禽用中药抗病毒冲剂的研制与应用

禽用中药抗病毒冲剂的研制与应用 我国养禽业虽已走向集约化生产之路，但由于种种原因家禽发病 率仍居高不下，特别是鸡的新城疫、法氏囊传染、传染性支气管炎等 病毒性疾病给养禽业造成很大的经济损失。市场上虽有多种治疗病毒 性疾病的药物，但由于质量和使用不当，导致大量和反复用药，造成 禽产品药物残留超标，从而对人类身体健康和环境造成许多不利影 响。为解决这一难题，我们在祖国传统中兽医理论指导下，结合现代 医学的研究方法，经过对组抗病毒制剂组方、剂型与剂量、生产工艺 等的严格筛选，研制出“禽喘康颗粒冲剂”。采用鸡胚病毒抑制试验， 研究并取得了“禽喘康颗粒冲剂”杀灭病毒的时间和浓度；经过临床 试验及田间推广试验研究了“禽喘康颗粒冲剂”对人工感染和自然发 病的病毒性与细菌性疾病的防治效果；经过毒性试验研究了对家禽的 毒副做作用；同时还进行了“禽喘康颗粒冲剂”的稳定性试验并起草 了质量，取得了满意的效果。 1 依据传统中兽医的理、法、方、药与现代中药的研究成果，结合 家禽病毒性传染病的临床症状，参考众多资料，选定金银花、连翘、 大青叶、板蓝根、浙贝、杏仁、黄芩、大黄、薄荷、芦根、牛旁子、 桔梗、荆芥、豆豉、竹叶、甘草等10余种具有清热解毒、止咳化痰、 平喘的中药材作为处方选用药。由单味、复味、多味中药各组成3个组方，共9各组方，通过人工混合感染传染性支气管炎和鸡副嗜血杆 菌的疗效对比试验，分两步进行最佳组方的筛选试验。第一步从9个组方中筛选出3个组方，第二步再从第一步筛选出的3个组方中筛选出1个最佳组方，作为“禽喘康颗粒冲剂”的定型方：金银花30g 大青叶30g 杏仁20g 板蓝根30g 桔梗30g 浙贝20g 黄芩20g 连翘30g 甘草10g（见表1、表2）。 1 表1：组方初步筛选结果 组别 1组 2组 3组 4组 5组 6组 7组 8组 9组 空白 组 试验数30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 （只） 发病数16 15 16 14 15 17 16 15 17 16 （只） 发病率53.3 50.0 53.3 46.7 50.0 56.7 53.3 50.0 56.7 53.3 （%） 死亡数10 9 10 8 8 8 6 6 5 13 （只） 死亡率33.3 30.0 33.3 26.7 26.7 26.7 20 20 16.7 43.3 （%） 存活数20 21 20 22 22 22 24 24 25 17 （只） 存活率66.7 66.7 70.0 73.7 73.7 73.7 80.0 80.0 83.3 56.7 （%） 显效时间7 7 7 6 5 5 4 4 3 14 （天） 症状消失12 13 14 10 11 10 7 7 7 21 时间（天） 表2、不同方剂的疗效对比 组 别 7 组 8 组 9 组 空白组 试验数（只） 30 30 30 30 发病数（只） 13 14 13 14 发病率（%） 43．3 46．7 43．3 46．7 存活数（只） 24 25 27 18 死亡数（只） 6 5 3 12 2 死亡率（%） 20.0 16．7 10．0 40．0 存活率（%） 80.0 83.3 90.0 60.0 显效时间（天） 5 3 3 10 症状消失时间（天） 7 6 5 20 2 由于剂型严重影响药物的疗效，我们将组方制成散剂、汤剂、冲 剂三种剂型，通过鸡人工感染传染性支气管炎的疗效对比试验对剂型 进行筛选。试验结果表明，汤剂与冲剂的治疗速度疗效显著优于散剂 组，汤剂与冲剂差异不明显，但颗粒冲剂具有使用、运输、储存方便 等优点，最后定型为颗粒冲剂。详见下表。 组 别 散剂组 汤剂组 颗粒剂组 空白对照组 30 30 30 30 试验数（只） 13 14 13 14 发病数（只） 发病率（%） 43．3 46．7 43．3 46．7 25 28 28 18 存活数（只） 5 3 3 12 死亡数（只） 死亡率（%） 16．7 10．0 10．0 40．0 83.3 93.3 93.3 60.0 存活率（%） 5 3 3 显效时间（天） 10 6 6 20 症状消失时间（天） 3 通过对鸡人工混合感染鸡副嗜血杆菌和传染性支气管炎病毒的 疗效观察，筛选出该制剂的最佳剂量为治疗量为0.5%预防量减半，连续使用5~7天为一疗程。 表、制剂治疗IBV和鸡副嗜血杆菌混合感染临床试验结果 组别 试验数发病数康复数死亡数治愈率发病率死亡率 (只) (只) (只) (只) (%) (%) (%) 1 30 3 2 30 13 11 2 84.6 43.3 6.7 3 30 12 10 2 80.0 40.0 6.7 4 30 14 8 6 57.1 46.7 20.0 5 30 13 9 4 69.2 43.3 13.3 6 30 0 0 0 7 30 20 12 8 66.7 26.7 我们采用鸡胚法，经过预试验、作用时间梯度与作用浓度梯度试 验，研究了禽喘康颗粒冲剂在鸡胚上对NDV（Lasota）、 IBV（M41） 的抑制或杀灭效果与体外作用时间、药物浓度的关系；抑制或杀灭病 毒的最大浓度与最短作用时间。 “10min 100EID50 NDV100%NDV M41(1:10)87.5%M41(1:100)NDV 100%M41(1:101:100) 100NDV LasotaNDV 表1 NDV作用时间梯度试验 组 别 血 凝 价 NDV病毒对照 10 11 11 11 11 11 10 10 10 11 11 NDV病毒+药物+终止液0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (10min) NDV病毒+药物+终止液0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (20min) NDV病毒+药物+终止液0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (30min) NDV病毒+药物+终止液0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 (40min) NDV病毒+药物+终止液0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (50min) NDV病毒+药物+终止液0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (60min) 表2 NDV作用浓度梯度试验之一固定药物稀释病毒 组 别 血 凝 价 -110＋中药 9 10 10 10 8 10 10 10 10 -210＋中药 9 9 8 10 9 9 7 8 -310＋中药 0 9 9 0 0 9 7 0 0 -410＋中药 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -510＋中药 0 0 0 0 0 0 0 0 -610＋中药 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -6病毒对照（10） 9 9 10 9 9 8 10 9 10 9 中药对照 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -310＋病毒灵 9 9 7 9 -410＋病毒灵 9 9 9 10 表3 NDV作用浓度梯度试验之二固定病毒稀释药物 组 别 血 凝 价 原液＋病毒 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -110＋病毒 7 5 6 6 8 8 7 8 7 8 -210＋病毒 6 7 9 7 7 8 8 5 -310＋病毒 7 7 8 8 8 8 7 8 8 -410＋病毒 9 8 5 8 9 9 7 9 -510＋病毒 7 5 9 9 9 8 10 10 9 -610＋病毒 10 9 9 10 9 9 10 10 10 硫代硫酸钠 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 表4 IBV作用时间梯度试验（枚、h、%） 项 目 孵化时间 接种侏儒蜷缩 肾脏尿酸盐 正常 感染率 保护率 组 别 胚数 胚数 胚数 沉积胚数 胚数 168 11 1 10 10 0 100 0 M41病毒+药物 5 +终止液(10min) 168 11 2 9 18.18 81.82 M41病毒+药物 +终止液(20min) 168 11 3 8 27.27 72.73 M41病毒+药物 +终止液(30min) 168 11 2 9 18.18 81.82 M41病毒+药物 +终止液(40min) 168 11 2 9 18.18 81.82 M41病毒+药物 +终止液(50min) 168 11 2 9 18.18 81.82 M41病毒+药物 +终止液(60min) 168 11 2 9 18.18 81.82 M41病毒+终止液 168 11 11 0 100 药物对照 168 11 11 0 100 盐水对照 168 1 10 0 100 空白对照 备注：药物1禽喘康颗粒冲剂，药物2病毒灵 表5 IBV作用浓度梯度试验（枚、h、%） 肾脏尿项目 孵化时接种胚侏儒胚蜷缩胚正常胚酸盐沉感染率 保护率 名称 间 数 数 数 数 积胚数 M41 168 10 2 0 8 0 100% 0 M41+药物1+终止液 168 8 1 0 3 4 50% 50% M41（1：10）+药物1+终168 8 1 0 0 7 12.5% 87.5% 止液 M41（1：100）+药物1+终止168 8 0 0 0 8 0 100% 液 M41（1：10）+药物2+终止168 10 0 2 8 0 100 0 液 M41（1：100）+药物2+终止168 10 1 1 8 0 100 0 液 药物1对照 168 8 0 0 0 8 0 100% 药物2对照 168 8 0 0 0 8 0 100% 盐水对照 168 6 0 0 0 6 0 100% 空白对照 168 6 0 0 0 6 0 100% 备注：药物1禽喘康颗粒冲剂，药物2病毒灵 6 1、配方：金银花30g 连翘30g 大青叶 30g 板蓝根30g 桔 梗30g 浙贝20g 杏仁20g 黄芩 20g 甘草10g。 2、工艺： 原料药筛选 配料称量 有效成分分类提取 粗品合并 清膏（1.38） 精确配制 化验 制粒 过筛 干燥 检验 分装。 一般认为中药经过特殊的加工、炮制与制剂加工等环节，可减轻、 降低或消除其毒害作用，但研究证明加工后的中药制剂仍具有一定的 毒副作用，只是相对化学类药物而言毒副作用较低而已。为科学 “禽喘康颗粒冲剂” 治疗家禽疾病时的毒副作用，我们用昆明鼠对 其进行了急性毒性试验。经最大耐受量试验，给小鼠的灌胃禽喘康颗 粒冲剂总剂量达到85ml/kg，相当于成年鸡日用量的400倍，仍未见 死亡和明显的中毒症状。证明该药基本无毒副作用。 家禽疾病，特别是由新成疫、传染性支气管炎病毒等引起的的呼 吸道病，是近年来给养禽业造成严重损失的病害之一。“禽喘康颗粒 冲剂”是本课题组研制的纯中药制剂，该药的主要成分为大青叶 、 板蓝根、黄芩、桔梗等，用于治疗家禽呼吸道疾病。我们对该药进行 了非免疫鸡人工感染鸡新城疫病毒（F E株）、混合感染鸡副嗜血杆488 菌（N株）和传染性支气管炎病毒（M41株）的临床效果观察、对感 染法氏囊病毒（D78）雏鸡的免疫器官病理学的影响试验及免疫调节 作用试验。 1 1.1发病及防治效果 1、2组较3、4、5、6组推迟48h出现症 状，防治率分别为 90.0 %和 93.7%，3、4组治愈率分别为80.0%和 75.0%。5组治愈率为73.3%。均显著高于对照组（p<0.01）。见表1 表１：“禽喘康颗粒冲剂”对鸡人工感染ND防治效果 7 组别 出现症状发病率病情 出现死亡死亡数 死亡率 防治率 时间（h） （%） 时间（d） （只） （%） （%） 0.5%预防72 100 较轻 4 3 10.0 90.0 组（1） 0.7%预防72 100 轻微 4 2 6.7 93.7 组（2） 0.75%治24 100 较轻 3 5 16.7 83.7 疗组（3） 1.0%治疗24 100 较轻 3 6 20.0 80.0 组（4） LaSota紧24 100 较重 3 8 26.7 73.3 接组（5） 空白对照24 100 严重 3 30 10.0 0 组（6） 2.2治愈情况 用药组和紧急接种组与对照组比较，能迅速减轻 临床症状而治愈病鸡，治愈率和有效率显著高于对照组（p<0.01），用药5天内各组的病鸡的痊愈、显效、死亡、无效情况见表2。 2.3剖检特征 攻毒后连续观察7天后全部扑杀，1、2、3、4、5组剖检可见腺胃乳头、肌胃角质层下、盲肠扁桃体、泄殖腔等症状 都较轻或轻微症状，对照组症状很明显，见表3。 2.3 治疗组用药量虽大，但保护率不如预防组，这主要是受试鸡 在出现症状后，随饮水量的减少或废绝，摄取的药量也随之减少甚至 终止有关，同时也正说明该药确实具有杀灭NDV的作用。本次试验 与前期的抗NDV鸡胚人工攻毒试验的结果表现一致，进一步证实了 该药对NDV具有很强的抑杀作用。 表２：“禽喘康颗粒冲剂”对鸡人工感染ND防治效果 组别 有效数治愈数无效数（只）治愈率有效率死亡率 （只） （只） ? （％） （％） （％） １ 27 27 3 90.0 90.0 10.0 8 ２ 28 28 2 93.7 93.7 6.7 ３ 25 20 10 80.0 83.7 16.7 ４ 24 18 12 75.0 80.0 20.0 ５ 22 15 15 68.2 73.3 26.7 ６ 0 0 30 0 0 100 ? 包括死亡数 表３：典型病变等级界定值 组别 １ ２ ３ ４ ５ ６ 病情 轻 轻微 较轻 较轻 较重 严重 打分指2.8?2.5?4.5?4.3?6.1?7.0?0 标 0.12 0.15 0.20 0.18 0.31 2 2.1 禽喘康预防组的保护率为93.3%，极显著高于感染不治疗 组（46.4%），说明该药对传染性支气管炎有较好的预防效果。适于治 疗由IBV和鸡副嗜血杆菌引起的慢性呼吸道病。 2.2 禽喘康治疗组的治愈率分别为84.6%、83.3%、78.6%，比鸡清瘟散组高15.4、14.1、9.4个百分点，均具显著差异。 2.3攻毒60小时后，攻毒对照组开始发病，表现为张口呼吸， 并伴有罗音和打喷嚏流眼泪等症状，96小时出现死亡。剖检病死鸡 只，可见病鸡颜面肿胀，鼻腔有粘液性分泌物，眼结膜发炎水肿；气 管有粘液性渗出物，气囊浑浊。各用药组于用药48小时后症状开始 缓解，6天后症状基本消失。试验用药组发病率明显低于攻毒对照组 （P<0.01）。 临床治疗试验结果 组别 试验数发病数死亡数治愈率（保护率）致死率(%) (只) (只) (只) (%) 0.5%预防组（1） 30 2 1 93.3 50 9 0.7%预防组（2） 30 13 2 84.6 16.4 0.75%治疗组30 12 2 83.3 16.7 （3） 1.0%治疗组（4） 30 14 3 78.6 42.9 LaSota紧接种30 13 4 69.2 30.8 组（5） 空白对照组（6） 30 28 13 46.4 7 30 - - 3 采用中草药“禽喘康颗粒冲剂”对鸡传染性支气管炎进行试验，结果表明： 中药预防（I、II）组的发病率分别比攻毒对照组低46.14%和50.06%；中药预防组和攻毒对照组差异极显著(P<0.01)；中药治疗（I、II）组的死亡率比攻毒对照 组低82.66% 和86.96%，且差异极显著(P<0.01)；治愈率均达80%以上。 （详见表1、表2） 表1：不同攻毒剂量致鸡IB发病及死亡情况 攻毒剂量 发病数（只） 死亡数（只） 发病率（%） 死亡率（%） 0.1ml/只组 2 1 40 20 0.2ml/只组 4 3 80 60 0.3ml/只组 5 4 100 80 0.4ml/只组 5 4 100 80 表2： “禽喘康颗粒冲剂”对IB的防治试验 组 别 发病（死亡）/鸡 发病率 死亡率 有效率治愈率保护率 (%) (%) (%) (%) (%) 数（只） 46.7 10 90 86.3 90 预防? 14（3）/30 43.3 6.7 93.3 89.7 94 预防? 13（2）/30 66.7 13.3 86.7 81.3 78.7 治疗? 20（4）/30 60 10 90. 84.7 84.3 治疗? 18（3）/30 86.7 76.7 攻毒对照组 26（23）/30 10 0 0 0 空白对照组 4 为进一步验证其免疫增强功效，我们选用30日龄非免疫公鸡用 左旋咪唑做对照，鸡新城疫低毒力活疫苗（ Lasota株）2羽份免疫前，0.5%饮水3天，于免疫0、7、14、21d翅静脉无菌采血,分离血清,低温冰箱保存,测定鸡新城疫抗体和免疫球蛋白(IgG)。 21d时静脉采血涂片，酯酶染色法测定T细胞总数， 同时捕杀后采用器官重量 法进行免疫器官(法氏囊、胸腺和脾脏)指数的测定，试验数据采用 SPSS软件进行统计。 4.1 试验组、药物对照组新城疫抗体效 价于空白对照组差异不显著，说明禽喘康冲剂对肌体的体液免疫的影 响不大，这与早期杀灭病毒，减少抗原刺激有关。见表1 表1禽喘康冲剂对的影响 效价（Log2）/d 组别 试验数 0 7 14 21 28 试验组 10 0 7.88?0.91 6.5?0.8 6.13?0.69 4.4?0.48 药物对照组 10 0 4.5?0.73 7.33?1.0 7.21?0.91 5.83?0.83 空白对照组 10 0 5.0?0.28 8.5?0.83 7.7?1.1 6.75?0.38 4.2 试验组与左旋米唑组均能显著提高淋巴细胞 转化率，增强细胞免疫功能，提高抗病能力。见表2 表2 禽喘康冲剂对鸡T细胞总数的影响(OD的光吸值) 570nm 组别 重复1 重复2 重复3 重复4 X?sd 试验组 0.114 0.137 0.133 0.120 0.126?0.01 药物对照组 0.134 0.149 0.149 0.136 0.142?0.01 空白对照组 0.033 0.034 0.036 0.035 0.0345?0.001 4.3 4.3.1 试验组法氏囊指数低于空白对照组，而脾脏指数与胸腺指 数均高于空白对照组，者与上述结论是一致的。既具有较强的细胞免 11 疫增强功能，对NDV病毒具有较强的杀灭作用，故体液免疫器官法 氏囊指数低于空白对照组，体液免疫增强作用不明显。 4.3.2药物对照组免疫器官指数均低于空白组，者可能与临床用 两有关，有待进一步研究。 表3 禽喘康冲剂对鸡免疫器官指数的影响 组别 法氏囊指数 脾脏指数 胸腺指数 试验组 2.83?0.80 2.63?0.49 3.35?0.78 药物对照组 2.36?0.78 1.24?0.40 1.62?0.39 空白对照组 3.37?0.57 2.21?0.44 3.07?0.52 5 IBDV 选用15日龄海兰白公雏人工感染IBDV（D78），以观察“禽喘康颗粒冲剂”对这些免疫器官组织学变化的影响探讨该药防治家禽传染 病的作用机理。 显微镜下观察法氏囊粘膜下及间质呈不同程度的 水肿、出血和异嗜性粒细胞浸润，严重的见黏膜下水肿可波及到泄殖 腔，实质的淋巴细胞变形坏死。有的被网状细胞取代，坏死严重的呈 囊腔状，萎缩的法氏囊淋巴滤泡体积缩小，治疗组和预防组大量的淋 巴滤泡（淋巴小结）存在于固有膜中，沿着上皮密集排列，并可见上皮索深入淋 巴滤泡。淋巴滤泡可分为皮质和髓质两部分，髓质在滤泡中央，由上皮细胞和较 大的淋巴细胞组成。 治疗组和预防组，每个胸腺叶的外周由染色较深的 皮层和中央染色较浅的髓质构成，无论皮质和髓质的面积均大于对照 组，淋巴细胞较密集。 治疗组和预防组，淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞的数 目和体积均多于和大于对照组，脾小体多而明显，动脉周围淋巴组织 鞘丰富，脾索淋巴细胞密集。 5.4“禽喘康颗粒冲剂”可以减弱IBDV对雏鸡免疫器官的损害，具有明显的免疫保护作用。 12 为进一步验证中药“禽喘康颗粒冲剂”对自然发病鸡的疗效，我 们从山东聊城、荷泽、潍坊等地蛋鸡和肉鸡的病鸡户中，选择经过临 床初诊和试验室确诊为新城疫、传染性支气管炎、传染性鼻炎、慢性 呼吸道病（败血性支原体）的鸡群，进行了田间试验。分别用金刚烷 胺、病毒灵、复方泰灭净（磺胺间甲氧嘧啶）、慢呼速停作为对照药 物。 1 、“禽喘康颗粒冲剂”对蛋鸡、肉鸡ND的有效率分别达98.7%、96.0%、，较金刚烷胺组高1.5、3.7个百分点；死亡率为降低1.5、3.7个百分点；产蛋鸡用药3天后产蛋率开始回升，第5天较病初提高4.9个百分点，而对照组5天后产蛋率反而降低1.8个百分点。见表1。 表1 对ND的治疗效果 组发病数用药5天死 亡 数死亡有效有效率别 （只） （只） 率数（%） （%） （只） 合 1d 2d 3d 4d 5d 计 肉 1427 24 20 11 2 0 57 4.0 1370 96.0 鸡 禽 蛋喘15 10 2 2 0 29 鸡 康 2310 1.3 2281 98.7 产组 72.73.78.81.87. 蛋 9 0 7 6 8 率 金肉 1427 26 26 25 20 13 110 7.7 1317 92.3 刚鸡 烷16 15 15 10 8 64 蛋 2310 2.8 2246 97.2 胺鸡 13 组 产 74.75.76.71.72. 蛋 0 7 7 9 2 率 注:黑体字为产蛋率 2、对肉鸡IB的有效率为98.1%，较病毒灵组高2.7个百分点。 死亡率为降低1.5、3.7个百分点。 表2对肉鸡IB的治疗效果 组日发病数用药5天死亡数（只） 死亡有效数有效别 龄 量（只） 合率（%） （只） 率（%） 1d 2d 3d 4d 5d 计 禽 喘 35 1890 16 16 3 1 0 36 1.9 1854 98.1 康 组 病 毒 35 1890 14 20 33 18 10 87 4.6 1803 95.4 灵 组 14 3、对肉鸡CRD的有效率达93.5%，较复方泰灭净组高3.9个百分点，死亡率为降低4.1个百分点；对IC蛋鸡用药5天产蛋率用药 后提高3.1个百分点，而复方泰灭净组慢用药5天后产蛋率仍降低 13.7个百分点,呼速停组用药5天后产蛋率仍降低4.9个百分点。见表 3 表3 禽喘康对IC、CRD的田间治疗效果 投药前后死亡数或产蛋率（只、%） 品 投药前3d 投药后5d 组种 病数量 死别 日名 只 合有效 1 2 3 1 2 3 4 5 亡 龄d 计 率 率 禽肉 CRD 2310 15 27 30 35 26 11 5 1 149 6.5 93.5 喘30 康蛋 IC 3200 87.4 81.1 74.0 73.9 77.0 83.7 86.6 90.5 +3.1 组 200 复肉 CRD 1690 13 23 26 27 28 25 23 10 175 10.4 89.6 方25 泰 蛋 灭IC 6323 75.9 74.0 70.7 66.4 67.8 67.6 56.9 62.2 -13.7 302 净 慢肉 CRD 2600 18 23 38 40 45 31 20 12 227 8.7 91.3 呼21 速蛋 IC 3075 84.9 82.0 80 80 79.0 8.0 80. 80.0 -4.9 停 210 注:黑体字为产蛋率 4、 用“抗病毒冲剂”治疗总的经济效益大约提高10-20%。 15 本品为纯中药制剂，为进一步检验其稳定性，我们按《新兽药审 批办法》的规定，用留样观察法，将三批“禽喘康颗粒冲剂”放置于 室温条件下观察其外观性状、ph值、相对密度、容解性等方面的变 化。结果表明“禽喘康颗粒冲剂”的质量是稳定的，说明其制备工艺 是合理的，所生产的产品质量是稳定的，拟定的质量标准是可行的， 故“禽喘康颗粒冲剂”的研制工作是成功的，可以投入大生产。 依据《中华人民共和国兽药典》1990年版二部与《中华人民共和国药典》1995年版一部的有关规定，制定了“禽喘康颗粒冲剂” 的处方、制法、性状、鉴别、检查、功能与主治、用法和用量、储藏 等方面的质量标准。 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