合方鲫肌间骨骨化过程及形态学观察

合方鲫肌间骨骨化过程及形态学观察 DOI,10.7612/j.issn.10002537.2017.02.006 摘要利用整体骨骼染色和形态学解剖,对合方鲫仔 稚鱼肌间骨出现时期、形态发育以及成鱼肌间骨数目、形态、 分布进行观察.结果表明合方鲫肌间骨是在主体骨骼完全形 成后开始出现,随着生长肌间骨形态逐渐复杂化,肌间骨从 尾部往躯体前端逐渐出现,形态由简单到复杂,尾部末端骨 化明显,肌间骨数量和形态在体轴中呈现梯度差异. 关键词合方鲫,肌间骨,形态发育 中图分类号Q959.46+8文献标识码A文章编号 10002537,2017,02003905 Ossification Process and Morphology of Intermuscular Bones in Hybrids Crucian Carp WANG Jing, ZHANG Qiao, ZHAO Qiong, ZHAO Feiyue, HAN Hui, LIN Yannan, LOU Kaikun, LIU Shaojun* ,State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish, College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China, 1 AbstractApplying the methods of overall skeletal staining and morphological anatomy, in the present study, we investigated the emergence time, morphogenesis, number, shape and distribution of intermuscular bones in the hybrid crucian carp derived from white crucian carp,?,× red crucian carp,?, ,WR,. Our results show that the intermuscular bones of WR appear after the formation of the main body skeleton. During the growth of WR, the shapes of intermuscular bones become more perplexed. The intermuscular bones first appear in the tail and then in the head. Their form change from simplicity to complexity is coincident with the appearance from the tail to the head. In addition, the intermuscular bones in tail highly ossify. A gradient difference pattern along the axis in the number and morphology of intermuscular bones is present. Key wordshybrid crucian carp, intermuscular bone, morphological development 肌间骨是鱼类中特有的一种膜性硬骨,位于肌间隔中, 由肌隔结缔组织不经过软骨阶段直接骨化而成,其功能目前 尚未有定论.肌间骨分为髓弓小骨、脉弓小骨以及椎体小骨 [12].肌间骨的演化过程与鱼类的系统进化有密切联系.目前, 2 国内外对鱼类肌间骨的研究多处于形态方面,如秉志[3]、房连聪[4]、柯中和[5]、吕耀平[6]和BIRD等[7]分别对鲤科鱼类的鲤、淇河鲫、鲢、唇NFDA1、斑马鱼肌间骨的骨化时间及发育进行了描述.这些不同种类鱼的肌间骨骨化时间具有显著差异. 鲫属鲤科,鲤亚科,鲫属.湖南师范大学鱼类发育生物学研究室以雌性日本白鲫和雄性红鲫为亲本进行杂交, 获得了杂交子代二倍体合方鲫.二倍体合方鲫体色为青灰色,具有生长速度快、肉质鲜嫩、抗逆性强等特征[8].利用雌性二倍体合方鲫与雄性四倍体鲫鲤,红鲫,?,×鲤鱼,?,,交配还培育出不育的三倍体合方鲫.本研究选取二倍体和三倍体合方鲫为材料,利用整体骨骼染色法对合方鲫仔稚鱼肌间骨的发育过程进行系统观察,并对成鱼进行形态解剖,分析不同倍性的合方鲫肌间骨数目和形态差异,了解合方鲫肌间骨骨化的基本规律以及形态分布特点,为后期基因敲除培育无肌间骨的优质鲫奠定基础. 1材料与方法 1.1实验材料 本研究中的二倍体合方鲫和三倍体合方鲫均取自教育部“多倍体繁殖及育种技术”工程研究中心.从受精后13天开始,每隔3天选取发育正常的仔、稚鱼作为样本用于骨骼染色.每隔3天取一次样,每次每个样本10尾,用4%多聚甲醛固 3 定,取至肌间骨全部出现为止.用于解剖与形态观察的样本按月龄取材,每次8尾. 1.2合方鲫仔、稚鱼整体骨骼染色 结合柯中和[5]及吕耀平[6]等人的实验方法,对合方鲫仔、稚鱼进行整体骨骼染色.具体操作步骤如下, ,1,用去离子水漂洗样本3次,每次30 min,去除多聚甲醛,,2,将仔鱼放置于TBST 溶液中,50 mmol/L Tris pH 7.4 ,150 mmol/L NaCl,体积分数为0.1%的Triton X100,处理30 min,用去离子水漂洗10 min,以去除残余的TBST溶液,,3,转移标本至1%KOH溶液中浸泡10,30 min,使组织透明,具体时间根据鱼体大小调整,,,4,经透明的标本转移至新的1%KOH 溶液中,滴加茜素红染色液,1 g茜素红溶于100 mL 1%KOH溶液中配制成染色液,,直至溶液颜色变为深紫色,染色1,3 h ,具体时间根据鱼体大小和季节温度调整,,倒掉染色液,用1%KOH溶液洗去组织中残余的染色液,,5,用1%KOH 溶液覆,w标本,加入少量体积分数为1%的双氧水,放置在强光下照射,褪去色素,当标本表面出现气泡时终止反应,倒掉溶液,加1%KOH 溶液漂洗,若鱼体透明度足够或太小则不需要,.染色好的标本放置于倒置显微镜下观察,并拍照记录. 1.3成鱼肌间骨的解剖与形态学观察 实验鱼经测量后,用纱布将整个鱼体包好,置沸水锅中 4 煮10,15 min,具体时间根据鱼体大小调整,.取出,冷却后去除纱布,用镊子小心剥去鱼皮.将鱼体以脊椎骨为界划分为轴上肌和轴下肌两个部分,从尾部向头部顺着肌节用镊子小心地剥开肌肉,依次取出肌间骨.肌间骨按照按从头部到尾部的顺序排列整齐,鱼体左侧肌间骨在上,右侧肌间骨在下.然后用数码相机对已排列有序的肌间骨进行拍照记录. 2结果 2.1二倍体合方鲫和三倍体合方鲫肌间骨的发育和骨化时间 通过肌间骨染色观察后发现,受精后23 dpf,days post fertilization,内仔稚鱼主骨骼逐渐形成,但没有肌间骨存在,图1A,,26 dpf的样本中,仔稚鱼主轴骨骼及附肢骨骼已骨化完全,并首次在尾部出现肌间骨,其形态呈“|”形,30 dpf,尾部处出现多条肌间骨,且都呈“|”形,之后肌间骨不断由尾部向头部方向分化出现,图1B,,33 dpf,肌间骨明显增多,已生长至背鳍后端且尾部出现“Y”形肌间骨,图1D,,40 dpf,肌间骨已明显骨化,形态清晰,数目增多,长度增长,躯干轴上部分出现大量“|”形肌间骨,尾部出现较多“Y”形肌间骨,图1E,,在53 dpf,肌间骨全部出现. A. 20 dpf,鱼苗主体骨骼未发育完全,B.30 dpf,尾部出现较多肌间骨,呈“|”形,C. 33 dpf,尾部肌间骨增多,并出现“Y”形肌间骨,D. 33 dpf,背鳍后端逐渐出现肌间骨,E. 40 5 dpf,躯干轴上肌前端出现肌间骨肌间骨数目增多,长度增长,F. 40 dpf,尾部出现较多“Y”形肌间骨 图1合方鲫肌间骨发育形态学观察,箭头所指为肌间骨, Fig.1Morphological observation of intermuscular bone development of WR ,arrows indicated the intermuscular bones, 2.2二倍体合方鲫、三倍体合方鲫成鱼肌间骨的形态与分布 根据吕耀平等人[6]对肌间骨形态的分类方法,可将肌间骨分为“|”形、“卜”形、“Y”形、一端多叉形、两端两分叉形、两端多叉形和树枝形共7种类型,图2A,G,.通过解剖发现,合方鲫髓弓小骨具有这7种类型,而脉弓小骨多为“|”形、“卜”形、“Y”形和树枝形.从整体来看,髓弓小骨的形态比脉弓小骨更复杂.合方鲫左右两侧肌间骨数目并不完全一致,形态上具有一定差异.在分布上,轴上肌中的肌间骨数目最多,从头部后侧至尾部均存在,轴下肌中的肌间骨相对较少,仅分布于尾柄范围内,图3,表1,. 肌间骨有秩序地埋藏在椎体两侧的肌间隔中,髓弓小骨位于背部肌间隔中,脉弓小骨位于腹部肌间隔中.肌间骨沿运动方向顺着肌隔分布,其长度从躯干部向尾部逐渐缩短. 3讨论 3.1肌间骨的形态与分布 6 肌间骨根据自身直接或间接附着位置可分为髓弓小骨、椎体小骨、脉弓小骨3种类型.董在杰等[9]发现鲢、鳙、团头鲂和异育银鲫这几种鲤科鱼类都含有这3种类型肌间骨.然而并不是所有鱼类都包含这3种类型的肌间骨.本研究发现合方鲫只有髓弓小骨和脉弓小骨,没有椎体小骨.这与柯中和[5]对鲢鱼的观察一致,推测可能与外界环境、基因变异等方面有关系[10].通过解剖观察可以发现,合方鲫鱼体两侧的肌间骨数目并不完全相同,其形态分布也略有差异,但十分相近.这与董在杰[9]所报道的其他几种鲤科鱼类的结果是一致的[9].二倍体和三倍体合方鲫的肌间骨数目无显著差异,P>0.05,,肌间骨总数均为80,90. 肌间骨由肌隔结缔组织不经过软骨阶段直接骨化而成.目前关于肌间骨的具体作用还没有定论,但主流的观点认为肌间骨起着支撑肌肉、传导肌肉力量、帮助鱼体运动的作用[2].本研究通过形态解剖发现合方鲫轴上肌中的肌间骨,的孔疃啵,从尾部至头部均存在,其长度从躯干部向尾部逐渐缩短,轴下肌中的肌间骨仅分布在尾部至腹腔与尾部的过渡区域,靠近腹腔处的肌间骨长度最短,骨化程度最弱.因此,可以推断肌间骨长度差异可能是因肌肉的分布差异造成的,如,轴下肌腹腔部分肌肉较少,且有肋骨支撑,因此肌间骨几乎没有分布,尾部肌间骨分布较多,推测是为了更好地传导肌肉力量,加强鱼尾部游动能力. 7 肌间骨的形态类型多样.在合方鲫中,“卜”形很少出现,且存在另外一种“,”形肌间骨,根据其所处位置及形态,可认为“,”形和“卜”形是在肌间骨演化进程中介于“|”形和“Y”形的过渡类型. 3.2肌间骨的骨化与发育过程 对于肌间骨的出现时机,本研究发现二倍体合方鲫和三倍体合方鲫的肌间骨是在主轴骨骼和附肢骨骼都已骨化完全后才开始出现,图1C,,且髓弓小骨与脉弓小骨都是从尾部向前端依次出现,图1E,,其形态随其生长发育由尾部向头部方向逐渐复杂化,图1F,.在肌间骨的发育过程中,二倍体和三倍体合方鲫的肌间骨发育时间基本相同,一般在26 dpf之后开始出现,但相同时期的三倍体合方鲫体型略长于二倍体合方鲫,因此相同位置的肌间骨三倍体略长于二倍体. 通过骨骼染色观察发现,合方鲫在受精后第26天于尾部出现第一枚肌间骨,形态呈“|”型.与鲢在43 dpf ,体长为10.50 mm,[5],唇NFDA1在35 dpf ,体长为23.67 mm,时首次出现肌间骨[6]相比,合方鲫的肌间骨骨化时间较早,但肌间骨首次出现的部位都在尾部,且形态都为“|”型.姚文杰等[11]对斑马鱼和日本鳗鱼的肌间骨骨化过程进行了深入研究,发现斑马鱼肌间骨骨化主要是从后端到前端区域,而呈典型的鳗状游泳方式的日本鳗鱼肌间骨则是从前往后骨化,提示不同鱼类肌间骨的骨化过程不同可能与其游泳方式不 8 同有关. 合方鲫肌间骨在26 dpf开始骨化,53 dpf骨化完全.肌间骨骨化出现时,鱼体主轴骨骼和附肢骨骼已经骨化完全,鱼体运动觅食能力已基本完善,肌间骨出现前后鱼体运动摄食能力并无显著差异.此外,根据已有研究发现,肌间骨与鱼类的系统演化是密切相关的.从低等到高等真骨鱼类, 肌间骨的形态由简单到复杂然后退化,肌间骨的出现与消失可认为是真骨鱼类演化过程中某一特定阶段的产物.因此,肌间骨实际是一种痕迹器官[5].从理论上说,在合方鲫肌间骨形成之前抑制其骨化出现,培育无肌间骨的合方鲫是可行的.合方鲫肌间骨出现时间为26 dpf,可以该时间点为依据,对该时间点之前和之后的转录组进行测定,分析差异表达基因,筛选出肌间骨发育相关的关键基因,为后期基因敲除培育无肌间骨鱼类奠定基础. 肌间骨的发育过程可以分为两个途径,?“|”形―“卜”形―“Y”形―一端多叉形.?“|”形―“卜”形―“Y” 形―两端两分叉形―两端多叉形―树枝形[5].本研究发现在合方鲫中这两种演化方向都有可能,且不存在直接由“Y”形演化为树枝形的情况.在骨舌鱼总目中最原始的肌间小骨形态是没有分叉的,在此之后的骨鳔总目的肌间骨都是从“|”形肌间骨演化而来的[2].在低等真骨鱼类中肌间骨的演化是从简单的“|”形逐步演化为复杂的“卜”形、“Y”形、两端多叉形和树枝形.在对合方鲫仔稚鱼肌间骨染色观察发现, 合方鲫肌间骨 9 首先在尾部以“|”形出现,然后按照“|”形―“Y”形―多叉形的方向 不断形成.53 dpf后,肌间骨完全出现,随着合方鲫不断生长发育,其肌间骨数目无明显增加,但形态仍不断复杂化.从整体来看,肌间骨从前向后呈现出从复杂到简单的排列顺序.形态越复杂的肌间骨越晚发生,这提示我们,合方鲫肌间骨的发育过程可能包括两个步骤,首先是产生诱导肌间隔结缔组织形态分化的信号,并从躯体前端向尾部呈梯度分布诱导肌间骨前体结缔组织形态分化,然后是产生从尾部向头部呈梯度分布的骨化信号,诱导形态已分化的结缔组织从尾部向躯体前部依次骨化[5].本研究发现合方鲫尾部最后几根肌间骨形态较粗,骨化程度强烈,端部分枝复杂,形态介于“|”形和树枝形中间,这与其他鱼中报道的尾部“|”形肌间骨存在一定差异. 3.3前景展望 培育无肌间骨的优质鲫鱼是鱼类遗传创新的目标之一.经过鱼类远缘杂交技术等遗传改良方法可以获得肌间刺少的优良品种[1213].通过人工诱导雌核发育纯合二倍体使突变基因的性状得以表现,可筛选到无肌间骨草鱼突变体[14].虽然目前对鱼类肌间骨的研究有了很大的突破,但肌间骨的形成是一个复杂的程序性发生过程,这一现象涉及生命活动的各个水平,包括多个信号通路――TGFβ信号通路、Wnt信号通路以及PI3K通路等,多种细胞――间充质细胞、骨原细胞、 10 成骨细胞、骨细胞[15],多个组织――肌肉、结缔组织、血液等,鱼体发育的多个时期――胚胎期、鱼苗阶段、成鱼阶段.因此对肌间骨的研究还有待深入. 随着高通量测序的发展,从基因组、转录组、表观遗传学方面能更加全面分析肌间骨发育的分子遗传机制[1617].利用现代生物技术,尝试通过基因敲除、基因抑制、雌核发育、雄核发育、杂交选育等技术来获得无肌间骨的鱼,丰富鱼类养殖新品种,促进水产养殖业的创新是对肌间骨进行研究的最终目标.本研究首次对杂交鲫肌间骨的发生发育过程进行了研究,从中探究杂交对肌间骨形成的影响,为后期无肌间骨鱼类的研发奠定基础. 参考文献, [1]孟庆闻, 苏锦祥, 李婉端. 鱼类比较解剖[M]. 北京,科学出版社, 1987. 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