局部使用作用于肿瘤坏死因子α的反义寡核苷酸对实验性小鼠单疱病毒性脉络膜视网膜炎的影响

局部使用作用于肿瘤坏死因子α的反义寡核苷酸对实验性小鼠单疱病毒性脉络膜视网膜炎的影响 局部使用作用于肿瘤坏死因子α的反义寡核苷酸对实验性小鼠单疱病毒性脉络膜视 网膜炎的影响 中华眼底病杂志2006年7月第22卷第4期ChinJOculFundusDis,July2006,Vol22,No.4 局部使用作用于肿瘤坏死因子的反义 寡核苷酸对实验性小鼠单疱病毒性 脉络膜视网膜炎的影响 梅海峰邢怡桥郭颖ArndHeiligenhaus 245 ? 实验研究? 【摘要】目的观察局部使用作用于肿瘤坏死因子a(TNF—a)的反义寡核苷酸对实验性单疱病毒性 脉络膜视网膜炎病理过程的影响.将5O只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组25只. 将单纯疱疹病毒一I型(HSV—I)注入所有小鼠右眼(注射眼)前房内,建立单疱病毒性脉络膜视网膜炎的小 鼠模型.实验组中分别于HSV—I型感染前1d,感染后1,4d,将异硫氰酸荧光素标记的作用于TNF—a的 反义寡核苷酸2l注射于感染小鼠的左眼(非注射眼)球结膜下;对照组则于相同的时间段内注射等量的 磷酸盐缓冲液于感染小鼠的左眼(非注射眼)球结膜下,观察两组小鼠眼部的炎症改变并根据有无前房炎 症反应,瞳孔和虹膜血管扩张,白内障形成,玻璃体混浊等行临床评分.于病毒感染后10d处死所有小鼠, 观察其组织学变化并采用酶联免疫吸附试验(EL1sA)测定小鼠脉络膜视网膜的TNF—a含量.结果感 染后,两组小鼠右眼均表现为急性炎症改变;实验组小鼠左眼炎症反应临床评分明显小于对照组.组织学 观察结果:对照组有12只小鼠左眼表现程度不等的坏死性脉络膜视网膜炎,实验组有2只小鼠左眼表现 为轻度的脉络膜视网膜炎,两组间视网膜,脉络膜及睫状体部位炎性细胞计数差异有统计学意义(P< 0.05),而前房,玻璃体腔及虹膜部位无明显差别(P>O.05).ELISA测定结果:实验组脉络膜视网膜TNF— a含量为(60士1.25)pg,对照组脉络膜视网膜TNF—a含量为(305士1.03)Pg,两者相比差异有统计学意义 (P<O.05).结论采用作用于TNF—a的反义寡核苷酸局部治疗小鼠单疱病毒性脉络膜视网膜炎,能明 显降低感染小鼠眼内细胞因子TNF—a的含量,减轻眼内脉络膜视网膜炎症反应. 【关键词】单纯疱疹病毒I型;寡核苷酸类,反义;脉络膜视网膜炎 中图分类号:R774.1R446-39 EffectoftopicaltreatmentwithantisenseoIi窖onucIeotidestargetingtumornecrosisfactor —aon experimentalHSV一1一inducedchorioretinitisinmiceMEIHai—feng,XINGYi—qiao,GUOYing,eta1. DepartmentofOphthalmology,RenminHospitalofWu-hanUniversity.InstituteofOphthal mology, MedicalC0llegeofWuhanUniversity,Wuhan430060.China Correspondingauthor:XINGYi-qiao,Email:Xing— yq@l63.net 【Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectoftopicaltreatmentwithantisenseoligonucle otides (ASON)targetingtumornecrosisfactor—a(TNF—ix)onthepathologicalprocessofexperimentalherpes simplexvirustype—I(HSV— I)inducedchorioretinitisinmouseeye.MethodsFiftyBALB/cmice wererandomlydividedintoexperimentalandcontrolgroup(twentyfivemiceineachgroup).HSV chorioretinitismodelwasinducedineachmousebyinoculating1×10plaque— formingunits(pfu)of HSV一 I(K0Sstrain)intoanteriorchamberoftherighteye.Inexperimentalgroup.Fluorescein isothiocyanate(FITC)-labeledAS0NtargetingTNF—a2"1wereinjectedsub— conjunctivaintheleft eyeldaybeforeand1and4daysaftertheinfection;whilephosphatebuffersolutionwasinjectedinthe samewayincontrolgroup.Theinflammationchangesoftheeyesinthe2groupswereobservedandthe cliniealgradeswereassessedaccordingtotheextendsofanterior— chamberinflammation.vasodilatationof corneaandiris,formationofcataract,andvitreousopacity.AIlofthemicewereexecuted10daysafterthe infectionandwereobservedhistologically.ThecontentsofTNF— ainretinaandchoroidweremeasuredby enzyme— linkedimmunobsorbentassay(ELISA).ResultsAftertheinfection.acuteinflammation appearedintherighteyesinbothgroups.Theinflammationofthelefteyesinexperimentalgroupwas significantlymilderthanwhichinthecontrolgroup.Twelvelefteyeshadnecroticchorioretinitisindiffer一 作者单位:430060,武汉大学人民医院眼科(梅海峰,邢怡桥,郭颖);德 国埃森大学临床医院眼科(ArndHeiligenhaus) 通讯作者:邢怡桥,Email:Xing— yq@163.net 246中华眼底病杂志2006年7月第22卷第4期 ChinJOculFundusDis,July2006,Vol22,No.4 entdegreesinthecontrolgroupwhile2lefteyeshadmildchorioretinitisintheexperimentalgr oup.The differenceofthenumberofinflammatorycellsbetweenthe2groupswasstatisticallysignifica ntinretina, choroid,andciliarybody(P<O.O5)andwasnotobviousinanteriorchamber,vitreouscavit y.andiris(P> O.O5).ThecontentofTNF—ninchoroidandretinawas(60士 1.25)pgintheexperimentalgroupand(305 士1.O3)pginthecontrolgroup(P<0.05).ConclusionsTNF—nASONtreatingHSV— Iinduced chorioretinitismayreducethecontentofTNF— ninaffectedmiceeyesanddecreasetheinflammatory reaction. [Keywords]HerpessimplexvirusI;0ligonucleotides,antisense;Chorioretinitis 单纯疱疹病毒一I型(HSV一1)是临床上引起葡萄 膜炎较为常见的病因之一,其治疗方法除了有效地抗 病毒治疗以外,可能还包括局部或全身皮质类固醇激 素治疗,但仍存在容易复发的问,因此探求新的治疗 途径成为眼科医生面临的任务.这些新的治疗途径包 括细胞因子抑制剂,抗代谢药物的应用,细胞毒性药物 以及一些生物制剂的应用[1].基因治疗是日益流行的 治疗眼部炎症的方法之一,某些基因序列的反义寡核 苷酸技术已进入临床研究并日渐成熟[2].我们采用 HSV—I型建立脉络膜视网膜炎的动物模型,并运用作 用于肿瘤坏死因子a(TNF—a)部分基因序列的反义寡 核苷酸行局部治疗,观察其对单疱病毒性脉络膜视网 膜炎动物病程的影响,从而为临床采用反义寡核苷酸 技术治疗葡萄膜炎提供有益的探索. 1材料和方法 1.1单疱病毒性脉络膜视网膜炎模型的建立 5O只雌性BALB/c小鼠由德国Coaven动物实验 室提供,鼠龄为6,8周,体重16,18g,健康无眼病. 经腹膜腔内注射2rng盐酸氯胺酮和400ng盐酸甲哌 卡因麻醉后,手术显微镜下采用1×10斑点形成单位 HSV一1[KOS株]注射人小鼠右眼前房内,建立单疱病 毒性脉络膜视网膜炎模型. 1.2实验 5O只小鼠按随机数字表法随机分为实验组和对 照组,每组25只小鼠.实验组小鼠分别于HSV一1感染 前1d,感染后1,4d在手术显微镜下,左眼球结膜下 注射100mmol/L异硫氰酸荧光素标记的作用于 TNF—a的反义寡核苷酸(每只小鼠约2/z1);对照组小 鼠分别于相同时间段内于左眼球结膜下注射等量的磷 酸盐缓冲液. 1.3临床观察及组织学检查 小鼠感染后常规饲养,感染后2d开始手术显微 镜下观察小鼠的双眼眼部改变,并进行临床评分.前房 炎症反应,瞳孔和虹膜血管扩张,白内障形成,玻璃体 混浊相应记为O,4A+分[3]. HSV一1感染小鼠后10d,采用颈椎脱臼法处死所 有小鼠,立即剜出眼球,每组取15只小鼠的双眼置于 4福尔马林液中固定6h,常规脱水后,包埋于石蜡 中,将这些石蜡标本制成5m的切片,按苏木素一 伊红(HE)染色,400倍光学显微镜下行前房,虹膜,睫 状体,玻璃体腔,脉络膜及视网膜6个部位的炎性细胞 计数. 1.4脉络膜视网膜中TNF—a含量的测定 处死小鼠后,每组取10只小鼠左眼,冠状方向去 除角膜,尽可能除去晶状体及玻璃体后于一8OC液氮 中保存,参照文献[4]的方法加3,5倍体积试剂盒样 本稀释液,冰浴匀浆1rain后,4C下以离心半径5cm, 2000r/min离心10rain,取上清液,按标准酶联免疫 吸附试验(ELISA)测定各组标本中脉络膜视网膜中 TNF—a含量. 1.5统计学处理 临床评分采用fisher检验方法,组织学观察 各部位炎性细胞计数(个)结果采用t检验方法分析, P<O.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1临床观察结果 HSV—I感染小鼠后,注射眼均表现为严重的炎症 反应:虹膜血管扩张,前房大量炎性渗出物,瞳孔扩大, 晶状体混浊等,临床评分为3,4分. 实验组25只小鼠中有3只小鼠左眼表现出炎症 反应,发病率为12;临床评分22只眼为0分,3只眼 为1,2分.对照组25只小鼠中有18只小鼠左眼表现 出炎症改变,发病率为72;临床评分11只眼为O,2 分,14只眼为3,4分. 2.2组织学观察结果 HE染色组织切片光学显微镜下可见HSV—I注 射眼眼部表现为:角膜基质水肿,前房内广泛炎性渗出 物及炎症细胞,虹膜及睫状体结构紊乱,大量炎症细胞 浸润(图1).玻璃体腔无明显炎症细胞,脉络膜视网膜 结构基本正常,亦未见明显炎性细胞(图2). 实验组小鼠非注射眼有2只眼出现炎性细胞,主 要位于玻璃体腔,表现为角膜轻度水肿,前房内可见数 ??^干7HI1iJ【Iri…iJil_『LI12n?,IJ 捉封?胞.?l膜哇状体结恂疆水l-r【0)耻璃怍 胜情儆少赴性细1】i=l注搁局肺?匏帆H脱构 轻度索乩I】'*I}l结掏iI常尤毙 纠盹潜删 计}纽小lI=}制眦l!HilH-?__!f碍拄耻灯 , 死脉帑膜m阿1】5王旋政,燕舶膜辑懂水肿.简房l少最 毙胞.I[啦状悼+蛙书l】常.少蹙细胞眭 ({【1)破璃体后撇…脱斑r芏却I胞浸桐.脉络恺 观网情太,常nl{r构.l水肿.夫鼬毙细胞 浸(冬1n)",r构蚺奉1r肯 炎『I胞II数终统【J肇址叫端显组睫状 悱,肺惟,闷雌他仃统计(ll!. 1)R.1Il;,'i}(11)(【荆7) 2JH承络恺fll_『l女一1I\F"堑化结 11I1s^愉洲小 刚JINi(…)? 啦【小LT,l左【肥脉噍观 臃?胆l叫TNF"世c: H二非抖仃统Il学辽" pH对照,I,鼠叭 JII咐组fr1 ?!jlV(?一iqxiivI1幂Jnr血作野宴验动物硭 研究跑痫感染帆制的动物模18i年 wt锋乖?小鼠力j:螗功物谴正JVctIJv ,? 目Iq邋mIIs,『_{mn}#"m 女?^m#"? c'1'nIl?l目2 IIsvM^』jl'0伪#:? *f}1mM一iIHi目 3H,tn?mm} ?lq_『々mmII'JIl~0*似iil H】111J目蝣[}Hv?『lH,?1 ?m?[_l…mm?一# 目7{?I』{川I一似i1#I" 【0【f毗l…J ?nJ"蚓【,lI?_J._】』.,lJ 7【li1rnt…1f【I)-lliiij?…f【rlT…Irv …I?IhL"rf|_IT}ITllTI1I?'rfj?『【1I『ITI.Ir ?Il~【『vY.f1f…J,?…Ir'1…『L… T1T{11…L,…1c11Ir1,…t{h Il11-r(#…l?rf?1iIv,【【0 动l枷髓:将?vJ注削凡小吼]H眦廊向.},制 liRJ?t前部加曲脱提.1?I桃I叫l腱+_I划,亚.注目J II?订5彻曲嘴赴明.十拄珊坏死}脱 觎网哦凝发,l|帆r制州址fisVIfFq凡l 哪内.病可}I曲过渡小卅缂Jj苴,专划赶脯? 通r』I肘毗说经传导到}【时限.刊 坏脉络畦视膜捉.H矾?J均趁瘸饥制尚下 浦楚.『能为}I,1Ijl一的特的?』胞饱崆臣府. 绝蛙细0乜【幢细呲f刊jc过艇要作 _1] , , : ,,,一,…撼一一,__茎一黔,".一_薹???,…, R^4_l^641 一一i—L 248中华眼底病杂志2006年7月第22卷第4期 ChinJOculFundusDis,July2006,Vol22,No.4 TNF—a是由单核巨噬细胞产生的一种重要的细 胞因子,有研究表明玻璃体腔内注射TNF—a可以引起 血眼屏障的破坏,房水中蛋白含量增加,一些炎性细胞 如多形核细胞,单核细胞,巨噬细胞和淋巴细胞,进入 房水和玻璃体腔,从而发生明显的全葡萄膜炎;特别是 小鼠HSV—I感染后通过观察其眼内TNF—amRNA 的广泛存在,推测TNF—a可能在HSV—I诱导的小鼠 眼内炎症(包括葡萄膜炎)中起重要作用[g].因此设想 抑制TNF—a的产生可能有效地治疗葡萄膜炎.目前临 床上已有采用抗TNF—a的抗体药物inflixamb[1及 etanercept[1?治疗葡萄膜炎的报导,但这些直接作用 于TNF—a抗体的重复使用可能引起潜在的系统副作 用,因此有人建议探求其它抑制TNF—a的药物[1引. 反义寡核苷酸技术作为一种基因治疗方法具有高 度的选择性和特异性,尽管还存在对靶基因了解不够, 基因导入效率等尚待解决的问题,反义技术现已被应 用于临床上多种疾病的治疗.Wasmuth等D3]采用作 用于TNF—a的反义寡核苷酸局部治疗HSV—I诱导 的角膜炎显示它能明显抑制HSV一1感染眼的TNF—a 的释放,从而改变角膜炎的病程;研究还显示作用于 TNF—a的反义寡核苷酸对系统抗病毒作用没有影响. 我们采用的是德国Biognostik公司提供的带有标记的 反义寡核苷酸,其基因序列为:CGAAGTTCAGTA— GACAG,它选择性地作用于小鼠TNF—a的3OO,316 碱基对,两者特异性地结合可以减少小鼠体内TNF—a 的含量. 我们采用HSV—I诱导鼠眼产生脉络膜视网膜炎 性反应,建立VonSzily模型,并通过局部使用作用于 TNF—a的反义寡核苷酸,观察其对小鼠眼病理过程的 影响.本研究结果显示:与对照组相比,实验组小鼠非 注射眼脉络膜视网膜炎的发生率明显降低,且其炎症 反应轻,尤以视网膜,脉络膜及睫状体部位表现明显. 提示作用于TNF—a的反义寡核苷酸与TNF—amRNA 特异性地结合,抑制了眼内TNF—a的生成,进而减轻 眼内炎症反应,有效地改善了葡萄膜炎的病理过程.本 研究结果为临床上治疗葡萄膜炎的新方法提供了有益 的探索,反义技术这种基因疗法将来有可能在葡萄膜 炎的治疗中发挥重要作用. 4参考文献 1MarcJ,LustigET,CunninghamJ.Useofimmunosuppressive agentsinuveitis.Curr0pinOphthalmol,2003,14:399—412. 2VitraveneStudyGroup.Arandomizedcontrolledclinicaltrialof intravitreousfomivirsenfortreatmentofnewlydiagnosed peripheralcytomegalovirusretinitisinpatientswithAIDS.AmJ Ophthalmol,2002,133:467-474. 3HartungHP.HeinigerK.Non—specificmechanismsof inflammationandtissuedamageinMS.Reslmmunol,1989,140: 226—233. 4RosengrenS,FiresteinGS,BoyleDL.Measurementof inflammatorybiomarkersinsynovialtissueextractsbyenzyme— linkedimmunosorbentassay.ClinDiagnLablmmuno1.2003,10: 1002—1010. 5VonSzilyA.Experimentelleendogeneinfekti0nsurtragungyon bulbusZubulbus.KlinMonatsblAugenheilkd,1924,72:593—598. 6WhittumJA.McCulleyJP,NiederRornJY,eta1.Oculardisease inducedinmicebyanteriorchamberinoculationofherpessimplex virus.InvestOphthalmolVisSci,1984,25:1O65—1O73. 7LewisML.WilliamW.CulbertsonM.etaI.Herpessimplexvirus type一1:acauseoftheacuteretinalnecrosissyndrome. 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(收稿Et期:2005—08—19) (本文编辑:朱敏) 国家级继续医学教育项目:黄斑水肿的基础和治疗新进展学习班招生通知 ? 肖皂,? 经卫生部审定由首都医科大学附属北京友谊医院眼科承办黄斑水肿的基础和治疗新进展学习班,特聘请日本和北京的专家进 行专题讲座,同时欢迎参加者携带疑难病例进行讨论,讲解.此项目为2006年国家级继续医学教育项目{2006—07—02一O17(国)],学 习结束后颁发卫生部承认的国家级继续教育证书,授予I类学分6分. 开班时间:2006年1o月27日至1o月29日,开班地点:首都医科大学附属北京友谊医院,报名截止日期:2006年9月30日,费 用:学习班培训费,资料费共300元,食宿费用自理(统一安排).联系人:黄映湘,谢芊;电话:(010)63014411-8414,63139054, 63138414;地址:北京市宣武区永安路95号北京友谊医院眼科,邮编:100050Email:yankeyouyi@sina.com.. 首都医科大学附属北京友谊医院