玉屏风散对S180荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响.doc

玉屏风散对S180荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响.doc 玉屏风散对S180荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响 【摘要】 目的: 探讨玉屏风散对荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响。方法: 采用体外培养S180肉瘤细胞, 接种健康小鼠, 建立荷瘤小鼠模型, 并给予玉屏风散治疗, 观察计算抑瘤率,检测巨噬细胞吞噬活性, 巨噬细胞NO分泌量, 自然杀伤细胞(NK)活性, T淋巴细胞增殖能力及白介素 2 (IL 2)的产生及活性。结果: 玉屏风散可提高荷瘤小鼠吞噬细胞的功能, 增加巨噬细胞NO分泌量, 促进荷瘤小鼠白介素 2 (IL 2)的产生, 淋巴细胞的转化、 及NK细胞活性。结论: 玉屏风散可增强荷瘤小鼠的免疫功能, 抑制模型鼠肿瘤的生长。 【关键词】 玉屏风散 荷瘤小鼠 免疫功能 玉屏风散出自元?朱丹溪的《丹溪心法》, 由黄芪、 白术和防风等组成, 具有益气固表、 扶正止汗、 祛风御风等功效。前期研究发现玉屏风散对免疫抑制模型小鼠的免疫功能具有明显的促进作用[1]。众所周知肿瘤的发生、 发展与宿主的免疫系统功能密切相关, 二者互为因果, 肿瘤患者往往存在免疫抑制, 抵抗力下降、 反复感染等问, 因此提高肿瘤患者机体的免疫功能, 对于肿瘤的防治具有十分重要的意义。本研究中我们探讨了玉屏风散的抗肿瘤效果以及对荷瘤小鼠免疫功能的调节作用,为进一步开发免疫增强剂的抗肿瘤药物提供参考。 1 和方法 1.1 材料 C57BL/6纯系小鼠,雌雄各半(体质量18,22 g)购自吉林大学实验动物中心。S180细胞株购自中科院上海细胞库, 于牡丹江医学院病原生物学研究室昆明鼠腹腔接种传代。YAC 1细胞株购自中科院上海细胞库。一氧化氮检测测试盒购自深圳晶美生物有限公司。RPMI1640培养基为美国Gibco 公司产品。刀豆蛋白A(ConA)、 MTT为Sigma公司产品。 1.2 方法 1.2.1 玉屏风散煎剂的制备 按《中华人民共和国药典》的标准取黄芪、 防风和白术常规煎煮3次, 去渣、 混合、 浓缩配成1 kg/L 的玉屏风水煎液。 1.2.2 动物分组与处理 C57BL/6纯系小鼠36只, 适应性饲养3 d后, 随机分成3组, 每组12只(雌雄各半): (1)正常对照组(NC); (2)荷瘤对照组(CC); (3)玉屏风散治疗组(Y)。除正常对照组外, 其余二组于左前肢腋下皮下注射2×109/L S180瘤细胞悬液0.2 mL, 接种24 h后开始灌胃给药, 玉屏风水煎剂组每只小鼠给 以25 g/(kg?d)玉屏风水煎剂灌胃, 对照组给予等体积生理盐水灌胃, 连续灌胃给药12 d, 于第13 天处死小鼠进行相关检测。 1.2.3 对荷瘤小鼠体内抑瘤作用的观察 实验小鼠于末次给药24 h后处死。剥离瘤体, 称量瘤体湿重, 按下列公式计算抑瘤率。抑瘤率,[对照组平均瘤质量(mg),实验组平均瘤质量(mg)]/ 对照组平均瘤质量(mg)×100%。 1.2.4 NK细胞杀伤活性的规定 实验小鼠于末次给药24 h后脱颈处死, 无菌取脾, 常规制作脾细胞悬液, 调整细胞密度5×109/L; 另将连续传代培养之靶细胞YAC 1细胞, 密度调为2.5×108/L, 各取100 μL加入96孔板(效靶比20?1), 3复孔, 另设效应细胞对照孔、 靶细胞对照孔, 37?、 50 mL/L CO2孵箱培养20 h离心弃上清100 μL, 加入MTT应用液(5 g/L) 10 μL, 再继续培养4 h, 加入溶解液DMSO 100 μL, 充分吹打至甲臜颗粒完全溶解后, 酶标仪测定A595值, 按公式计算NK活性。NK细胞活性=[靶细胞对照孔A595值,(实验孔A595值,效应细胞对照孔A595值),/靶细胞对照孔A595值×100%。 1.2.5 小鼠腹腔巨噬细胞NO产生能力及吞噬功能测定 实验小鼠于末次给药24 h后处死, 常规制备腹腔细胞悬液, 调整细胞密度为2×109/L, 将该细胞加入24孔培养板内, 每孔1 mL。37?、 50 mL/L CO2贴壁3.5 h, 倾去上清液, 洗涤细胞3次, 除去非黏附细胞, 加入EDTA重新悬浮细胞, 用含有10 mL/L FCS的RPMI1640培养液调细胞密度至1×109/L。37?、 50 mL/L CO2培养24 h后, 收集各组培养上清液, 使用比色法试剂盒测定NO, 按操作,2,。另将2×109/L腹腔巨噬细胞加入96孔细胞培养板内, 每份样品设3复孔, 每孔100 μL。在恒温37?、 50 mL/L CO2培养箱中培养4 h后, 每孔加入100 μL、 4 g/L中性红生理盐水溶液, 继续培养4 h。取出培养板, 用0.01 mol/L, pH7.4的PBS清洗3次, 每孔加入0.2 mL巨噬细胞裂解液。经4? 3 h后, 用酶标仪测定A540值,3,。 1.2.6 T细胞增殖能力的测定 采用MTT比色法,4,, 常规制作实验小鼠脾细胞悬液, 调整细胞密度至5×109/L, 加入96孔细胞培养板中, 100 μL/孔, 再加入ConA 100 μL/孔, 使其终浓度为6 mg/L, 置于37?、 50 mL/L CO2培养箱68 h。取出, 从每孔中吸出 80 μL上清后。加入5 g/L MTT 10 μL/孔, 置培养箱内4 h。取出, 加100 g/L SDS HCl溶液100 μL/孔, 振荡过夜, 用酶标仪测定A570值。以各样本A570值代表T细胞增殖能力。 1.2.7 脾细胞产生IL 2能力测定 采用丝裂原激活淋巴母细 胞法,4,, 无菌摘取脾脏, 常规制作脾细胞悬液, 调整细胞密度至5×109/L, 加入24孔细胞培养板中, 1 mL/孔, 再加入ConA使其终浓度为6 mg/L, 置于37?、 50 mL/L CO2培养箱48 h。吸出上清, 以3000 r/min离心10 min。取出上清即为粗制的IL 2, 分装置于-20?保存待测。取C57BL/6纯系小鼠, 常规制作脾细胞悬液, 调整细胞密度至5×109/L, 加入终浓度为2 mg/L ConA, 培养48 h使之淋巴母细胞化。取出, 洗涤细胞后, 加入96孔细胞培养板中, 100 μL/孔。同时, 加入待测的IL 2100 μL/孔, 置于37?、 50 mL/L CO2培养18 h, 以MTT比色法测定A570值。以各样本A570值代表其产生IL 2的能力。 1.2.8 统计学处理 以上结果所有数据以x?s表示, 采用统计学处理软件SPSS9.0进行统计学, 组间比较采用t检验。 2 结果 2.1 玉屏风散对荷瘤小鼠S180肉瘤的抑瘤作用 研究可见正常对照组小鼠生长良好、 活泼、 皮毛光滑; 实验组小鼠接种瘤细胞后饮食减少、 皮毛无光泽, 均可触及皮下肿块, 解剖小鼠剥离瘤体可见, 玉屏风散治疗组肿瘤生长缓慢, 与荷瘤对照组比较有统计学意义(P<0.01), 表明玉屏风散能有效抑制小鼠体内S180肉瘤的生长, 抑瘤率达20%(表1)。 表1 玉屏风散对荷瘤小鼠S180肉瘤重量的影响(略) Tab 1 Influence of yupingfengsan on the S180 tumor weight of tumor bearing mice bP<0.01 vs CC group. 2.2 玉屏风散对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响 研究显示荷瘤小鼠NK细胞的杀伤活性明显下降, 与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01), 玉屏风散给药能有效改善S180荷瘤小鼠的NK细胞杀伤活性与荷瘤对照组比较有统计学意义(P<0.01, 表2)。表2 玉屏风散对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响(略) Tab 2 Influence of yupingfengsan on the activity of NK cells in the tumor bearing mice bP<0.01 vs NC group; dP<0.01 vs CC group. 2.3 玉屏风散对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响 研究显示荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能较正常组比较明显下降(P<0.01), NO分泌量降低(P<0.01), 玉屏风散给药后可明显改善荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞功能增强NO分泌量, 及有效提高其吞噬中性红的能力(表3)。提示玉屏风散对荷瘤小鼠的巨噬细胞免疫活性具有正向调节功能。 表3 玉屏风散对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能及NO分泌的影响(略) Tab 3 Influence of yupingfengsan on the phagocytosis activity and secreted NO of peritoneal macrophage in tumor bearing mice bP<0.01 vs NC group; dP<0.01 vs CC group. 2.4 玉屏风散对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖及脾细胞IL 2产生的影响 细胞免疫在抗肿瘤免疫中发挥重要作用, 研究显示S180荷瘤小鼠的T细胞增殖能力及脾细胞IL 2的产生较正常对照比较明显下降(P<0.01), 表明肿瘤的生长一定程度的抑制了小鼠的细胞免疫功能, 玉屏风散治疗后T细胞增殖能力及脾细胞IL 2的产生能力明显恢复, 与荷瘤对照组比较有统计学意义(P<0.01), 提示玉屏风散对荷瘤小鼠的细胞免疫功能具有正向调节作用(表4)。 表4 玉屏风散对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖及脾细胞IL 2产生的影响(略) Tab 4 Influence of yupingfengsan on the T lymphocytes proliferation and secreted IL 2 of splenic cells in tumor bearing mice bP<0.01 vs NC group; dP<0.01 vs CC group. 3 讨论 机体的免疫状态与肿瘤的发生、 发展密切相关, 当宿主免疫功能低下或受抑制时, 肿瘤的发病率增高, 而在肿瘤进行性生长时, 肿瘤患者的免疫功能又会受到抑制, 可见免疫功能低下是阻碍宿主战胜疾病及恢复健康的重要因素, 因而提高宿主的免疫功能及其活力是当前肿瘤防治的有效途径之一。玉屏风散是一传统古方, 具有扶正固本之功效, 大量的实验研究表明其对免疫功能低下的动物模型具有明显的增强免疫功能作用,1,, 推测其可能对肿瘤感染者的免疫功能产生调节作用, 因此在实验中我们观察了玉屏风散对S180肉瘤在小鼠体内生长的影响, 及其对荷瘤鼠特异性、 非特异性免疫功能的影响。 实验制备了S180荷瘤鼠动物模型, 研究发现给予玉屏风散后, 明显的抑制了荷瘤小鼠S180肉瘤的生长。提示玉屏风散在小鼠体内一定程度的发挥了抗肿瘤功效。同时也验证了小鼠荷瘤后机体免疫功能受到明显抑制, 表现为腹腔巨噬细胞吞噬功能下降, NO分泌量减少, T淋巴细胞的增殖功能及IL 2产生能力受到抑制, NK细胞活性降低, 表明荷瘤小鼠的免疫系统处于抑制状态, 然而T淋巴细胞, NK细胞、 巨噬细胞等这些免疫细胞在肿瘤免疫方面均起着重要作用。文献,5,报道体内的巨噬细胞被激活后, 具有杀伤肿瘤细胞的功能, 其效应和方式是通过直接对肿瘤细胞 的杀伤和产生溶解肿瘤细胞的效应分子而实现的, NO则是重要的效应分子之一。T细胞介导的免疫应答, 在抗肿瘤免疫中发挥重要作用, CTL对肿瘤细胞进行特异性识别杀伤, 同时Th细胞的功能也尤为重要, Th细胞分为Th1、 Th2细胞,Th1细胞以分泌IL 2等细胞因子, 通过活化CTL、 NK和巨噬细胞增强细胞免疫功能[6], 近年研究显示, 大多数的肿瘤患者和荷瘤动物体内Th1细胞细胞功能下降, 主要体现在其产生的细胞因子减少,7, 8,, 我们的研究与文献报道相符。NK细胞在抗肿瘤免疫中, 即可受Th1产生的细胞因子调控, 参与特异性细胞免疫的效应阶段, 同时又作为非特异免疫细胞, 可杀死不表达MHC ? 类分子的逃逸CTL杀伤的肿瘤细胞。应用玉屏风散治疗后的荷瘤小鼠的巨噬细胞吞噬功能及NO分泌量、 NK细胞活性、 T淋巴细胞增殖能力及IL 2的产生均明显增高, 提示玉屏风散对荷瘤小鼠的特异性和非特异性免疫功能均有明显的增强作用。 由此可见玉屏风散可有效的增强荷瘤小鼠的免疫功能, 从而发挥其抑制肿瘤的作用。 【