【doc】NAA对胡萝卜（Daucus carota）悬浮细胞茄红素合成的影响

【doc】NAA对胡萝卜（Daucus carota）悬浮细胞茄红素合成的影响 NAA对胡萝卜(Daucus carota)悬浮细胞 茄红素合成的影响 西北植物2003,23(5):788—791 ActaBOt.Borea1..Occident.Sin 文章编号:1000—4025(2003)05—0788—04 NAA对胡萝I\(Daucuscarota)悬浮细胞 茄红素合成的影响 梁燕,王鸣,陈大明,陈杭 (1西北农林科技大学园艺学院,陕西杨陵712100;2北京市蔬菜研究中心,北京板井100081) 摘要:通过对胡萝卜新透心红(DaucuscarotaCV.:KinTouxinhong)细胞悬浮系单位鲜重细胞的茄红素含量,细 胞总产量以及茄红素总产量的分析比较,研究了培养基中不同NAA浓度对胡萝卜细胞悬浮系茄红素代谢的影响. 结果表明,NAA具有增强细胞茄红素代谢水平,提高单位鲜重细胞中茄红素的含量的作用,但对细胞的生长具有 抑制作用.从茄红素单产和总产量综合,培养基中加入3.0mg?I-INAA效果最佳. 关键词:胡萝卜;茄红素;NAA;悬浮培养 中图分类号:Q945.18文献标识码:A EffectsofNAAonlycopenesynthesisofcarrotsuspensioncultures LIANGYan,WANGMing,CHENDa—Ming孙.CHENHang (1CollegeofHorticulture,NorthwestSci-TechUniversityofAgricultureandForestry,Yangl ing,Shaanxi712100,China:2Na— tionalVegetableEngineeringResearchCenter,Banjing100081,China) Abstract:Plantgrowthregulatorshavegreatimpactsonthesynthesisofsecondarymetabolite sinplant cellsinvitro.Inordertostudytheeffectsofa— naphthaleneacid(NAA)onlycopenesynthesisincarrot suspensioncellsystem,(DaucuscarotaCV.XinTouxinhong)stablecellsuspensionsystemproducedand containedinthemediumofMS,containingvitamineinBsmedium,2mg?L一2,4一 D,0.1mg?L一KT and30g?L, sucrosewasemployedasthematerial,thefavoritemediumofMG5selectedfromthemedia namelyMS,White,B5,M9,LS,ERandMG5wasusedasbasicmedium.Theconcentrationtreatmentsof NAAinbasicmediumwere(CK),0.5,1.0,3.0,5.0and10.0mg?L 一.Afterculturedincellgrowth mediumofMS,containingvitamineinB5medium,0.1mg?L一2,4一Dand30g?L一 sucrosefortWO weeks,thecarrotsuspensioncellscollectedwithcentrifugationweretransferredintotreatmentmediaand culturedat25Cwith100~-.120rpmoscillationinthedark.Twoweekslater.totalfresh/dryweights. lycopenecontentandtotallycopenecontentofeverytreatmentsuspensioncellsystemweremeasured.The resultsshowedthatthelycopenecontentofunitfreshweightcellsinthemediumwith3.0mg?L一NAA wassignificantlyhigherthantheothertreatmentsincludingCK,theconcentrationsofNAAmorethan5. 0mg?L一orlessthan1.0mg?L— inhibitedthelycopenesynthesisinthecarrotsuspensioncells.The totalcontentoflycopeneincarrotcellsuspensionsystemwasalsothehighestatthe3.0mg?L一NAA concentration,othertreatmentswerealllowerthanCK.Otherwise.thetotalweightofcellsinthemedia 收稿日期:2002—12—03;修改稿收到日期:2003-03—20 基金项目:国家自然科学基金项目(30070525),北京市科技新星项目(9558101400). 作者简介:梁燕(1963一),女(汉族),博士,副研究员,主要从事蔬菜遗传资源和基因研究.*现在工作单位:浙江大学. 5期梁燕,等:NAA对胡萝卜(Daucuscarota)~-细胞茄红素食瘗墅堕璺! withNAAwerealllowerthantheCK.Inconclusion,additionofNAAinthemediapromotedth ely— copenemetabolismandupgradedthelycopenecontentofunitfreshweightcells,andrepresse dthecell growthcomparedwithcontro1.TheoptimumconcentrationofNAAinthemediumforlycope nesynthesis incarrotcellswas3.0nag?L一. Keywords:DaucuscarotaL;lycopenesynthesis;a—NaphthaleneAcid(NAA);suspensioncellculture 植物离体细胞作为生物反应器具有生产周期 短,提取简单,易规模化,不受外界环境干扰,而且产 量高,化学稳定性和化学特性好等特点,利用植物离 体细胞培养进行有用次生代谢物质的生产一直受到 研究者们的重视L1],也有成功的先例L2].同时,研究 发现,离体培养条件下,细胞系的种类以及培养条 件,培养基的组成,植物生长调节剂的种类和浓度对 目的产物的产量有很大的影响L3]. 茄红素是植物类胡萝卜素代谢中的一种重要物 质,具有极强的抗氧化活性,这种特性对于人类多种 重要疾病和癌症具有显着的预防和治疗功效,如何 提高植物离体细胞茄红素代谢活性,实现茄红素的 工厂化生产,是近年掀起的一个研究热点. 胡萝卜是类胡萝卜素代谢最为旺盛的作物之 一 ,易于细胞培养.以胡萝卜为试验材料,研究了不 同细胞系,培养条件,培养基种类,蔗糖浓度,无机离 子浓度以及植物生长调节剂等因素对离体细胞茄红 素代谢活性和产量的影响.本文着重分析了培养基 中NAA浓度对胡萝卜悬浮细胞茄红素合成的影 响,筛选出适宜胡萝卜细胞悬浮系积累茄红素的最 佳NAA浓度. 1材料与 1.1材料与培养条件 以新透心红(DaucuscarotaCV.XinTouxin— hong)稳定的细胞系为试验材料,采用两段式培养. 细胞悬浮系保存在含有B.培养基中的维生素,2mg ? L2,4一D,0.1nag?LKT和30g?L蔗糖 的液体MS培养基中,将细胞从保存培养基中转入 细胞生长培养基中,使细胞数量迅速增加,生长培养 基的基本成分与保存培养基相同,只是不含KT, 2,4一D浓度降为0.1mg?L,.细胞在生长培养基 中生长2周后,转入试验培养基中,试验培养基以从 MS,White,B5,M9,LS,ER和MG57种培养基 中筛选出的有利于新透心红细胞茄红素合成的 MGs为基本组成.共设5个NAA浓度水平(nag? L),分别为0.0(CK),0.5,1.0,3.0,5.0和10.0. 每个处理3次重复,每个重复为一个培养瓶,瓶体积 为250mL,工作体积为75,100mL.细胞的保存, 生长和试验均在25C,黑暗条件下,lo0,120rpm 震荡培养. 1.2测定项目与方法 测定指标包括细胞鲜重(g.300mL),细胞干 重(g.300mL),每mg鲜重细胞在470nm处的光 吸收值(A47o). 细胞鲜干重测定.细胞在试验培养基中培养l4 d后,用atmanNo.4滤纸,真空抽滤至无水滴, 称取细胞鲜重,然后,超低温干燥(或60C烘干24h ),称取细胞干重. 茄红素含量测定采用丙酮法[4],从过滤得到的 细胞鲜样中随机取3个平行样,每个样品lmg,加入少量无菌石英砂研磨破碎细胞,用丙酮定容到l mL,暗中放置lh,室温避光震荡提取30min,离 心,以丙酮为对照,测定上清夜在470nm处的光吸 收值.每个处理的茄红素含量用3次重复光吸收值 的平均值表示.用LSD法对不同处理的测定结果进 行差异显着性分析. 2结果与分析 2.1NAA对悬浮细胞茄红素含量的影响 单位重量或单位体积细胞中茄红素的含量(单 产)是总产量的一个重要构成因子,也是反映细胞茄 红素代谢活性的重要参数.培养基中NAA浓度对 新透心红单位重量细胞中茄红素含量的影响如表 1.表中显示,NAA浓度为3.0mg?L一时,细胞中 茄红素含量最高,0.5mg?L时含量最低,其它浓 度处理的含量居中.LSD分析结果表明,NAA浓度 为3.0mg?L时的茄红素含量显着地高于1.0 mg?L时的含量,极显着地高于CK及其它处理. 说明,培养基中加入NAA对新透心红悬浮细胞中 茄红素的合成和积累具有促进作用,浓度以3.0mg ? L为最佳,低于1.0mg?L或高于5.0mg? L都会产生抑制作用,使茄红素的含量降低. 表1不同NAA浓度下胡萝卜悬浮细胞茄红素含量差异显着性分析(WI470nm) Table1Significantdifferencesamongthelycopenecontentsofcellsincarrotsuspensionatdif ferentNAAconcentrations 注:小写字母表示在5水平上有差异,大写字母表示在1水平上有差异.字母相同表示无显着差异,字母不同表不有显着差异. Notes:[owercasesindicatedthedifferencesat5level,anduppercasesexpressedthedifferenc esat1leve1.Thesamelettersmeantno significantdifferences,thedifferentlettersshowedsignificantdifferences. 2.2NAA对细胞产量的影响的细胞产量均低于CK,而且随着浓度的增加细胞产 细胞产量是影响悬浮细胞中次生代谢物质总产量逐渐下降,当浓度高于5.0mg?L叫时,细胞产量 量的又一重要因素,细胞产量用300ml培养细胞的迅速降低,浓度10.0mg?L的细胞产量最低.这 总鲜重表示,新透心红细胞鲜重随NAA浓度的变说明,培养基中加入NAA不利于细胞的生长. 化如图1,A.图中显示,CK的细胞产量最高,各处理 牺l 盐 霉 聂 NAA浓度 NAAconcentration(rag/L) 删 缸 般 楼 ;13: NAA浓度 NAAconcentration(mg/L) 图1NAA浓度对胡萝卜悬浮系茄红素含量和细胞鲜重的影响 Fig.1EffectsofNAAconcentrationsonlycopenecontentsandfreshweightofcellsincarrotsu spensions 2.3NAA对茄红素总产量的影响 总产量是提高悬浮系次生代谢物质产量的最终 目的.根据单位鲜重细胞中茄红素的含量及细胞总 鲜重得出NAA浓度对300ml培养细胞茄红素总 产量的影响曲线(图1,B).从中可以看出,NAA浓 度为3.0mg?L时的产量与CK相当,而其它处 理的产量均低于CK.浓度在0.0,1.0mg?L_.,茄 红素总产量随浓度增加而降低,在1.O,3.0nag? L_.,随浓度增加而增加,高于3.0mg?L_.,产量直 线下降,到10.0nag?L_.,产量最低.茄红素总产量 受到单产和细胞产量两方面因素的影响.由于3.0 mg?L叫时茄红素含量极显着地高于CK及其它处 理,尽管细胞产量低于CK,最终由于单产的高水平 弥补了细胞产量的不足,而表现出高产.CK虽然茄 红素单产极显着地低于3.0mg?L处理,但由于 细胞产量高弥补了单产的不足,也表现高产.1.0 mg?L叫处理的茄红素含量虽然显着高于CK,但因 细胞产量低导致茄红素总产较低.1.0,3.0mg? L叫范围内茄红素总产的变化趋势与茄红素含量的 变化趋势相同只是水平低于CK.其它浓度处理无 论是茄红素含量还是细胞产量都低于CK,所以总 产量也很低. ^?一—口00n\皤《.)_ao_aoQoIIo口oQ 一—口00n\一一oQoII一o^cI,II?o.1 5期梁燕,等:NAA对胡萝卜(Daucuscarota)悬浮细胞茄红素合成的影响791 3讨论 NAA作为重要的植物生长调节剂.在植物细 胞系生产次生代谢物质中的作用早已受到重视.Li— nus等[5]研究了NAA对Morindacitrifolia细胞悬 浮系中蒽醌代谢的影响,发现MorindacitriJolia细 胞在B5+1mg?LNAA的培养基中可以正常积 累蒽醌,而在B5+1mg?L_.2,4一D的培养基中合 成受到抑制或完全消失,认为NAA的存在启动了 蒽醌合成代谢.同时细胞分裂以及基础代谢活性很 低.高的蒽醌含量与低的细胞分裂率及细胞活性相 关联.与之相反,Ozeki等[6]认为NAA对胡萝b细 胞悬浮系中花青素的形成有极强的抑制作用,当细 胞系在不含NAA的培养基中花青素正常积累,一 旦转人含NAA培养基中,不但合成被抑制而且原 合成的花青素也很快消失,认为NAA对花青素合 成抑制的主要原因是其抑制了细胞形态的分化,即 胚状体的形成,提出胚状体的形成与花青素的合成 有相关关系E7,8]. 本实验结果表明,在培养基中加入一定浓度的 NAA对胡萝b悬浮细胞茄红素合成有诱导和刺激 作用,而对细胞的生长具有抑制作用.这一结果与 Linus等[5]的研究结果一致.而且也发现了茄红素 合成代谢活性与细胞生长活性不同步的现象,即茄 红素合成代谢旺盛时细胞分裂以及基础代谢活性却 低.而与Ozeki等[6]的研究结果不同,在整个试验过 程中也没有发现茄红素含量与细胞分化的关系.造 成这种差别的原因可能是目的产物的次生代谢途径 不同,生物反应器的植物种类不同,或细胞的生理状 态不同的缘故. 植物次生代谢是一个极其复杂的过程,受到发 育阶段和环境诸因子的影响,所以,植物体内次生代 谢产物的含量一般都很低.细胞悬浮培养为有用次 生物质的生产提供了一条有效的途径,同时,生产体 系的优化也是一个复杂的过程.本研究结果可以看 出,一定浓度的NAA对胡萝b悬浮细胞中茄红素 的合成代谢有显着的促进作用,与此同时,对细胞的 生长却表现出抑制作用.作为一个高效的生产体系, 不仅要求单个细胞的代谓活性要高,而且要有足够 数量的有效细胞作基础,才能获得高的总产量.因 此,通过NAA来提高细胞系茄红素生产能力时,最 好采用两段式培养,首先在适宜细胞快速生长的培 养基中进行细胞数量的扩张和基础代谢物质的积 累.然后.再转茄红素生产培养基中进行茄红素的 合成与积累.本试验虽然也采用了两段式培养,但重 点在茄红素生产培养基上,对于细胞生长培养基可 进一步筛选和优化,以建立高产高效的培养体系. 参考文献: [1]RAJENDRANL,RA?SHANKARGA,VENKATARA?【ANLV,PRATHIBAKP.Anthocyaninproductioninca11uscuIturesof Da1.-uscarotaasinfluencedbynutr'ientstressandosmoticum[J].BiotechLett..1992,14:707 --712. E23CONSTABELF,SHYLUKJ,GAMBORGOL.Theeffectofhormonesonanthocyanina ccumulationincellculturesofHaplop口lu gracilisI-J].Planta.1991,96:306--309. [3]Yun,JW,KimJH,YooYJ.OptimizatiorLsofcarotenoidbiosynthesisbyeomrollingsucro seconcentration[J].BiotechnologyLetters. 1990.12(12):905?--910. [4]GENGSS(耿三省)tZHANGP(张平),WANGJX王健 萱.Examinationmethodsforcarotenecontentincarrot[J].BeijingAgric"l— turalScience.(北京农业科学),1996.4:24—26. [5]LINUSHW,VANDERPLAS,CONNYEIJKELBOOM&MARCJ.M.HAGEND OORN.Relationsbetweenprimarvandsecondarv metabolisminplantcettsuspensio~s[J].PlantC,TissueandOrganCulture.1995,43:111--116. [6]OZEKIY,KOMAMINEA.EffectsofgrowthregulatorsontheinductionofanthocyaninsynthesisinacarrotsuspensioncuhureEJ]. PlantCellPio1.1986,27:1361--1368. [7]OZEKIY,KOMAMINEA.InductionofanthocyaninsynthesisinrelationtoembryogenesisinacarrotsuspensioncuIture:Correlation ofmetabolicdifferentiationwithmorphologicaldifferentiation[J].PhysiolPlant.1981,53:570--577. 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