水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达

水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂达载体的构建与表达 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的 构建与表达 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 【摘要】 目的, 构建水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂,leech derived tryptase inhibitor,LDTI,原核表达载体,并在大肠埃希菌,BL21(DE3),中高效表达重组蛋白。方法, 以含有目的核酸序列的质粒为,通过PCR技术扩增出LDTI蛋白编码序列,构建含目的片段的T克隆载体以及原核表达载体pET28aLDTI重组质粒亚克隆,进行限制性内切酶双酶切鉴定和核酸序列分析,然后将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导,以TricineSDSPAGE和蛋白质印迹方法分析和鉴定重组蛋白的表达。结果, 成功构建了水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂原核表达载体pET28aLDTI,并获得相应的融合蛋白,本实验证明, LDTI在大肠埃希菌菌中高效表达,在温度为33?,IPTG浓度为0.7 mmol,诱导时间为1 h,所表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的15%左右。结论, 成功构建了LDTI原核表达载体并使其在原核系统中高效表达,为进一步研究水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂的生化特性和生物学功能奠定了良好的基础。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 【关键词】 构建, 原核表达, 水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂 ,Abstract, Objective: To construct the prokaryotic expression vector of LDTI gene and express LDTI protein in E.coli,BL21(DE3),.Methods, A 141 bp fragment of the LDTI gene was amplified by PCR technique from the template of the plasmid containing LDTI gene, then it was cloned into T vector.After amplified and digested with restricted enzyme, the target fragment was subcloned into plasmid pET28a, the recombinant plasmid was transferred into E.coli Jm109.The fragment was identified by restricted enzyme and nucleotide sequencing.The recombinant expression plasmid containing LDTI gene was transformed into E.coli BL21(DE3) and the target protein expression was induced by isopropylBDthiogalactopyranoside(IPTG) and confirmed by TricineSDSPAGE and Western blot. Results, The recombinant plasmid of pET28aLDTI was obtained by PCR and identified by sequencing.The target protein was expressed abundantly in E.coli BL21(DE3) and the yield of LDTI protein was accounted for approximately 15% of germ proteins after one hour′s induction by 0.7 mmol/L IPTG at 33?. Conclusion, pET28aLDTI was successfully constructed and can highly express objective protein in BL21(DE3), which will further help to the bioactivity of LDTI studying. DOC格式论文,方便您的复制修改删减 ,Key words, construction; prokaryotic expression; leech derived tryptase inhibitor 类胰蛋白酶抑制剂,tryptase inhibitor,TPI,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族,具有稳定肥大细胞的作用,1,,对于肥大细胞介导的变态反应性疾病如哮喘、变应性鼻炎等有潜在的治疗作用。类胰蛋白酶是肥大细胞分泌的最丰富的介质之一,在多种疾病的进程中起到诱导作用,2,。类胰蛋白酶抑制剂通过抑制类胰蛋白酶活性来达到治疗疾病的目的。研究证实,3,,水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂与人β类胰蛋白酶具有高度亲和力并以此抑制其活性。我们运用DNA重组技术,构建了水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂原核表达质粒,通过双酶切以及核酸序列分析进行分析鉴定后将其转化入大肠埃希菌BL21,DE3,中,使其在原核系统中高效表达,为下一步分析LDTI蛋白的特性与功能奠定了良好的基础。 1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 酶及主要试剂 DNA 标准参照物、Taq酶、T4连接酶、Hind ?和Nde?购自TaKaRa公司,凝胶纯化试剂盒,质粒小量提取试剂盒购自Qiagen公司,TRICINE及低分子量蛋白质标准品购自Sigma公司,蛋白质印迹一抗为抗HIS Tag的鼠单克隆抗体,IgG1,,购自Novagen公司。其他常用试剂为国产或进口分析纯试剂。 1.1.2 菌种及质粒 pMD18T载体购自日本TaKaRa公司,含有目的LDTI编码序列的质粒由大连TaKaRa公司合成。大肠埃希菌 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 JM109,BL21(DE3)及表达载体pET28a为本校张忠芳老师馈赠。 1.1.3 核酸序列分析 由上海英骏公司采用ABI377全自动测序仪器和配套的试剂盒测序。1.2 方 法 1.2.1 引物与合成 根据LDTI氨基酸序列推导出目的核酸序列并设计引物,由上海英骏生物技术有限公司合成。上游引物序列,5′GGCATATGAAAAAAGTTTGCGC3′,下游引物序列,5′TAAGCTTTTACGTCGGGCAGGA3′。其中,为了方便克隆操作,在上下游引物中加入了限制性内切酶Nde?,Hind ?的酶切位点,以便LDTI核酸片段定向克隆于相应的酶切位点上,保证阅读框架的正确性和完整性。此外在限制性内切酶Hind ?,Nde?酶切位点引入1至2个保护性碱基,以利于酶切反应进行。 1.2.2 LDTI片段扩增 PCR反应体系为,DNA 0.3 μl,Taq酶2 U,10×缓冲液2 μl,dNTP 1.6 μl和引物0.4 μl,加DDW至总体积20 μl。 PCR扩增条件,预变性94? 2 min,94? 1 min ?62? 1 min ?72? 1 min,25个循环,反应结束前72?延伸10 min。 1.2.3 构建T载体克隆 按照凝胶纯化试剂盒操作流程纯化PCR产物后与T载体连接,转化感受态大肠埃希菌JM109,经过蓝白斑筛选,挑选单个阳性克隆,在100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中过夜生长,提取质粒,进行双酶切和测序鉴定。 1.2.4 构建原核表达载体亚克隆 将T载体克隆双酶切后目的片段及pET28a双酶切后片段经琼脂糖凝胶电泳,回收,按照凝胶纯化试剂盒操作流程纯化PCR产物,将纯化后的两核酸片段16?连接,过 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 夜。转化感受态细菌JM109,挑取阳性克隆,接种于含100 μg/ml卡那霉素的LB培养基中过夜生长,按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取质粒,进行双酶切和测序鉴定。 1.2.5 LDTI蛋白的诱导表达 将重组质粒pET28aLDTI转化BL21(DE3),挑取单个菌落,接种于3 ml含100 μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养过夜。以1?50比例取过夜培养物接种于含100 μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养,至其D(600 nm)=0.6时加入IPTG,终浓度0.7 mmol/L,继续培养,分别于1,2,3,5,10 h取1 ml菌液。以不含重组质粒的空白菌培养物和未加IPTG诱导的重组质粒转化细菌培养物为对照。 1.2.6 LDTI重组蛋白的电泳分析与蛋白质印迹鉴定 将细菌培养物1 ml于4 ?离心收集细菌,加适当的蛋白上样缓冲液,煮沸5 min后进行15,TRICINESDSPAGE,经考马斯亮蓝染色,确定蛋白有无表达。再以蛋白质印迹方法鉴定此蛋白。 2 结 果 2.1 LDTI核酸片段扩增及纯化 将PCR产物进行1.4%琼脂糖凝胶电泳,可见到预期的141 bp大小的目的核酸片段,图1,。 2.2 T载体克隆构建 将纯化的PCR产物与T载体连接后转化感受态大肠埃希菌JM109,对目的片段大量扩增。按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取质粒,进行测序鉴定,证实目的片段以正确的序列插入T载体,图2,。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 2.3 LDTI核酸片段原核表达载体的亚克隆 将酶切纯化后的目的片段与表达载体pET28a连接,转化感受态大肠埃希菌JM109,获得含有pET28aLDTI重组表达质粒基因工程菌。该重组质粒大小为5.44 kb,经Nde?+Hind ?双酶切后,切出大小与理论设计可切出大小5.306 kb+0.134 kb基本相符的两条带,图3,。所筛选出的阳性重组质粒经进一步测序证明,所插入的核苷酸序列与目的片段序列完全一致,阅读框架也正确无误,图4,。证实克隆到了全长的LDTI编码序列,且无任何碱基突变,说明pET28aLDTI重组表达质粒构建成功。 2.4 LDTI重组蛋白的诱导表达以及鉴定 将重组质粒pET28aLDTI转化BL21(DE3), IPTG,终浓度0.7 mmol/L,继续培养,分别于1,2,3,5,10 h取1 ml菌液进行检测。pET28aLDTI在诱导1 h后即可见到蛋白高效表达,占总蛋白的15%左右,在分子量约6.8 kD处有一特异性带出现,与预期LDTI重组蛋白分子质量相符合。随着诱导时间延长,未见蛋白表达量明显增加,图5,。 M,蛋白分子质量标准,L1,BL21(DE3)空白菌,L2,pET28aLDTI转化BL21(DE3)未经IPTG诱导,L3,7,pET28aLDTI转化BL21(DE3)经IPTG诱导,t=1,2,3,5,10 h,L8,蛋白质印迹鉴定结果 3 讨 论 变态反应性疾病是危害人类健康的一大类疾病,其发病率在西方约 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 占总人口45%,并有逐年上升的趋势,4,。肥大细胞在变态反应性疾病的发病机制中起重要作用,其作为变态反应性炎症的一个重要起始效应细胞已被人们广泛接受,5,,其含量最多的分泌性介质类胰蛋白酶是近年来研究的重点。类胰蛋白酶已经被发现与多种疾病有关,6,,几乎是专一性地由肥大细胞分泌,可以作为肥大细胞及其活化的特异性标志,7,,因此其抑制剂很有希望成为一类新的抗炎药物。对类胰蛋白酶抑制剂的研究也成为近10年来肥大细胞研究领域的热点之一。研究表明,类胰蛋白酶抑制剂可降低哮喘患者对吸入性过敏原的哮喘样反应,8,,也有望成为治疗纤维变性疾病如原因不明的肺纤维变性疾病或者硬皮病以及炎症性肠病的一个新药,9,。 目前国内尚无关于重组水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂基因工程的报道。本研究应用所设计的上游引物Nde?酶切位点及下游引物Hind ?酶切位点,将编码LDTI氨基酸序列的核酸片段定向连接到质粒pET28a的相应位点,保证了插入片段方向的正确性。然后以含有LDTI目的序列的质粒为模板进行PCR扩增,获得了126 bp大小的目的片段LDTI全编码区,首次构建了重组质粒pET28aLDTI亚克隆,经过双酶切以及测序,证实获得了pET28aLDTI重组质粒,而后以IPTG诱导,使其在大肠埃希菌中得到表达。由于目的蛋白分子量较小,本实验应用15,TRICINESDSPAGE 进行小肽电泳,经考马斯亮蓝染色以及蛋白质印迹方法检测、鉴定蛋白表达,最终获得了大小约为6.8 kD的明显特异性目的蛋白条带。LDTI蛋白的成功表达为进一步研究LDTI蛋白的特性与功能奠定了良好的基础。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 ,本文图2,图4见彩色插图, 【参考文献】 ,1, 谢 华,何韶衡.特异性类胰蛋白酶抑制剂双苯甲脒对肥 大细胞分泌的调控作用,J,.细胞与分子免疫学杂志,2003,19 ,1,:100-102. ,2, Caughey GH.Mast cell tryptases and chymases in inflammation and host defense,J,.Immunol Rev,2007,217(1):141-154. ,3, Arolas JL, Bronsoms S, Aviles FX, et al.Oxidative folding of leechderived tryptase inhibitor via native disulfidebonded intermediates,J,.Antioxid Redox Signal, 2008,10(1):77-85. ,4, Mark B, Abelson MD, Andrea Leonardi MD, et al.The mechanisms, diagnosis and treatment of allergy,J,.J Rev Ophth,2002,9(4):75-80. ,5, Church MK, Bradding P, Walls AF, et al.Human mast cells and basophils,M,?ABkay.allergy and allergic diseases Blackwell:Oxford,1997:149-170. 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