生物化学（第三版）课后习题详细解答

生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 1 生 生物 物化 化学 学（ （第 第三 三版 版） ）课 课后 后习 习题 题 详 详细 细解 解答 答 第三章 氨基酸 提要  α­氨基酸是蛋白质的构件分子，当用酸、碱或蛋白酶水解蛋白质时可获得它们。蛋白质中的氨基 酸都是 L型的。但碱水解得到的氨基酸是 D型和 L型的消旋混合物。 参与蛋白质组成的基本氨基酸只有 20种。此外还有若干种氨基酸在某些蛋白质中存在，但它们都 是在蛋白质生物合成后由相应是基本氨基酸（残基）经化学修饰而成。除参与蛋白质组成的氨基酸外， 还有很多种其他氨基酸存在与各种组织和细胞中，有的是 β­、γ­或 δ­氨基酸，有些是 D型氨基酸。 氨基酸是两性电解质。当 pH 接近 1 时，氨基酸的可解离基团全部质子化，当 pH 在 13 左右时， 则全部去质子化。 在这中间的某一pH （因不同氨基酸而异）， 氨基酸以等电的兼性离子 （H3N + CHRCOO ­ ） 状态存在。某一氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的介质 pH 称为该氨基酸的等电点，用 pI 表 示。 所有的 α­氨基酸都能与茚三酮发生颜色反应。α­NH2 与 2,4­二硝基氟苯（DNFB）作用产生相应的  DNP­氨基酸（Sanger反应）；α­NH2 与苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相应氨基酸的苯胺基硫甲酰衍 生物（  Edman 反应）。胱氨酸中的二硫键可用氧化剂（如过甲酸）或还原剂（如巯基乙醇）断裂。半 胱氨酸的 SH基在空气中氧化则成二硫键。这几个反应在氨基酸荷蛋白质化学中占有重要地位。 除甘氨酸外 α­氨基酸的 α­碳是一个手性碳原子，因此 α­氨基酸具有光学活性。比旋是 α­氨基酸的 物理常数之一，它是鉴别各种氨基酸的一种根据。 参与蛋白质组成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量 蛋白质的依据。核磁共振（NMR）波谱技术在氨基酸和蛋白质的化学表征方面起重要作用。 氨基酸分析分离方法主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。常用方法有离子交换柱层析、高 效液相层析（HPLC）等。 习题  1.写出下列氨基酸的单字母和三字母的缩写符号：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸。[见表 3­1]  表 3­1  氨基酸的简写符号 名称 三字母符 号 单字母 符号 名称 三字 母符 号 单字母 符号 丙氨酸(alanine)  Ala  A  亮氨酸(leucine)  Leu  L  精氨酸(arginine)  Arg  R  赖氨酸(lysine)  Lys  K  天冬酰氨(asparagines)  Asn  N  甲硫氨酸(蛋氨酸)(methionine)  Met  M  天冬氨酸(aspartic acid)  Asp  D  苯丙氨酸(phenylalanine)  Phe  F  Asn和/或 Asp  Asx  B  半胱氨酸(cysteine)  Cys  C  脯氨酸(praline)  Pro  P  谷氨酰氨(glutamine)  Gln  Q  丝氨酸(serine)  Ser  S  谷氨酸(glutamic acid)  Glu  E  苏氨酸(threonine)  Thr  T  Gln和/或 Glu  Gls  Z  甘氨酸(glycine)  Gly  G  色氨酸(tryptophan)  Trp  W 生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 2  组氨酸(histidine)  His  H  酪氨酸(tyrosine)  Tyr  Y  异亮氨酸(isoleucine)  Ile  I  缬氨酸(valine)  Val  V  2、计算赖氨酸的 εα­NH3 + 20%被解离时的溶液 PH。[9.9]  解：pH = pKa + lg20%        pKa = 10.53 (见表 3­3，P133)  pH = 10.53 + lg20% = 9.83  3、计算谷氨酸的 γ­COOH三分之二被解离时的溶液 pH。[4.6]  解：pH = pKa + lg2/3%        pKa = 4.25  pH = 4.25 + 0.176 = 4.426  4、 计算下列物质 0.3mol/L 溶液的 pH： (a)亮氨酸盐酸盐； (b)亮氨酸钠盐； (c)等电亮氨酸。 [(a)约 1.46,(b)  约 11.5, (c)约 6.05]  5、根据表 3­3 中氨基酸的 pKa 值，计算下列氨基酸的 pI 值：丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和精氨酸。  [pI:6.02;5.02;3.22;10.76]  解：pI = 1/2（pKa1+ pKa2）  pI(Ala) = 1/2（2.34+9.69）= 6.02  pI(Cys) = 1/2（1.71+10.78）= 5.02  pI(Glu) = 1/2（2.19+4.25）= 3.22  pI(Ala) = 1/2（9.04+12.48）= 10.76  6、 向 1L1mol/L的处于等电点的甘氨酸溶液加入0.3molHCl， 问所得溶液的pH是多少？如果加入 0.3mol  NaOH以代替 HCl时，pH将是多少？[pH：2.71；9.23]  7、将丙氨酸溶液（400ml）调节到  pH8.0，然后向该溶液中加入过量的甲醛，当所得溶液用碱反滴定 至 Ph8.0 时，消耗 0.2mol/L NaOH溶液 250ml。问起始溶液中丙氨酸的含量为多少克？[4.45g]  8、计算  0.25mol/L 的组氨酸溶液在 pH6.4 时各种离子形式的浓度（mol/L）。[His 2+ 为  1.78×10 ­4 ，His +  为 0.071，His 0 为 2.8×10 ­4 ]  9、用含一个结晶水的固体组氨酸盐酸盐（相对分子质量=209.6；咪唑基 pKa=6.0）和 1mol/L KOH  配制 1LpH6.5的 0.2mol/L 组氨酸盐缓冲液的方法[取组氨酸盐酸盐 41.92g(0.2mol)，加入 352ml 1mol/L  KOH，用水稀释至 1L]  10、为什么氨基酸的茚三酮反映液能用测压法定量氨基酸？ 解：茚三酮在弱酸性溶液中与 α­氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨脱羧反映，（其反应化学式见 P139）， 其中，定量释放的 CO2 可用测压法测量，从而计算出参加反应的氨基酸量。  11、L­亮氨酸溶液（3.0g/50ml  6mol/L  HCl）在 20cm旋光管中测得的旋光度为+1.81º。计算 L­亮氨酸 在 6mol/L HCl中的比旋（[a]）。[[a]=+15.1º]  12、标出异亮氨酸的 4个光学异构体的（R，S）构型名称。[参考图 3­15]  13、甘氨酸在溶剂 A中的溶解度为在溶剂 B 中的 4倍，苯丙氨酸在溶剂 A中的溶解度为溶剂 B 中的两 倍。利用在溶剂  A 和  B  之间的逆流分溶方法将甘氨酸和苯丙氨酸分开。在起始溶液中甘氨酸含量为  100mg  ，苯丙氨酸为 81mg ，试回答下列问题：(1)利用由 4个分溶管组成的逆流分溶系统时，甘氨酸 生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 3  和苯丙氨酸各在哪一号分溶管中含量最高？（2）在这样的管中每种氨基酸各为多少毫克？[（1）第  4  管和第 3管；（2）51.2mg Gly+24mg Phe 和 38.4mgGly+36mg Phe]  解：根据逆流分溶原理，可得： 对于 Gly：Kd = CA/CB = 4 = q(动相)/p（静相）  p+q = 1 = (1/5 + 4/5)  4个分溶管分溶 3次：（1/5 + 4/5） 3 =1/125+2/125+48/125+64/125  对于 Phe：Kd = CA/CB = 2 = q(动相)/p（静相）  p+q = 1 = (1/3 + 2/3)  4个分溶管分溶 3次：（1/3 + 2/3） 3 =1/27+6/27+12/27+8/27  故利用 4个分溶管组成的分溶系统中，甘氨酸和苯丙氨酸各在 4管和第 3管中含量最高，其中： 第 4管：Gly：64/125×100=51.2 mg      Phe：8/27×81=24 mg  第 3管：Gly：48/125×100=38.4 mg      Phe：12/27×81=36 mg  14、指出在正丁醇：醋酸：水的系统中进行纸层析时，下列混合物中氨基酸的相对迁移率（假定水相 的 pH为 4.5）：(1)Ile,    Lys; (2)Phe, Ser (3)Ala, Val, Leu; (4)Pro, Val    (5)Glu, Asp; (6)Tyr, Ala, Ser, His.  [Ile> lys；Phe,> Ser；Leu> Val > Ala,；Val >Pro；Glu>Asp；Tyr> Ala>Ser His] ≌ 解：根据 P151 图 3­25可得结果。  15．将含有天冬氨酸(pI=2.98)、甘氨酸(pI=5.97)、亮氨酸(pI=6.53)和赖氨酸(pI=5.98)的柠檬酸缓冲液， 加到预先同样缓冲液平衡过的强阳离交换树脂中，随后用爱缓冲液析脱此柱，并分别收集洗出液，这 5  种氨基酸将按什么次序洗脱下来？[Asp, Thr, Gly, Leu, Lys]  解：在  pH3 左右，氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电吸引的大小次序是减刑氨基酸(A 2+ )>中性氨基 酸( A+ )>酸性氨基酸(A 0 )。 因此氨基酸的洗出顺序大体上是酸性氨基酸、 中性氨基酸， 最后是碱性氨基酸， 由于氨基酸和树脂之间还存在疏水相互作用，所以其洗脱顺序为：Asp, Thr, Gly, Leu, Lys。 生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 4  第四章 蛋白质的共价结构 提要 蛋白质分子是由一条或多条肽链构成的生物大分子。多肽链是由氨基酸通过肽键共价连接而成的， 各种多肽链都有自己特定的氨基酸序列。蛋白质的相对分子质量介于 6000到 1000000或更高。 蛋白质分为两大类：单纯蛋白质和缀合蛋白质。根据分子形状可分为纤维状蛋白质、球状蛋白质 和膜蛋白质。此外还可按蛋白质的生物学功能分类。 为了表示蛋白质结构的不同组织层次，经常使用一级结构、二级结构、三级结构和四级结构这样 一些专门术语。一级结构就是共价主链的氨基酸序列，有时也称化学结构。二、三和四级结构又称空 间结构（即三维结构）或高级结构。 蛋白质的生物功能决定于它的高级结构，高级结构是由一级结构即氨基酸序列决定的，二氨基酸 序列是由遗传物质 DNA的核苷酸序列规定的。 肽键（CO—NH）是连接多肽链主链中氨基酸残缺的共价键，二硫键是使多肽链之间交联或使多 肽链成环的共价键。 多肽链或蛋白质当发生部分水解时，可形成长短不一的肽段。除部分水解可以产生小肽之外，生 物界还存在许多游离的小肽，如谷胱甘肽等。小肽晶体的熔点都很高，这说明短肽的晶体是离子晶格、 在水溶液中也是以偶极离子存在的。 测定蛋白质一级结构的策略是：（1）测定蛋白质分子中多肽链数目；（2）拆分蛋白质分子的多肽 链；（3）断开多肽链内的二硫桥；（4）分析每一多肽链的氨基酸组成；（5）鉴定多肽链的 N­末端和 C­  末端残基；（6）断裂多肽链成较小的肽段，并将它们分离开来；（7）测定各肽段的氨基酸序列；（8） 利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构；（9）确定半胱氨酸残基形成的 S­S交联桥的位置。 序列分析中的重要方法和技术有：测定  N­末端基的苯异硫氰酸酯（PITC）法，分析  C­末端基的 羧肽酶法，用于多肽链局部断裂的酶裂解和  CNBr 化学裂解，断裂二硫桥的巯基乙醇处理，测定肽段 氨基酸序列的 Edman化学降解和电喷射串联质谱技术，重建多肽链一级序列的重叠肽拼凑法以及用于 二硫桥定位的对角线电泳等。 在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质。同源蛋白质具有明显的序列相似性  (称序列同源),两个物种的同源蛋白质，其序列间的氨基酸差异数目与这些物种间的系统发生差异是成 比例的。并根据同源蛋白质的氨基酸序列资料建立起进化树。同源蛋白质具有共同的进化起源。 在生物体内有些蛋白质常以前体形试合成，只有按一定方式裂解除去部分肽链之后才出现生物活 性，这一现象称蛋白质的激活。血液凝固是涉及氨基酸序列断裂的一系列酶原被激活的结果，酶促激 活的级联放大，使血凝块迅速形成成为可能。凝血酶原和血清蛋白原是两个最重要的血凝因子。血纤 蛋白蛋白原在凝血酶的作用下转变为血清蛋白凝块（血块的主要成分）。 我国在  20 世纪  60 年代首次在世界上人工合成了蛋白质——结晶牛胰岛素。近二、三十年发展起 来的固相肽合成是控制合成技术上的一个巨大进步，它对分子生物学和基因也就具有重要影响和 意义。至今利用 Merrifield 固相肽合成仪已成功地合成了许多肽和蛋白质。 习题  1.如果一个相对分子质量为 12000 的蛋白质，含 10 种氨基酸，并假设每种氨基酸在该蛋白质分子中的 数目相等，问这种蛋白质有多少种可能的排列顺序？[10 100 ]  解：10 12000/120 =10 100  2、有一个 A 肽，经酸解分析得知为 Lys、His、Asp、Glu2、Ala 以及 Val、Tyr 忽然两个 NH3 分子组 成。当 A肽与 FDNB 试剂反应后得 DNP­Asp；当用羧肽酶处理后得游离缬氨酸。如果我们在实验中将  A肽用胰蛋白酶降解时，得到两种肽，其中一种（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在 pH6.4时，净电荷为 零，另一种（His、Glu 以及 Val）可给除 DNP­His，在 pH6.4 时，带正电荷。此外，A 肽用糜蛋白酶 降解时，也得到两种肽，其中一种（Asp、Ala、Tyr）在  pH6.4 时全中性，另一种（Lys、His、Glu2  以及 Val）在 pH6.4时带正电荷。问 A肽的氨基酸序列如何？[Asn­Ala­Tyr­Glu­Lys­His­Gln­Val] 生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 5  解：1、N­末端分析：FDNB 法得：Asp­；  2、C­末端分析：羧肽酶法得：­Val；  3、胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基形成的肽键，得到的是以 Arg 和 Lys 为 C­末端残 基的肽断。酸水解使  Asn→Asp+  NH4 + ，由已知条件（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）可得：  Asn­(    )­(    )­(    )­Lys­(    )­(    )­Val；  4、FDNB 法分析 N­末端得 DNP­His，酸水解使 Gln→Glu+NH4 + 由已知条件（His、Glu、Val）可 得：Asn­(    )­(    )­(    )­Lys­His­Gln­Val；  5、糜蛋白酶断裂 Phe、Trp和 Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键。由题，得到的一条肽（Asp、  Ala、Tyr）结合（3）、（4）可得该肽的氨基酸序列为：Asn­Ala­Tyr­Glu­Lys­His­Gln­Val  3 、 某 多 肽 的 氨 基 酸 序 列 如 下 ： Glu­Val­Lys­Asn­Cys­Phe­Arg­Trp­Asp­Leu­Gly­Ser­Leu­Glu­  Ala­Thr­Cys­Arg­His­Met­Asp­Gln­Cys­Tyr­Pro­Gly­Glu_Glu­Lys。（1）如用胰蛋白酶处理，此多肽将 产生几个肽？并解释原因（假设没有二硫键存在）；（2）在 pH7.5时，此多肽的净电荷是多少单位？说 明理由（假设 pKa值：α­COOH4.0；α­ NH3 + 6.0；Glu和 Asp 侧链基 4.0；Lys和 Arg侧链基 11.0；His  侧链基 7.5；Cys 侧链基 9.0；Tyr 侧链基 11.0）；（3）如何判断此多肽是否含有二硫键？假如有二硫键 存在，请设计实验确定 5，17 和 23 位上的 Cys 哪两个参与形成？[（1）4 个肽；（2）­2.5 单位；（3） 如果多肽中无二硫键存在，经胰蛋白酶水解后应得 4 个肽段；如果存在一个二硫键应得 3 个肽段并且 个肽段所带电荷不同，因此可用离子交换层析、电泳等方法将肽段分开，鉴定出含二硫键的肽段，测 定其氨基酸顺序，便可确定二硫键的位置]  4、今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和 Ser。此肽未经糜蛋 白酶处理时，与 FDNB 反应不产生 α­DNP­氨基酸。经糜蛋白酶作用后，此肽断裂城两个肽段，其氨基 酸组成分别为 Ala、Tyr、Ser和 Pro、Phe、Lys、Arg。这两个肽段分别与 FDNB 反应，可分别产生  DNP­Ser和 DNP­Lys。此肽与胰蛋白酶反应能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是 Arg、Pro和  Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。试问此七肽的一级结构怎样？[它是一个环肽，序列为：  ­Phe­Ser­Ala­Tyr­Lys­Pro­Arg­]  解：（1）此肽未经糜蛋白酶处理时，与 FDNB 反应不产生 α­DNP­氨基酸，说明此肽不含游离末端 NH2， 即此肽为一环肽； （2）糜蛋白酶断裂 Phe、Trp和 Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键，由已知两肽段氨基酸组成 （Ala、Tyr、Ser和 Pro、Phe、Lys、Arg）可得：­(    )­(    )­Tyr­和­(    )­(    )­(    )­Phe­； （3）由（2）得的两肽段分别与 FDNB 反应，分别产生 DNP­Ser和 DNP­Lys可知该两肽段的 N­  末端分别为­Ser­和­Lys­，结合（2）可得：­Ser­Ala­Tyr­和­Lys­(    )­(    )­Phe­； （4）胰蛋白酶专一断裂 Arg或 Lys残基的羧基参与形成的肽键，由题生成的两肽段氨基酸组成 （Arg、Pro和 Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala）可得：­Pro­Arg­和­(    )­(    )­(    )­(    )­Lys； 综合（2）、（3）、（4）可得此肽一级结构为：­Lys­Pro­Arg­Phe­Ser­Ala­Tyr­  5、 三肽 Lys­ Lys­ Lys的 pI值必定大于它的任何一个个别基团的 pKa值， 这种说法是否正确？为什么？  [正确，因为此三肽处于等电点时，七解离集团所处的状态是 C­末端 COO ­ （pKa=3.0），N末端 NH2  （pKa 8.0 ≌ ），3个侧链 3（1/3ε­ NH3 + ）（pKa=10.53）(pKa=10.53),因此 pI>最大的 pKa值（10.53）]  6、 一个多肽可还原为两个肽段， 它们的序列如下： 链 1 为 Ala­Cys­Phe­Pro­Lys­Arg­Trp­Cys­Arg­ Arg­  Val­Cys；链 2为 Cys­Tyr­Cys­Phe­Cys。当用嗜热菌蛋白酶消化原多肽（具有完整的二硫键）时可用下 列各肽：（1）（Ala、Cys2、Val）；（2）（Arg、Lys、Phe、Pro）；（3）(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)；（4）  (Cys2、Phe)。试指出在该天然多肽中二硫键的位置。（结构如下图）  S­S  Ala­Cys­Phe­Pro­Lys­Arg­Trp­Cys­Arg­Arg­Val_Cys 生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 6  S  S  Cys­Tyr­Cys­Phe­Cys  解：嗜热菌蛋白酶作用专一性较差，根据题中已知条件： （1）消化原多肽得到（Ala、Cys2、Val），说明链 1在 2位 Cys 后及 11位 Val前发生断裂，2位  Cys与 12位 Cys之间有二硫键； （2）由链 1序列可得该肽段序列为：­Phe­Pro­Lys­Arg­； （3）由（1）（2）可知该肽段(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)中必有一 Cys来自链 2，另一 Cys为链 1  中 8位 Cys，即链 1中 8位 Cys与链 2中的一个 Cys有二硫键； （4）嗜热菌蛋白酶能水解 Tyr、Phe 等疏水氨基酸残基，故此肽（Cys2、Phe）来自链 2，结合（3） 中含 Tyr，可知（3）中形成的二硫键为链 1 8位 Cys与链 2中 3位 Cys与链 2中 3位 Cys之间；（4） 中（Cys2、Phe）说明链 2中 1位 Cys与 5位 Cys中有二硫键。 综合（1）、（2）、（3）、（4）可得结果。  7、一个十肽的氨基酸分析表明其水解液中存在下列产物：  NH4  +  Asp        Glu          Tyr          Arg  Met          Pro          Lys          Ser          Phe  并观察下列事实：（1） 用羧肽酶 A和 B 处理该十肽无效；（2） 胰蛋白酶处理产生两各四肽和游离的 Lys； （3）梭菌蛋白酶处理产生一个四肽和一个六肽；（4）溴化氢处理产生一个八肽和一个二肽，用单字母 符号表示其序列位 NP；（5）胰凝乳蛋白酶处理产生两个三肽和一个四肽，N­末端的胰凝乳蛋白酶水解 肽段在中性 pH时携带­1净电荷，在 pH12时携带­3净电荷；（6）一轮 Edman降解给出下面的 PTH  衍生物：（图略）写出该十肽的氨基酸序列。[Ser­Glu­Tyr­Arg­Lys­Lys­Phe­Met­Asn­Pro]  解：（1）用羧肽酶 A和 B 处理十肽无效说明该十肽 C­末端残基为­Pro； （2）胰蛋白酶专一断裂 Lys或 Arg残基的羧基参与形成的肽键，该十肽在胰蛋白酶处理后产生了 两个四肽和有利的 Lys，说明十肽中含 Lys­…或­Arg­…­Lys­Lys­…或­Arg­Lys­…­Lys­…Arg­Lys­…四 种可能的肽段，且水解位置在 4与 5、5与 6或 4与 5、8与 9、9与 10之间； （3）梭菌蛋白酶专一裂解 Arg残基的羧基端肽键，处理该十肽后，产生一个四肽和一个六肽，则 可知该十肽第四位为­Arg­； （4）溴化氰只断裂由 Met残基的羧基参加形成的肽键，处理该十肽后产生一个八肽和一个二肽， 说明该十肽第八位或第二位为­Met­；用单示二肽为 NP，即­Asn­Pro­，故该十肽第八位为­Met­； （5）胰凝乳蛋白酶断裂 Phe、Trp和 Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键，处理该十肽后，产生两 个三肽和一个四肽，说明该十肽第三位、第六位或第七位为 Trp或 Phe； （6）一轮 Edman降解分析 N­末端，根据其反应规律，可得 N­末端氨基酸残疾结构式为：  ­NH­CH(­CH2OH)­C(=O)­，还原为­NH­CH(­CH2OH)­COOH­，可知此为 Ser； 结合（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）可知该十肽的氨基酸序列为：  Ser­Glu­Tyr­Arg­Lys­Lys­Phe­Met­Asn­Pro  8、一个四肽，经胰蛋白酶水解得两个片段，一个片段在 280nm附近有强的光吸收，并且 Pauly 反应和 坂口反应（检测胍基的）呈阳性。另一片段用溴化氰处理释放出一个与茚三酮反应呈黄色的氨基酸。 写出此四肽的氨基酸序列。[YRMP]  解：胰蛋白酶酶专一水解 Lys和 Arg残基的羧基参与形成的肽键，故该四肽中含 Lys或 Arg；一肽段 在 280nm附近有强光吸收且 Pauly 反应和坂口反应（检测胍基的）呈阳性，说明该肽段含 Tyr和 Arg； 溴化氰专一断裂 Met残基的羧基参加形成的肽键，又因生成了与茚三酮反应呈黄色的氨基酸，故该肽 生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 7  段为­Met­Pro­；所以该四肽的氨基酸组成为 Tyr­Arg­Met­Pro，即 YRMP。  9 蜂毒明肽（apamin）是存在蜜蜂毒液中的一个十八肽，其序列为 CNVRAPETALCARRCOOH，已 知蜂毒明肽形成二硫键，不与碘乙酸发生反应，（1）问此肽中存在多少个二硫键？（2）请设计确定这 些（个）二硫键位置的策略。  [（1）两个；（2）二硫键的位置可能是 1­3和 11­15或 1­11和 3­15或 1­15和 3­11，第一种情况，用胰 蛋白酶断裂将产生两个肽加 Arg；第二种情况和第三种，将产生一个肽加 Arg，通过二硫键部分氧化可 以把后两种情况区别开来。]  10、叙述用 Mernfield 固相化学方法合成二肽 Lys­Ala。如果你打算向 Lys­Ala加入一个亮氨酸残基使 成三肽，可能会掉进什么样的“陷坑”？ 第五章 蛋白质的三维结构 提要 每一种蛋白质至少都有一种构像在生理条件下是稳定的，并具有生物活性，这种构像称为蛋白质 生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 8  的天然构像。研究蛋白质构像的主要方法是 X射线晶体结构分析。此外紫外差光谱、荧光和荧光偏振、 圆二色性、核磁共振和重氢交换等被用于研究溶液中的蛋白质构像。 稳定蛋白质构像的作用有氢键、范德华力、疏水相互作用和离子键。此外二硫键在稳定某些蛋白 质的构像种也起重要作用。 多肽链折叠成特定的构像受到空间上的许多限制。就其主链而言，由于肽链是由多个相邻的肽平 面构成的，主链上只有 α­碳的二平面角 Φ 和 Ψ 能自由旋转，但也受到很大限制。某些 Φ 和 Ψ 值是立 体化学所允许的，其他值则不被允许。并因此提出了拉氏构像，它表明蛋白质主链构象在图上所占的 位置是很有限的（7.7%­20.3%）。 蛋白质主链的折叠形成由氢键维系的重复性结构称为二级结构。最常见的二级结构元件有 α螺旋、  β 转角等。α螺旋是蛋白质中最典型、含量最丰富的二级结构。α螺旋结构中每个肽平面上的羰氧和酰 氨氢都参与氢键的形成，因此这种构象是相当稳定的。氢键大体上与螺旋轴平行，每圈螺旋占 3.6个氨 基酸残基，每个残基绕轴旋转 100°，螺距为 0.54nm。α­角蛋白是毛、发、甲、蹄中的纤维状蛋白质， 它几乎完全由 α螺旋构成的多肽链构成。β折叠片中肽链主链处于较伸展的曲折（锯齿）形式，肽链之 间或一条肽链的肽段之间借助氢键彼此连接成片状结构，故称为 β 折叠片，每条肽链或肽段称为 β 折 叠股或  β 股。肽链的走向可以有平行和反平行两种形式。平行折叠片构象的伸展程度略小于反平行折 叠片，它们的重复周期分别为 0.65nm 和 0.70nm。大多数 β 折叠股和 β 折叠片都有右手扭曲的倾向， 以缓解侧链之间的空间应力（steric strain）。蚕丝心蛋白几乎完全由扭曲的反平行 β折叠片构成。胶原 蛋白是动物结缔组织中最丰富的结构蛋白，有若干原胶原分子组成。原胶原是一种右手超螺旋结构， 称三股螺旋。弹性蛋白是结缔组织中另一主要的结构蛋白质。 蛋白质按其外形和溶解度可分为纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白。α­角蛋白、丝心蛋白（β­  角蛋白）、 教员蛋白和弹性蛋白是不溶性纤维状蛋白质； 肌球蛋白和原肌球蛋白是可溶性纤维状蛋白质， 是肌纤维中最丰富的蛋白质。球状蛋白质是一类可溶性的功能蛋白，如酶、抗体、转运蛋白、蛋白质 激素等，膜蛋白是一类与膜结构和功能紧密相关的蛋白质，它们又可分为膜内在蛋白质、脂锚定蛋白 质以及膜周边蛋白质。 蛋白质结构一般被分为 4个组织层次（折叠层次），一级、二级、三级和四级结构。细分时可在二、 三级和四级结构。细分时可在二、三级之间增加超二级结构和结构域两个层次。超二级结构是指在一 级序列上相邻的二级结构在三维折叠中彼此靠近并相互作用形成的组合体。超二级结构有  3 中基本形 式：αα（螺旋束）、βαβ（如 Rossman折叠）、ββ（β曲折和希腊钥匙拓扑结构）。结构域是在二级结构 和超二级结构的基础上形成并相对独立的三级结构局部折叠区。结构域常常也就是功能域。结构域的 基本类型有：全平行 α 螺旋结构域、平行或混合型 β 折叠片结构域、反平行 β 折叠片结构域和富含金 属或二硫键结构域等 4类。 球状蛋白质可根据它们的结构分为全 α­结构蛋白质、α、β­结构蛋白质、全 β­结构蛋白质和富含金 属或二硫键蛋白质等。球状蛋白质有些是单亚基的，称单体蛋白质，有些是多亚基的，称寡聚或多聚 蛋白质。亚基一般是一条多胎链。亚基（包括单体蛋白质）的总三维结构称三级结构。球状蛋白质种 类很多，结构也很复杂，各有自己独特的三维结构。但球状蛋白质分子仍有某些共同的结构特征：① 一种分子可含多种二级结构元件，②具有明显的折叠层次，③紧密折叠成球状或椭球状结构，④疏水 测链埋藏在分子内部，亲水基团暴露在分子表面，⑤分子表面往往有一个空穴（活性部位）。 蛋白质受到某些物理或化学因素作用时，引起生物活性丢失，溶解度降低以及其他的物理化学常 数的改变，这种现象称为蛋白质变性。变性实质是非共价键破裂，天然构象解体，但共价键未遭破裂。 有些变性是可逆的。蛋白质变性和复性实验表明，一级结构规定它的三维结构。蛋白质的生物学功能 是蛋白质天然构象所具有的性质。天然构象是在生理条件下热力学上最稳定的即自由能最低的三维结 构。 蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最低构象的。折叠动力学研究表明，多肽链折叠过程中 存在熔球态的中间体，并有异构酶和伴侣蛋白质等参加。 寡聚蛋白是由两个或多个亚基通过非共价相互作用缔合而成的聚集体。缔合形成聚集体的方式构 成蛋白质的四级结构，它涉及亚级在聚集体中的空间排列（对称性）以及亚基之间的接触位点（结构 生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 9  互补）和作用力（非共价相互作用的类型）。 习题  1.（1）计算一个含有 78 个氨基酸的 α 螺旋的轴长。（2）此多肽的 α 螺旋完全伸展时多长？[11.7nm；  28.08nm]  解：（1）α螺旋中每个残基绕轴旋转 100°，沿轴上升 0.15nm，故该 α螺旋的轴长为：  78×0.15nm=11.7nm  (2) α螺旋每圈螺旋占 3.6个氨基酸残基， 故该 α螺旋圈数为： 78÷3.6圈； α螺旋的直径约为 0.5nm， 故每圈轴长为 0.5πnm。完全伸展的 α螺旋长度约为：0.5π×（78÷3.6）  34.01nm ≌ 。  2.某一蛋白质的多肽链除一些区段为 α螺旋构想外， 其他区段均为 β折叠片构象。该蛋白质相对分子质 量为 240000，多肽链外姓的长度为 5.06×10 ­5 cm。试计算：α 螺旋占该多肽链的百分数。（假设 β 折叠 构象中每氨基酸残疾的长度为 0.35nm）[59%]  解：一般来讲氨基酸的平均分子量为  120Da，此蛋白质的分子量为  240000Da，所以氨基酸残基数为  240000÷120=2000个。设有 X个氨基酸残基呈 α螺旋结构，则：  X∙0.15+（2000­X）×0.35=5.06×10 ­5 ×10 7 =506nm  解之得 X=970，α螺旋的长度为 970×0.15=145.5，故 α­螺旋占该蛋白质分子的百分比为：  145.5/536×100%=29%  3.虽然在真空中氢键键能约为  20kj/mol，但在折叠的蛋白质中它对蛋白质的桅顶焓贡献却要小得多 （<5kj/mol）。 试解释这种差别的原因。 [在伸展的蛋白质中大多数氢键的共体和接纳体都与水形成氢键。 折旧时氢键能量对稳定焓贡献小的原因。]  4.多聚甘氨酸是一个简单的多肽，能形成一个具有 φ=­80°ψ=+120°的螺旋，根据拉氏构象图（图 5­13）， 描述该螺旋的（a）手性；（b）每圈的碱基数。[（a）左手；（b）3.0]  解：据 P206图 5­13拉氏构象图，  =φ­80°ψ=+120°时可知该螺旋为左手性，每圈残基数为 3.0。  5.α螺旋的稳定性不仅取决于肽链间的氢键形成，而且还取决于肽链的氨基酸侧链的性质。试预测在室 温下的溶液中下列多聚氨基酸那些种将形成  α 螺旋，那些种形成其他的有规则的结构，那些种不能形 成有规则的结构？并说明理由。（1）多聚亮氨酸，pH=7.0；（2）多聚异亮氨酸，pH=7.0；（3）多聚精 氨酸，pH=7.0；（4）多聚精氨酸，pH=13；（5）多聚谷氨酸，pH=1.5；（6）多聚苏氨酸，pH=7.0；（7） 多聚脯氨酸，pH=7.0；[（1）（4）和（5）能形成 α螺旋；（2）（3）和（6）不能形成有规则的结构；（7） 有规则，但不是 α螺旋]  6.  多聚甘氨酸的右手或左手  α 螺旋中哪一个比较稳定？为什么？[因为甘氨酸是在  α­碳原子上呈对称 的特殊氨基酸，因此可以预料多聚甘氨酸的左右手  α 螺旋（他们是对映体）在能量上是相当的，因而 也是同等稳定的。]  7.考虑一个小的含 101 残基的蛋白质。该蛋白质将有 200 个可旋转的键。并假设对每个键 φ 和 ψ 有亮 个定向。问：（a）这个蛋白质可能有多种随机构象（W）？（b）根据（a）的计算在当使  1mol  该蛋白质折叠成只有一种构想的结构时构想熵的变化（ΔS 折叠）；（c）如果蛋白质完全折叠成由 H 键作 为稳定焓的唯一来源的 α螺旋，并且每 mol H键对焓的贡献为­5kj/mol，试计算 ΔH 折叠；（d）根据逆的 （b）和（c）的答案，计算 25℃时蛋白质的 ΔG 折叠。该蛋白质的折叠形式在 25℃时是否稳定？  [（a）W=2 200 =1.61×10 60 ；（b）ΔS 折叠=1.15 kj/（K∙mol）（c）ΔH 折叠 100×（­5 kj/mol）=­500 kj/mol；注 意，这里我们没有考虑在螺旋末端处某些氢键不能形成这一事实，但考虑与否差别很小。（d）ΔG  折叠  =­157.3 kj/mol.由于在 25℃时 ΔG 折叠<0，因此折叠的蛋白质是稳定的。] 生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 10  8.两个多肽链 A 和 B，有着相似的三级结构。但是在正常情况下 A 是以单体相识存在的，而 B 是以四 聚体（B4）形式存在的，问 A 和 B 的氨基酸组成可能有什么差别。[在亚基­亚基相互作用中疏水相互 作用经常起主要作用，参与四聚体 B4 的亚基­亚基相互作用的表面可能比单体 A 的对应表面具有较多 的疏水残基。]  9.下面的序列是一个球状蛋白质的一部分。利用表 5­6 中的数据和 Chou­Faman的经验规则，预测此区 域的二级结构。RRPVVLMAACLRPVVFITYGDGGTYYHWYH  [残基 4­11是一个 α螺旋，残基 14­19和 24­30是 β折叠片。残基 20­23很可能形成 β转角]  10.从热力学考虑，完全暴露在水环境中和完全埋藏在蛋白质分子非极性内部的两种多肽片段，哪一种 更容易形成 α螺旋？为什么？[埋藏在蛋白质的非极性内部时更容易形成 α螺旋。因为在水环境中多肽 对稳定焓（ΔH 折叠）的贡献要小些。]  11.一种酶相对分子质量为 300000，在酸性环境中可解理成两个不同组分，其中一个组分的相对分子质 量为  100000，另一个为  50000。大的组分占总蛋白质的三分之二，具有催化活性。用 β­巯基乙醇（能 还原二硫桥）处理时，大的失去催化能力，并且它的沉降速度减小，但沉降图案上只呈现一个峰（参 见第  7  章）。关于该酶的结构作出什么结论？[此酶含  4  个亚基，两个无活性亚基的相对分子质量为  50000，两个催化亚基的相对分子质量为 100000，每个催化亚基是由两条无活性的多肽链（相对分子质 量为 50000）组成。彼此间由二硫键交联在一起。]  12.今有一种植物的毒素蛋白，直接用 SDS凝胶电泳分析（见第 7章）时，它的区带位于肌红蛋白（相 对分子质量为 16900）和 β­乳球蛋白（相对分子质量 37100）良种蛋白之间，当这个毒素蛋白用 β­巯基 乙醇和碘乙酸处理后，在 SDS 凝胶电泳中仍得到一条区带，但其位置靠近标记蛋白细胞素（相对分子 质量为  13370），进一步实验表明，该毒素蛋白与 FDNB 反应并酸水解后，释放出游离的 DNP­Gly 和  DNP­Tyr。关于此蛋白的结构，你能做出什么结论？[该毒素蛋白由两条不同的多肽链通过链间二硫键 交联而成，每条多肽链的相对分子质量各在 13000左右。]  13.一种蛋白质是由相同亚基组成的四聚体。（a）对该分子说出来年各种可能的对称性。稳定缔合的是 哪种类型的相互作用（同种或异种）？（b）假设四聚体，如血红蛋白，是由两个相同的单位（每个单 位含 α和 β两种链）组成的。问它的最高对称性是什么？[（a）C4和 D2，C4是通过异种相互作用缔 合在一起，D2是通过同种相互作用缔合在一起，（b）C2因为每个 αβ二聚体是一个不对称的原聚体]  14.证明一个多阶段装配过程比一个单阶段装配过程更容易控制蛋白质的质量。考虑一个多聚体酶复合 物的合成，此复合物含 6个相同的二聚体，每个二聚体由一个多肽 A和一个 B 组成，多肽 A和 B 的长 度分别为  300 个和 700 个氨基酸残基。假设从氨基酸合成多肽链，多肽链组成二聚体，再从二聚体聚 集成多聚体酶，在这一建造过程中每次操作的错误频率为 10 ­8 ，假设氨基酸序列没有错误的话，多肽的 折叠总是正确的，并假设在每一装配阶段剔除有缺陷的亚结构效率为 100%，试比较在下列情况下有缺 陷复合物的频率：（1）该复合物以一条 6000个氨基酸连续的多肽链一步合成，链内含有 6个多肽 A和  6 个多肽 B。（2）该复合物分 3个阶段形成：第一阶段，多肽 A和 B 的合成；第二阶段，AB 二聚体的 形成；第三阶段，6个 AB 二聚体装配成复合物。  [（1）有缺陷复合物的平均频率是 6000×10 ­8 =6×10 ­5 ]  [（2）由于有缺陷的二聚体可被剔除，因此有缺陷复合物的平均率只是最后阶段的操作次数（5此操作 装配 6个亚基）乘以错误频率，即：5×10 ­8 。因此它比一步合成所产生的缺陷频率约低 1000倍。] 生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 11  第六章 蛋白质结构与功能的关系 提要 肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）是脊椎动物中的载氧蛋白质。肌红蛋白便于氧在肌肉中转运， 并作为氧的可逆性贮库。而血红蛋白是血液中的氧载体。这些蛋白质含有一个结合得很紧的血红素辅 基。它是一个取代的卟啉，在其中央有一个铁原子。亚铁（Fe 2+ ）态的血红素能结合氧，但高铁（+3） 态的不能结合氧。红血素中的铁原子还能结合其他小分子如 CO、NO等。 肌红蛋白是一个单一的多肽链，含 153个残基，外形紧凑。Mb内部几乎都是非极性残基。多肽链 中约 75%是 α 螺旋，共分八个螺旋段。一个亚铁血红素即位于疏水的空穴内，它可以保护铁不被氧化 成高铁。血红素铁离子直接与一个 His侧链的氮原子结合。此近侧 His（H8）占据 5个配位位置。第 6 生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 12  个配位位置是 O2 的结合部位。在此附近的远侧 His（E7）降低在氧结合部位上 CO 的结合，并抑制血 红素氧化或高铁态。 氧与 Mb 结合是可逆的。对单体蛋白质如 Mb 来说，被配体（如）O2 占据的结合部位的分数是配 体浓度的双曲线函数，如 Mb 的氧集合曲线。血红蛋白由  4 个亚基（多肽链）组成，每个亚基都有一 个血红素基。Hb A是成人中主要的血红蛋白，具有 α2β2 的亚基结构。四聚体血红蛋白中出现了单体血 红蛋白所不具有的新性质，Hb 除运载氧外还能转运 H + 和 CO2。血红蛋白以两种可以相互转化的构象 态存在，称 T（紧张）和 R（松弛）态。T态是通过几个盐桥稳定的。无氧结合时达到最稳定。氧的结 合促进 T态转变为 R态。 氧与血红蛋白的结合是别构结合行为的一个典型例证。T态和 R态之间的构象变化是由亚基­亚基 相互作用所介导的，它导致血红蛋白出现别构现象。Hb 呈现 3种别构效应。第一，血红蛋白的氧结合 曲线是  S 形的，这以为着氧的结合是协同性的。氧与一个血红素结合有助于氧与同一分子中的其他血 红素结合。第二，H + 和 CO2 促进 O2 从血红蛋白中释放，这是生理上的一个重要效应，它提高 O2 在代 谢活跃的组织如肌肉的释放。相反的，O2 促进 H + 和 CO2 在肺泡毛细血管中的释放。H + 、CO2 和 O2 的 结合之间的别构联系称为 Bohr 效应。第三，血红蛋白对 O2 的亲和力还受 2、3­二磷酸甘油酸（BPG） 调节，BPG是一个负电荷密度很高的小分子。BPG能与去氧血红蛋白结合，但不能与氧合血红蛋白结 合。因此，BPG  是降低血红蛋白对氧的亲和力的。胎儿血红蛋白（α2β2）比成年人的血红蛋白 （α2β2）有较高的氧亲和力，就是因为它结合 BPG较少。 导致一个蛋白质中氨基酸改变的基因突变能产生所谓分子病，这是一种遗传病。了解最清楚的分 子病是镰刀状细胞贫血病。这种病人的步正常血红蛋白称为  Hb  S，它只是在两条  β 链第六位置上的  Glu倍置换乘 Val。这一改变在血红蛋白表面上产生一个疏水小区，因而导致血红蛋白聚集成不溶性的 纤维束，并引起红细胞镰刀状化和输氧能力降低。纯合子的病人出现慢性贫血而死亡。地中海贫血是 由于缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因造成的。 棉衣反映是由特化的白细胞——淋巴细胞和巨噬细胞及其相关的蛋白质之间的相互作用介导的。 T  淋巴细胞产生 T 细胞受体，B 淋巴细胞产生免疫球蛋白，即抗体。所有的细胞都能产生 MHC 蛋白， 它们在细胞表面展示宿主（自我）肽或抗原（非自我）肽。助 T 细胞诱导那些产生免疫球蛋白的 B 细 胞和产生 T 细胞受体的胞毒 T 细胞 增殖。免疫球蛋白或 T 细胞受体能与特异的抗原结合。一个特定 的祖先细胞通过刺激繁殖，产生一个具有同样免疫能力的细胞群的过程称为克隆选择。 人类具有 5 个类别的免疫球蛋白，每一类别的生物学功能都是不同的。最丰富的是 IgG 类，它由  4 条多肽链组成，两条重链，两条轻链，通过二硫键连接成 Y 形结构的分子。靠近 Y 的两“臂”顶端的 结构域是多变区，形成来年各个抗原结合部位。一个给顶的免疫球蛋白一般只结合一个大抗原分子的 一部分，称为表位。结合经常涉及  IgG 的构象变化，以便域抗原诱导契合。由于抗体容易制取并具有 高度特异性，它成为许多分析和制备生化方法的核心，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western 印迹 和单克隆抗体技术等都得到广泛应用。 在发动机蛋白质中蛋白质­配体相互作用上空间和时间的组织达到相当完善的程度。肌肉收缩是由 于肌球蛋白和肌动蛋白“精心安排”的相互作用的结果。肌球蛋白是由纤维状的尾和球状的头组成的棒 状分子，在肌肉中倍组织成粗丝。G­肌动蛋白是一种单体，由它聚集成纤维状的 F­肌动蛋白，后者是 细丝的主体。由粗丝和细丝构成肌肉收缩单位——肌节。肌球蛋白上的 ATP水解与肌球蛋白头片的系 列构象变化相偶联， 引起肌球蛋白头从  F­肌动蛋白亚基上解离并与细丝前方的另一 F­肌动蛋白亚基再 结合。因此肌球蛋白沿肌动蛋白细丝滑动。肌肉收缩受从肌质网释放的  Ga 2+ 刺激。Ga 2+ 与肌钙蛋白结 合导致肌钙蛋白­原肌球蛋白复合体的构象变化，引发肌动蛋白­肌球蛋白 0相互作用的循环发生。 习题  1.蛋白质 A 和 B 各有一个配体 X 的结合部位，前者的解离常数 Kd 为 10 ­6 mol/L。（a）哪个蛋白质对配 体 X的亲和力更高？（b）将这两个蛋白质的 Kd 转换为结合常数 Ka。[（a）蛋白质 B；（b）蛋白质 A  的 Ka=10 6 (mol/L) ­1 ，蛋白质 B 的 Ka=10 ­9 (mol/L) ­1  2.下列变化对肌红蛋白和血红蛋白的 O2 亲和力有什么影响？（a）血浆的 pH 从 7.4 降到 7.2；（b）肺 生物秀考研频道——生物考研服务第一品牌  http://www.bbioo.com/ky/  生物秀下载频道——专业生物资源下载平台  http://www.bbioo.com/soft/ 13  中 CO2 分压从 45torr（屏息）降到 15torr（正常）；（c）BPG水平从 4.5mmol/L（海平面）增至 7.5mmol  （高空）。[对肌红蛋白：（a）无；（b）无；（c）无。对血红蛋白：（a）降低；（b）增加；（c）降低]  3.在 37℃，pH7.4，CO2 分压 40 torr和 BPG 正常胜利水平（4.5mmol/L 血）条件下，人全血的氧结合 测定给出下列数据：  p（O2）  %