杀白细胞素LukF-PV蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

杀白细胞素LukF-PV蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 杀白细胞素LukF-PV蛋白多克隆抗体的制 备及鉴定 临床输血与检验2010年1O月第12卷第4期 重组PV一杀白细胞素LukF—PV蛋白多克隆抗体的 制备及鉴定 戴媛媛马筱玲常文娇高玉录 ?325? 【摘要1目的制备重组金黄色葡萄球菌PV一杀白细胞素LukF—PV蛋白多克隆抗体并鉴定.方法纯化获得重组蛋 白LukF—PV,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA法测定抗体滴度,Westernblotting法鉴定免疫活性.结果成功免疫 新西兰白兔获得多抗血清,ELISA测定其效价为1:10.,Westernblotting鉴定其能识别重组蛋白和金葡菌PVL蛋白.结论 成功制备出重组金黄色葡萄球菌PV一杀自细胞素LukF—PV蛋白多克隆抗体,并进行鉴定,为建立产杀白细胞素的金黄色 葡萄球菌的快速,廉价的免疫学检测方法奠定基础. 【关键词】杀白细胞素金黄色葡萄球菌多克隆抗体 【中图分类号】R392.11R378.11【文献标识码】A【文章编号】1671—2587(2010)04—0325—03 ProductionandVerificationofPolyclonalAntibodieswithRocombinantLukF-PVDAIYua n—yuan,MAXiao-ling, CHANGWen一no,eta1.DepartmentofLaboratory,AnhuiProvincialHospital,Hefei230001 [Abstract]ObjectiveThepolyclonalantibodiesobtainedthroughtheimmunizationofNewZ ealandwhiterabbits withrecombinantLukF-PV.MethodsFusionexpressionwasinducedbyIPTGandpurifiedth roughaffinitychromatogra— phywithNiSO.NewZealandwhiterabbitswereimmunizedwithrecombinantLukF— PV(rLukF—PV)andseraoftheim— munizedrabbitswerecollected10daysafterthesecondenhancedimmunization.Thepolyelonalantibodiesthusobtained wereverifiedwithrLukF— PVantigenandPVLbywesternblottingandthetitersofantibodiesweredeterminedbyELISA. ResultsThepolyclonalantibodiesobtainedthroughtheimmunizationofNewZealandwhite PV rabbitswithrLukF— showedaserumantibodytiterof1:10..ConclusionThepolyclonalantibodieswereobtainedsuccessfully.Theresultsin thepresentstudymayprovideafoundationforthelutherstudiesonthediagnosisofPVL. [Keywords]LeukoeidinStaphylococcusaureusPolyclonalantibodies Panton—Valentine杀白细胞素(Panton— ValentineLeukocidin,PVL)是由金黄色葡萄球菌 (金葡菌)产生的细胞外毒素,可介导多形核中性粒 细胞和单核细胞形成微孑L,使之激活,并促使其脱 颗粒释放炎症介质,在临床上可引起皮肤脓疮和疔 疮以及严重坏死性肺炎等疾病[1].PVL由LukF— PV和LukS—PV双组份组成,两者协同发挥杀伤作 用.近年来有关产PVL的金黄色葡萄球菌所致的 感染死亡增多.PVL阳性的金黄色葡萄球菌致病 力强,而国内对其致病机制及流行,预防的相关研 究资料匮乏.目前PVL的检测主要使用复杂的分 子生物学技术扩增目的基因,不适用于一般临床实 验室,导致检出率极低.因此,寻找更为简单便捷的 PVL检测途径尤为重要.本研究利用重组蛋白制 DOI:10.3969/j.issn.1671-2587.2010.04.013 作者单位;230001合肥,安徽省立医院检验科 作者简介:戴媛嫒(198O一),女,安徽合肥人,检验师,在读硕 士研究生,主要从事细菌耐药性方面研究,(Te1)0551—2283454(E— mail)dai0714@163.COITI. 备多克隆抗体,开辟快速检测PVL阳性的金黄色 葡萄球菌感染的新方法. 材料与方法 1材料pET28a—LukF—PV—BL21菌株均为本室 构建,保存[2;HisBindPurificationKit购自No— vagen公司;新西兰白兔由安徽医科大学实验动物 中心提供.完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂,考马 斯亮蓝R250和考马斯亮蓝G250,购自Sigma公 司;预染的蛋白质相对分子质量,辣根过氧化 物酶标记的羊抗兔IgG购自大连宝生物公司;硝酸 纤维素膜(NC膜)为浙江四青生化材料厂产品. 2方法, 2.1rLukF—PV的诱导达和纯化:将含有实验 室保存的pET28a—IukF—PV—BL21菌液涂板,37? 活化过夜,挑取单菌落接种于含1:1000卡那霉素 的LB培养液中,37?培养至对数期(OD600约为 0.6),加入异丙基一p.D一硫代半乳糖苷(IPTG)至终 浓度lmmol/L进行诱导表达,继续培养6h,于 ?326? 4?,4000r/min离心收集细菌,1xBindingbuffer 重悬细菌沉淀.将重悬菌液置冰水浴于340W功率 下超声破碎,超声3S,停歇3S,30次为1个循环,共 7个循环.将超声破碎后的产物于4?,7500r/rnin 离心10rain,取上清依据His?BindPurification Kit操作说明书,用6×His亲和层析柱纯化表达 产物. 2.2纯化后rLukF—PV浓度测定:依据说明书,采 用改良Bradford(考马斯亮蓝法)测定重组蛋白的 含量,确定免疫所需蛋白量. 2.3LukF—PV多抗血清的制备:纯化后的重组蛋 白rLukF—PV免疫新西兰白兔,免疫前耳缘静脉采 血,收集血清,一8O?保存.将重组蛋白rLukF—PV 稀释为浓度1.0mg/ml,与弗氏佐剂按1:1混合乳 化后,后肢大腿肌肉内注射新西兰白兔,每只注射 0.5ml.首次免疫4周后再加强免疫2次.2次加强 免疫10d后耳缘静脉采血,离心收集血清,一80~C 保存备用. 2.4IukF—PV多抗血清滴度测定:采用间接 ELISA法检测已制备的兔多抗血清滴度.先经棋 盘滴定试验确定rIukF—PV蛋白抗原的最适包被 浓度,以其包被酶标板,5%小牛血清4?过夜,封闭 酶标板反应孔,将待测血清梯度稀释,依次加入反 应孔,同时以免疫前兔血清作阴性对照,并设立空 白对照.与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG反应 后,邻苯二胺(OPD)显色,2Orain内用全自动酶 标仪(A492)测定结果,以大于或等于阴性值的 JClinTransfusLabMed,0ct.2010,Vol12,No.4 2.1倍判为阳性. 2.5LukF—PV多抗血清免疫特异性的Western blotting鉴定. 2.5.1对重组蛋白的识别:具体方法见文献口]. 2.S.2对PVL阳性金黄色葡萄球菌的识别:将冻 融和超声破碎的PVI阳性细菌SDS—PAGE电泳, 转膜,并用丽春红染色,封闭,洗膜.用抗血清与不 同条带37?孵育1h洗膜,加二抗,显色方法同前. 结果 1抗重组蛋白兔血清滴度的ELISA测定经 EIISA测定,用重组蛋白IukF—PV免疫的3只新 西兰白兔均产生相应抗体,抗体滴度为1:1O.,见 图1,抗体滴度见表1. 4:免疫前兔血清;5:空白对照;A—H:分别为兔血清倍比稀 释不同浓度(依次为1O,1O-,1o_.,1O,,1O一,1O一, 1O_.,10一) 图1多抗血清的ELISA测定结果 表1多抗血清的ELISA测定结果(OD值,至,n=3) 2Westernblotting对多抗血清免疫特异性鉴定 2.1对重组蛋白rLukF—PV的识别:以免疫兔血 清为一抗,对重组蛋白rLukF,PV进行Western blotting检测,结果显示在预期位置可见识别条 带,见图2. 2.2对PVL阳性金黄色葡萄球菌的识别:以免疫 兔血清为一抗,对重组蛋白rLukF—PV进行West— ernblotting检测,结果显示在预期位置可见识别 临床输血与检验2010年1O月第12卷第4期 条带,见图2 M:蛋白质标准分子量;1:空白对照;2:抗血清对重组 rLukF—PV的识别;3:抗血清对PVL阳性金黄色葡萄球菌 的识别 图2多抗血清免疫特异性Westernblotting结果 讨论 PVI是金葡菌产生的细胞外毒素之一,是金 葡菌重要的致病因子[1].最初由Vandeleld于1884 年发现,l932年Panton和Valentine将其从溶血素 中分离出来,并将其与皮肤软组织感染联系起来. Lina等[4首先分析了社区感染的金葡菌肺炎,提 出携带PVI基因的金葡菌与坏死性肺炎之间存在 明显的相关性.PVI是金黄色葡萄球菌分泌的一 种异聚双组份打孑L细胞溶解毒素,对多形核粒细胞 具有高特异性的溶解作用,PVLCSJ为双组份蛋白, 由LukS—PV(33kD)和LukF—PV(34kD)两部分组 成,两者在靶细胞膜上交替排列成异聚体,协同产 生杀白细胞效应L6].这两组蛋白分别由lukS—PV (938bp)和lukF—PV(978bp)2个基因编码共同转 录.一般认为PVL基因是由前噬菌体携带,并整合 到金葡菌的染色体上,通过噬菌体溶源转换机制使 金葡菌获得产PVL基因,编码产生PVL毒素[. 较之PVI阴性金葡菌,PVL的存在可能增强 金葡菌的致病性,提高疾病致死率.国内外研究表 明,PVL阳性金葡菌肺炎患者住院48h内病死率 为37,最终病死率为75;而PVL阴性感染患者 住院48h内病死率仅为6%.目前,PVL的致病性 及流行病学研究是国内外研究热点.但由于实验条 件的限制,采用分子生物学方法检测PVI阳性的 金葡菌繁琐,费时,成本高[8],在我国绝大多数临床 实验室难以开展.临床实验室,尤其是社区医院对 PVI的检测几乎处于空白状态,导致我国产PVL 金葡菌的检出率极低,相关研究资料匮乏.因此,寻 找更为简单便捷的检测PVL阳性金葡菌的途径是 当务之急.免疫学方法是实验诊断的重要方法,但 是,目前关于PVI特异性抗体的研究甚少,限制了 ? 327? 这一经典方法在检测PVI阳性金黄色葡萄球菌中 的应用. 笔者已完成对IukF—PV基因的克隆和原核表 达引,本研究利用rLukF—PV疫新西兰白兔,制 备多抗血清.最终获得滴度为1:1o.的抗I.ukF— PV多克隆抗体.结果显示抗IukF—PV多克隆抗体 不但可与rLukF—PV发生特异性免疫反应,也与 菌体内源性的LukF—PV发生特异性免疫反应.本 研究为建立PVI免疫学方法奠定了基础. 参考文献 1SusanBoyle—Vavra,RobertSDaum.Community—ac— quiredmethieillin—resistantStaphylococcusaureus:the roleofPanton—Valentineleukoeidin[J].Laboratory Investigation,2007,87(1):3-9. 2马筱玲,高玉录,戴媛媛,等.潘顿一瓦伦丁杀白细胞毒素 lukF—PV基因的克隆及原核表达[J].中华检验医学杂 志,2009,32(3):343—345. 3奥斯伯FM,金斯盾RE,塞德曼JG,等.精编分子生物学 实验指南EM].北京:科学出版社,2005:46—47. 4LinaG,PiemontY,Godail—GamotF,eta1.Involvement ofPanton-Valentineleukoeidin—-producingStaphylo—. 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