肌纤维之间的关系得到了恢复。 3.3 各组大鼠比目鱼肌?型肌纤维类型的变化 前述实验结果可见～相对于对照组～悬吊后各组大鼠比目鱼肌的?、?型肌纤维均发生了不同程度的转化。因此本实验进而分别统计各组大鼠比目鱼肌的?型肌纤维的亚型分类。 可见～振动组和悬吊组的?a 型肌纤维类型比例降低～?b 型肌纤维类型比例明显升高～与对照组和自然恢复组相比有非常显著性意义,P0.01,。振动组中?型纤维的比例没有下降～而?a 比例下降～说明振动刺激可能对抗了?型纤维向?a 型纤维的转化。 3.4 各组大鼠比目鱼肌平均横截面积,CSA, 在 pH=9(4 的条件下 ATP 酶含量较少的?型肌纤维mATP 酶染色呈阴性(而富含ATP酶的?型肌纤维则呈强阳性～染色为深蓝色。可以用以计数肌纤维的平均横截面积。 各组大鼠比目鱼肌?型肌纤维平均横截面积从小到大依次为:悬吊组、振动组、自然恢复组、对照组。?型肌纤维平均横截面积顺序从小到大为:振动组、悬吊组、对照组、自然恢复组。其中～对照组、自然恢复组与悬吊组、振动组的?、?型肌纤维平均横截面积相比均有显著性意义,P0.05,。悬吊组与振动组组间差别无显著性意义 ,P0.05,。 提示废用性肌萎缩时比目鱼肌?型、?型肌纤维均发生了平均横截面积的减少～而振动刺激对?型肌纤维的变化有一定的影响～但是结果没有显著性意义,P0.05,。 4. 讨论和分析 废用状态下骨骼肌结构形态最直接的变化是肌肉萎缩～表现为肌肉重量和体积减少～且抗重力肌比非抗重力肌萎缩程度大～慢缩肌比快缩肌萎缩严重～且以骨骼肌湿重的改变最为显著～其下降幅度与废用时间及肌肉类型等密切相关,肌纤维直径,以平均横截面积计算,缩小,肌纤维类型也发生改变～表现为慢缩肌纤维,?型肌纤维,数量减少而快缩肌纤维,?型肌纤维,数量增加～但总的肌纤维数量不变～发生了?型肌纤维向?型肌纤维方向的转化,骨骼肌梭外肌纤维mATPase 活性明显升高～骨骼肌的显微结构与超微结构也发生了明显的变化。除上述指标外～还有神经-肌肉接点功能及电生理指标等的变化。 本研究通过参考陈杰[9]的后肢悬吊模式建立去负荷状态的失重废用性肌萎缩模型。以40只雌性SD 大鼠为实验研究对象～分别在恢复期前后设立对照组和实验组～重点研究在悬吊结束后恢复期振动训练对废用性肌萎缩的干预效果。 4.1 悬吊后振动刺激对肌肉湿重的影响 通过 14 天的尾部悬吊～大鼠比目鱼肌湿重表现应为减少。但是由于有大鼠自身生长发育的因素～对比悬吊后各组的体重并不能直 接提示肌肉本身湿重的变化。因此～本研究中对大鼠比目鱼肌以100g 体重进行了湿重的标化～比较各组的湿重体重比～这样可以排除因进食、生活等不可预测原因导致的体重变化对湿重的影响。本研究中设计在相同饲养条件下～以一组大鼠作悬吊组对照提供比目鱼肌的湿重值作为基准值。其他几组在解除悬吊后4 周的恢复期间～分别施加振动刺激的干预和自然恢复的手段～根据各组之间的差异性比较～进行相关数据的对比分析。 本研究所使用的废用性肌萎缩模型目前已经广泛应用于航天医学的失重肌萎缩研究、临床医学的去负荷状态以及废用性肌萎缩研究等～是一种公认的比较成熟可靠的建模方法。 本研究结果表明～解除悬吊后的恢复过程中～各组的湿重体重比均较悬吊对照组有明显增长～有显著性差异,P0.05,。其中振动组比悬吊组增长了50.16%,自然恢复组比悬吊组增长了44.2%。而全程空白对照组和悬吊组相比增长的比例最多～为65.83%。振动干预组、自然恢复组和空白对照组之间相比较无显著性差异,P0.05,。据此可以看出～悬吊使大鼠的比目鱼肌的湿重明显减少～可以说明肌萎缩模型的建构成功,而振动刺激使湿重体重比得到恢复～虽没有恢复到空白对照组的水平～但是可以看到最接近的是振动组～高于悬吊后自然恢复组。可以推测出使振动刺激使大鼠的肌萎缩得到了恢复。有资料表明[10,11,12]～振动训练对于肌肉力量和形态的增长有显著的效果～因此我们在实验预期中预测振动刺激训练对抗肌萎缩有明显的作用～这在本实验的结果中得到了验证。究其原因～振动波引起了肌梭 的兴奋～反射性地引起比目鱼肌的收缩～使肌张力增强～产生对抗肌萎缩的作用。但是～不同频率的振动波的作用有所不同。Falempin[13]曾用高频正弦波振动大鼠跟腱的方法有效地对抗了悬吊14 d 大鼠的比目鱼肌萎缩。刑国刚[14]研究结果是高频正弦波振动可以对制动引起的废用性肌萎缩产生对抗作用～能够抑制制动大鼠比目鱼肌湿重体重比的减少。而魏安奎[15] 等的实验研究表明～低频,15Hz,和中频,25Hz,的振动刺激能够使肌萎缩大鼠的最大力量增加～而高频,35Hz,组则力量增加不明显。这也提示了频率在15—25 Hz 之间的振动刺激对肌肉萎缩的干预效果较好～这和本研究所测得湿重的结果变化比较吻合。 4.2 悬吊后振动刺激对肌纤维类型的影响 文献报道比目鱼肌是以?型肌纤维构成为主的慢肌～正常雌性SD 大鼠比目鱼肌的?型肌纤维其构成占84~85,[16,17]。从本实验悬吊组的结果来看～尾部悬吊14 天后～悬吊组大鼠比目鱼肌?型肌纤维所占比例减少为67.50%～?型肌纤维所占比例增加为32.5%～且与其他组相比有显著性差异,P0.05,。经悬吊后大鼠比目鱼肌?型肌纤维的构成比明显下降～?型肌纤维的构成比明显增加～这可能与悬吊引起废用状态所致肌肉萎缩密切相关。这与国内外研究结果一致[8, 14 ,15,18,]:即废用性肌萎缩状态下～肌纤维类型发生改变～表现为慢缩肌纤维,?型肌纤维,数量减少而快缩肌纤维,?型肌纤维,数量增加～但总的肌纤维数量不变～发生了?型肌纤维向?型肌纤维方向的转化,骨骼肌梭外肌纤维mAT 酶活性也明显升高～骨骼肌的 显微结构与超微结构也发生了明显的变化[10,19,20]。本研究结果说明～尾部悬吊14 天后～梭内肌纤维的mATP 酶染色特性也发生了改变～各纤维mATP 酶活性均有增加～表明梭内肌纤维的代谢特点也发生了明显的改变。各组的梭外肌纤维构成比与悬吊对照组有显著性差异～提示振动刺激对废用性肌肉萎缩有对抗作用。 本研究在成功建立废用肌萎缩模型后给予振动刺激～振动刺激组,?型89.73%、?型10.27%,、自然恢复组,?型86.89%、?型13.11%,与对照组,?型89.27%、?型10.73%,之间相比无显著性差异,P0.05,。表明振动刺激对抗废用性肌萎缩时比目鱼肌肌纤维由?型向?型转化的效果比较显著。即本研究实验中采用的20Hz 低频段振动刺激可以发挥对抗肌萎缩的作用。杨威[21]、任俊婵[22]等人的研究说明～频率100Hz 的高频正弦波振动刺激也能够对抗因为悬吊引起的比目鱼肌体重湿重比减少和横截面积的减小～还能够有效地对抗?型肌纤维向?型肌纤维的转化。而魏安奎[15]等的研究说明～低频(15 Hz) 和中频(25 Hz) 振动训练使?a 型肌纤维百分比显著增加～而高频(35 Hz) 振动训练组大鼠不同类型肌纤维百分比无明显变化。该研究结果突出了低频和中频的效果。可见～这些研究结果略显矛盾～提示对于振动刺激最佳频率的选择还有待于进一步探索。另外～肌纤维类型的转化一般遵循着?型?a 型?x 型?b 型的规律进行[16]。本实验结果显示悬吊造成的废用性肌萎缩～导致?型肌纤维向?型肌纤维进行了明显的转化。悬吊组的?b 型肌纤维类型比例明显升高～与对照组相比有非常显著性意义,P0.01,。提示悬吊组的?b 型 纤维成分是由?型纤维转化而来。经过振动刺激干预～振动组中～?、?型的比例得到了恢复～而?a 型比例下降～说明低频,20Hz,振动刺激可能对抗了部分?型纤维向?a 型纤维的转化。 4.3 悬吊后振动刺激对肌纤维平均横截面积,CSA,的影响 废用状态下骨骼肌结构形态最直接的变化是肌肉萎缩～表现为肌肉重量和体积减少～还包括肌纤维直径,以平均横截面积计算,的缩小,且抗重力肌比非抗重力肌萎缩程度大～慢缩肌比快缩肌萎缩严重。因此悬吊后肌肉纤维中?型肌纤维和?型肌纤维平均横截面积均应减少。 本次实验结果中～悬吊组的?型肌纤维平均横截面积为各组最低～与对照组有显著性意义。表明经过悬吊引起的废用状态下～肌纤维发生了明显萎缩～而且慢缩肌表现更为突出。 振动组对?型肌纤维平均横截面积的作用结果略高于悬吊组～说明振动刺激对?型肌纤维的变化虽有一定的影响～但是结果没有显著性意义,P0.05,。20Hz 振动刺激对?型肌纤维平均横截面积的影响效果不明显～可能是由于大鼠对20Hz 的振动刺激反应不佳。魏安奎[15] 等的研究说明～15Hz 的振动刺激使大鼠各型肌纤维横截面积均有所增加～但无统计学意义。 25Hz 的振动刺激使各型肌纤维横截面积的增加有显著性意义。本实验结果并未显示出振动刺激对肌萎缩时肌纤维横截面积产生了最佳的干预效果～这也说明了现有的研究结果有一些矛盾的地方～ 可能与振动刺激的最佳频率选择、振动持续时间、干预周期等设置有密切关系。 希望提请其他科研人员注意。 大多数动物实验研究表明慢缩肌纤维较快缩肌纤维在制动状态的萎缩程度大～由此对于动物而言～振动刺激对?型肌纤维平均横截面积的作用结果较强。而在人类最先受累的是快缩肌纤维～因此～我们推测振动刺激作用于人类快缩肌纤维对肌萎缩的康复具有更重要意义。 4.4 振动刺激对废用性肌萎缩作用机制探讨 国内外学者们在废用性肌萎缩的防治措施方面进行了有益的探索～提出许多有意义的举措～主要涉及人工重力、慢性低频电刺激、运动锻炼、肌肉生长因子以及激素类药物等几方面[14,17]～这些方法虽都有一定的疗效～但在实际应用中～又各自存在着一定的缺点和局限性。 从防治废用性肌萎缩的手段方法和效果来分析～上述方法大都是从梭外肌角度着手～极少考虑到梭内肌在废用性肌萎缩的发生、发展和康复中的始发作用。从理论上分析～如果直接从肌梭作为拮抗废用性肌萎缩的切入点～可能会有较好的治疗效果。 肌梭是骨骼肌内感受肌肉长度和速度变化的一种重要感受器～它是产生和维持肌紧张反射孤中的感受器部分～梭外肌则是这一反射弧的效应器部分。由于肌梭与梭外肌呈并联关系～所以当肌肉处于缩短位时～肌梭受到的牵拉刺激降低～传入放电减少。相反～当肌肉处 于伸长位时～则肌梭受到的牵拉刺激增加～传入放电增多[23]。有资料表明[27,28,29]～骨骼肌在伸长位制动下可减轻肌肉萎缩的程度～而在缩短位制动下则肌肉萎缩的程度明显增加,间歇性牵拉、电刺激或叩打刺激均有对抗或减轻肌肉萎缩的作用。大鼠吊尾7 天后～其比目鱼肌肌梭的传入放电明显减少～同时与肌梭传入冲动有关的中枢部位,脊髓、延髓的薄束核等有关区域,也出现明显的形态学改变。可见～肌肉废用～使肌梭的敏感性下降～传入冲动减少～后者可反射性地引起有关中枢部位的改变。因此～肌梭的改变在废用性肌肉萎缩的发生中可能起着重要的作用。 本研究中发现振动刺激能够有效地纠正肌萎缩所造成的湿重降低、肌纤维类型转化等现象。振动刺激作为一种外在的刺激～能刺激肌肉的本体感受器～特别是初级肌梭? 传入纤维末梢的兴奋性～反射性地引起梭外肌纤维产生收缩。由于振动刺激频率使神经发放冲动的频率加快和强度增大、皮肤感觉传入冲动以及振动对耳前庭机械感受器和神经中枢机制等综合因素的影响～在运动过程中高阈值的运动单位与低阈值的运动单位几乎同时激活。同时通过振动刺激的扩散～募集更多的运动单位参与运动～可以更好地改善肌肉的协调性。有学者认为可以同时起到锻炼主动肌和拮抗肌的作用。 废用性肌萎缩发生于运动减退、制动、失重状态下～是肌肉维持一段时间的去负荷状态引起的病理现象。尾部悬吊模型造成局部缺乏重力刺激～肌肉去负荷而出现废用状态。该模型肌肉紧张度下降,肌肉蛋白质合成率下降和分解率增加,肌内微脉管系统发生变化,同 时肌肉神经突触接头处的抑制使神经冲动减少～肌肉因此缺乏神经营养物质的刺激。这些相应地引起了骨骼肌湿重减少～肌肉平均横截面积缩小和慢缩肌纤维类型向快缩肌纤维的转化。 振动刺激通过刺激肌梭中的梭内肌纤维和梭外肌纤维～产生的运动单位募集～促使肌肉肌张力增加、神经冲动增强～加强了肌纤维的营养～促进蛋白质合成代谢增加～造成肌肉肥大而干预肌萎缩的进程～使肌肉重量得到恢复～其肌纤维类型也由?型向?型发生了转化。 另外～振动刺激引起血清睾酮和生长激素的浓度提高～而睾酮和生长激素能够促进肌肉蛋白质的合成代谢、提高肌肉体积和肌肉力量。这可能也是振动刺激能够有效对抗肌萎缩的原因之一。Atrogin-1 和MuRF1,肌肉特异性泛素-蛋白连接酶,、胰岛素样生长因子?,IGF-?,、肌肉生长抑制素、MyoD 和Myf-5,生肌调节因子,等也可能发生相关的变化。 振动刺激的训练效果受各种条件的影响较大～和振动刺激的频率、振幅、振动负荷大小、间隔休息时间以及不同的练习形式有关。本实验使用了20Hz 频率的振动刺激进行干预～实验结果和国内外文献比较～可以看出频率不同的刺激具有一定程度的差别～其中的机制还需要深入研究。大鼠的运动中间增加了休息时间～以利于肌肉休息和恢复。大鼠运动时尽量保持直立～利用体重作为增加的负荷～可以有效地加大对下肢的刺激。其他一些影响因素的作用～还有待于进一步探讨。 振动刺激是一种新的力量训练方法～对肌肉力量和做功能力的 提高有急性和长期训练作用。能够达到肌群之间平衡协调发展～克服了传统力量训练不能同时训练主动肌和拮抗肌的缺点～避免屈伸肌群不均衡发展造成肌肉拉伤～可以用在运动员伤后的康复训练上～使受伤的运动员能够早日重返赛场进行正常训练和比赛。因此～我们认为振动训练对废用性肌萎缩的康复训练～具有一定的应用价值。以后的研究可以从确定振动刺激的频率、振幅、运动时间和方式等具体条件方面来提供实验依据～完善振动训练的研究。 5. 小结 振动刺激能够有效对抗悬吊引起的大鼠比目鱼肌废用性肌萎缩。振动刺激可以促进其湿重的恢复、能够有效对抗其肌纤维类型由?型向?型的转化～以及能够促进其?型肌纤维平均横截面积的增加。中国硕士论文网提供大量免费硕士毕业论文,如有业务需求请咨询网站客服人员: