【WORD格式论文底稿】槟榔碱对STZ损伤胰岛细胞的保护和修复作用

【WORD格式论文底稿】槟榔碱对STZ损伤胰岛细胞的保护和修复作用 豆丁与论文网:www.docin.com/week114 用槟榔碱对STZ损伤胰岛细胞的保护和修复作 1 1 1 1,2 1,2 1 李中平任文辉张保丽蔺美玲陈红梅赵丽张小郁 1,2 1 (兰州大学基础医学院生理学与心理学研究所; 2甘肃省新药临床前研究重点实验室，兰州市，730000) 摘要?【目的】本实验体外建立链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)所致INS-1胰岛细胞的损伤模型，观察STZ损 伤INS-1细胞的保护和修复作用，并初步探讨其作用机制。【方法】INS-1细胞接种至培养板，培养24小时 后随机分为正常对照组、STZ组、保护组(槟榔碱+STZ)与修复组(STZ +槟榔碱)，药物干预12h后，MTT 法测定细胞增殖，放免法测细胞上清胰岛素释放量，比色法测其丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)， 流式细胞术检测细胞周期。【结果】与STZ组比较，?槟榔碱保护组和修复组OD值明显增加(P<0.01)。? 上述两组槟榔碱明显促进了胰岛素的释放 (P<0.01)。?两组槟榔碱均显著降低了脂质过氧化物产物MDA的 生成 (P<0.01)，提高了T-AOC的含量(P<0.01)。?槟榔碱对INS-1细胞周期有作用，细胞阻滞在S期，但对 sub-G1期影响不明显。?与异搏定组比较，槟榔碱+异搏定组明显促进了胰岛素释放(P<0.01)。【结论】槟 榔碱对STZ损伤INS-1细胞有保护和修复作用，其机制可能是通过降低MDA生成，提高T-AOC能力，影响细 胞周期以及激活钙离子通道介导的。 关键词 槟榔碱;链脲佐菌素;INS-1细胞;胰岛素 中图法分类号 R965.1 文献标识码 A The protection and repairment effects of Arecoline on STZ-injured INS-1 cells 1111,21,21LI Zhongping, REN Wenhui, ZHANG Baoli, LIN Meiling, CHEN Hongmei, ZHAO Li, 1,2ZHANG Xiaoyu 1 ?Institute of Physiology and Psychology, School of Basic Medical Sciences, Lanzhou 2University; Key Laboratory of Pre-clinical Study for New Drugs of Gansu Province, Lanzhou 730000, China? Corresponding author:ZHANG Xiaoyu，Email: zhangxiaoyuly@yahoo.com.cn Abstract: Objective In this experiment, we established STZ-injured INS-1 cells in vitro to observe its 基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 30572428) 作者简介:李中平，1981 年生，男，硕士研究生，主要从事内分泌及能量代谢方面的研究 通讯作者:张小郁，教授，主要从事能量代谢及细胞方面的研究，Email: zhangxiaoyuly@yahoo.com.cn 1 豆丁标准与论文网:www.docin.com/week114 protection and repairment effects on STZ-injured INS-1 cells, and preliminarily explore its mechanism. Methods After INS-1 cells were seeded into culture plates, and incubated for 24 h, they were treated in normal control group, STZ group, protection group?Arecoline +STZ?, and repairment group?STZ + Arecoline), respectively. The cell proliferation was measured by MTT method. Insulin release was measured by radio-immunoassay. Supernatant malondialdehyde (MDA) and total anti-oxidation capability (T-AOC) were determined by colorimetric assay, and cell cycle was assayed by flow cytometry. Results Compared with the STZ group, ? airment groups (P<0.01). ?In above two OD value was significantly increased in Arecoline’s protection and rep groups, Insulin release significantly was increased (P<0.01). ?MDA production was markedly reduced, and T-AOC activity was evaluated in above two groups (P<0.01). ?Arecoline could affect INS-1cell cycle, and cells were blocked in S phase, but it had no effect on sub-G1. ?Compared with the Verapamil group, Insulin release markedly was increased in Verapamil + Arecoline group (P<0.01). Conclusions Arecoline has protection and repairment effects on STZ-injured INS-1 cells, which its mechanisms may be partly via MDA reduction, T-AOC elevation, cell cycle intervention and Calcium ion channel activation. Key words: Arecoline; STZ; INS-1 cells; Insulin 槟榔是我国传统医学中常用的消极、驱虫药物, 槟榔碱是槟榔种子中所含生物碱的主要 成分，近年来对于槟榔的研究及应用逐渐增加，有研究表明槟榔有抗炎、抗过敏作用，槟榔 [1]醇有明显的降低血糖的作用。目前，槟榔碱对STZ损伤胰岛细胞研究尚缺乏完善的研究资 料，本实验体外建立链脲佐菌素(STZ)所致胰岛细胞的损伤模型，研究槟榔碱对STZ损伤胰 岛细胞的保护和修复作用及其机制探讨，为槟榔碱治疗糖尿病提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 实验材料与试剂 INS-1 细胞购自中国典型培养物保藏中心。槟榔碱(Arecoline), 纯度>98%，为陕西旭 煌植物科技发展有限公司生产。异搏定(Verapamil)为兰州制药厂生产。RPMI 1640、胰蛋 白酶均购自 Gibco 公司。STZ、SDS、MTT 均购自 Sigma 公司。新生牛血清为杭州四季青公 司产品。胰岛素放射免疫检测试剂盒购自北京原子高科股份有限公司，胰岛素由兰州市中国 人民解 放 军第一 医 院检验 科 测定。 MTT 法用酶 标仪( PowerWaveX BIO-TEX INSTRUMENTS.INC)测定。总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)均购自南京建成生物 工程研究所，用 UV-VIS 756MC 分光光度计检测。 1.2 方法 2 豆丁标准与论文网:www.docin.com/week114 1.2.1 细胞培养 INS-1，大鼠胰岛β瘤细胞，用含 10%新生牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，1mmol/L丙 5 酮酸钠，50 µmoL/L β-巯基乙醇，5.6mmol/L 葡萄糖，1×10IU/L青霉素和 100 mg/L链霉素 的RPMI1640 培养基，在 37?，5%CO及饱和湿度的恒温箱中培养，每 2-3 天传代一次。 2 榔碱对 INS-1 细胞增殖的作用 1.2.2 槟 5将对数生长期的INS-1细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成密度为1×10个细胞/mL的细胞 -5悬液，实验随机分为正常对照组、STZ(3mmol/L)组、保护组(槟榔碱1×10mol/L+STZ、 -6-7-5槟榔碱1×10mol/L+STZ、槟榔碱1×10mol/L+STZ)与修复组(STZ +槟榔碱1×10mol/ L、 -6-7STZ+槟榔碱1×10mol/L、STZ+槟榔碱1×10mol/L)，将细胞悬液接种至培养板，每组6个 复孔，并设空白调零孔。培养箱中培养24h后，保护组将上述各种药物加入每孔，继续培养 12h;修复组先STZ作用6h再加槟榔碱作用6h，然后各孔分别加5mg/mL MTT，继续培养4h， 37?放置过夜后，用酶标仪测定OD值。 加10%SDS于570nm 1.2.3 槟榔碱对 INS-1 细胞的保护与修复作用 如方法 1.2.2 制备细胞悬液，实验随机分为正常对照组、STZ(3mmol/L)组、保护组(槟 -6-6榔碱 1×10mol/L+STZ)与修复组(STZ +槟榔碱 1×10mol/ L)。取细胞上清，用放免法测 其胰岛素的释放量、按照南京建成试剂盒说明TBA法测定MDA的含量，比色法测定T-AOC 的含量。 1.2.4 槟榔碱对异搏定的作用 -7如方法1.2.2制备细胞悬液，实验随机分为三组:正常对照组、异搏定(1×10mol/L)组、 -6槟榔碱1×10mol/L+异搏定组，每组6个复孔，培养箱中培养24h后将上述各种药物加入每孔， 12h后留取细胞上清用放免法测胰岛素。 1.2.5 流式细胞术 如方法1.2.2 制备细胞悬液，实验分为正常对照组、STZ (3mmol/L )组、槟榔碱 -6(1×10mol/L )+STZ组。将细胞悬液接种至培养瓶中，饱和湿度培养箱中培养24h后将上 述各种药物加入每个培养瓶中，24h后收集细胞(用PBS液洗两次，每次均离心1000rpm 5min， 并弃上清)，再加100μL PBS液混匀并迅速加入70%乙醇1.5ml，置4?冰箱保存，次日送样 上流式细胞仪测试。 1.2.6 统计学分析 所有数据均采用SPSS16.0软件进行统计分析，各项指标均以 x ?S表示，各组之间比较采 用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。 3 豆丁标准与论文网:www.docin.com/week114 2 结果 2.1 槟榔碱对 INS-1 细胞增殖的影响 与正常对照组比较，STZ组OD值明显降低(P<0.01);与STZ组比较，保护组和修复组 -5-6槟榔碱(1×10mol/L和1×10mol/L)的OD值明显升高(P<0.01)。说明槟榔碱促进了INS-1 细胞增殖(结果见表1)。 表 1 槟榔碱对 INS-1 细胞增殖的影响( x ?S, n=6) Table 1 Effects of Arecoline on INS-1 cell proliferation ( x ?S, n=6) 组别 例数 OD值 正常对照组 6 0.256?0.021 STZ组(3mmol/L) 6 0.146?0.021* -5#保护组(1×10mol/L+STZ) 6 0.186?0.014* -6# (1×10mol/L+STZ) 6 0.185?0.013* -7 (1×10mol/L+STZ) 6 0.165?0.013* -5#修复组(STZ+1×10mol/L) 6 0.258?0.026 -6# (STZ+1×10mol/L) 6 0.222?0.051 -7 (STZ+1×10mol/L) 6 0.205?0.032* # 注:与正常对照组比较，*P<0.01;与STZ组比较， P<0.01 2.2 槟榔碱对STZ所致INS-1细胞损伤的保护和修复作用的影响 与正常对照组比较，STZ组胰岛素释放量明显降低，MDA含量明显升高，而T-AOC含 量明显降低(P<0.01)。与STZ组比较，槟榔碱的保护组和修复组胰岛素释放量均明显升高， MDA含量均明显降低，而T-AOC含量均明显升高(P<0.01)。说明槟榔碱对STZ致INS-1细 胞损伤有明显的保护和修复作用，可能与抑制脂质过氧化物的生成，提高抗氧化能力有关(结 果见表2)。 表 2 槟榔碱对 STZ 损伤 INS-1 细胞保护与修复作用的影响( x ?S, n=6) Table 2 Protection and repairment effects of Arecoline on STZ-injured INS-1 cells( x ?S, n=6) 组别 例数 insulin释放量(μIU/L) MDA (nmol/mL) T-AOC (KU/L) 正常对照组 7.94?0.46 3.16?0.39 2.43?0.27 6 STZ组 1.20?0.43* 10.23?0.60* 1.30?0.22* 6 ###保护组 7.30?0.50 4.05?0.62 2.01?0.27* 6 ### 修复组 5.21?0.44* 3.62?0.56 2.17?0.24 6 # 注:与正常对照组比较，*P<0.01;与STZ组比较， P<0.01 2.3 槟榔碱对L-型钙离子通道的影响 4 豆丁标准与论文网:www.docin.com/week114 与正常对照组比较，异搏定明显降低了胰岛素释放(P<0.01)。与异搏定组比较，槟榔 碱+异搏定组胰岛素释放量明显升高(P<0.01)。表明槟榔碱对胰岛细胞的作用可能是部分 通过L-型钙离子通道介导的，并且对L-型钙离子通道有一定的修复作用(结果见图1)。 图 1 槟榔碱对 L-型钙离子通道的作用( x ?S, n=6) x ?S, n=6) Fig 1 Effect of Arecoline on L-type calcium ion channel(# 注:与正常对照组比较，*P<0.01;与异搏定组比较， P<0.01 2.4 槟榔碱对ISN-1细胞周期的影响 与正常对照组比较，STZ 组、槟榔碱+STZ 组 G2 期含量明显下降(0%)，S 期含量增 加，细胞主要阻滞在 S 期。但对 sub-G1 期影响不明显，与正常对照组比较，STZ 组的凋亡 百分率略有增高(分别为 0.247%和 0.743%)。与 STZ 组比较，槟榔碱+STZ 组凋亡百分率 略有下降(分别为 0.743%和 0.473%)，说明槟榔碱对 INS-1 细胞周期有作用(结果见图 2)。 图 2 槟榔碱对细胞周期的影响 Fig 2 Effects of Arecoline on cell cycle A. %G1=48.930, %G2=3.386, %S=47.684, %Tot=0.247 B. %G1=44.996, %G2=0.000, %S=55.004, %Tot=0.743 C. %G1=45.929, %G2=0.000, %S=54.071, %Tot=0.473 (A 正常对照组，B STZ 组，C 槟榔碱+STZ 组) 3 结论 槟榔碱促进了 INS-1 细胞的增殖和胰岛素的释放;对 STZ 所致 INS-1 细胞损伤有明显 5 豆丁标准与论文网:www.docin.com/week114 的保护和修复作用，其机制可能是通过降低 MDA 生成、提高 T-AOC 能力，影响细胞周期 以及激活钙离子通道介导的。 4 讨论 胰岛细胞在维持体内葡萄糖稳态中，起着非常重要的作用。有关胰岛细胞分泌是一个很 复杂的过程，研究表明, 当葡萄糖存在的情况下，葡萄糖通过细胞膜上的载体葡萄糖转运蛋 白2(GLUT2)被转运到细胞内时，激活了细胞内三羧酸循环途径，产生ATP，并与ATP敏 感型钾离子通道结合，使钾通道关闭，膜去极化，L型钙通道开放，钙离子内流，刺激了囊 [8,15]泡内胰岛素的释放。当钙离子内流以及内质网释放钙离子至胞浆后，INS才得以释放。 因此，胰岛β细胞分泌胰岛素是依赖钙离子的，钙离子拮抗剂异搏定有可能抑制胰岛素的分 [2,3]泌并导致糖耐量的降低。本实验结果表明，槟榔碱对异搏定抑制INS-1细胞释放胰岛素有 明显的抑制作用，说明槟榔碱对胰岛细胞的保护和修复作用很可能是部分通过修复钙通道完 成的。 [10,11]氧化应激是机体在遭受有害刺激后，产生了过量的活性氧簇(ROS)，超出了系统 对其消除能力，过剩的ROS对细胞的DNA、蛋白质、脂质等造成了巨大的损伤，同时也影 [12~16]响细胞信号转导，导致胰岛素基因表达障碍，从而降低胰岛素分泌量，导致糖尿病。 ROS可以攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，并因此形成脂质过氧化物，其代谢产物MDA是 [3~5]一种有害物质，可作为评价脂质过氧化反应强弱的指标。本实验我们可以明显的看到， STZ组明显降低了胰岛素的释放，提高了MDA的生成，而降低了T-AOC的含量(P<0.01)。 与STZ组比较，槟榔碱的保护组和修复组胰岛素释放量均明显升高，MDA含量均明显降低， 而T-AOC含量均明显升高(P<0.01)。说明槟榔碱对STZ致INS-1细胞损伤有明显的保护和 修复作用，其机制之一可能与抑制脂质过氧化物的生成，提高抗氧化能力有关。 STZ具有抗肿瘤、抗菌的作用，但其副作用是对胰岛细胞具有高度选择性破坏作用。Liu [5~7,9]等提出STZ可能是通过诱导细胞凋亡的方式特异性地损伤胰岛细胞的。本实验证实了 STZ对胰岛细胞的损伤确实是通过影响细胞周期的方式进行的，并且阻滞在S期。同时，实 验中STZ组凋亡率为0.743而槟榔碱+STZ组的凋亡率为0.473，说明了槟榔碱可能是通过抑制 细胞的凋亡来发挥其保护和修复作用的，究竟槟榔碱是如何发挥其抑制凋亡作用的还需进一 步深入研究。 综上所述，本实验说明槟榔碱明显促进了胰岛素的释放，且对STZ损伤的INS-1细胞有 明显的修复和保护作用，其机制可能是通过降低MDA生成、提高T-AOC能力，影响细胞周 6 豆丁标准与论文网:www.docin.com/week114 期以及激活钙离子通道介导的，为槟榔碱治疗糖尿病提供了一定的理论依据。 参考文献 [1] 申秀丽,段亮亮.槟榔的化学成分及药理学进展[J].宜春学院学报, 2009, 2 (31):95-97. 2+ [2] Valerie Y, Andy K. 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