填饲高能碳水化合物对组织脂肪沉积在☆

填饲高能碳水化合物对组织脂肪沉积在☆ Difference of Overfeeding carbohydrate on lipids deposit between two Breeds of Goose Han Han Chunchun, Wang Jiwen, Xu Hengyong, Liang Li, Ye Jianqiang, Zhuo Weihua College of Animal Science and Technology,Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014,China Abstract: The aim of our study was to research the difference of law of development and fatty deposit between Sichuan white goose and Landes goose. We measured the ration of subcutaneous adipose tissue, abdominal adipose tissue, thigh muscle, pectoral muscle, liver weight to body weight and the content of lipids in liver. Meawhile, the plasma lipoprotein lipase (LPL) activity and the mRNA expression of LPL in several tissues were studied. Our result showed that (1) Overfeeding induced more lipid accumulation in liver tissue of the Landes geese，but stronger development of adipose tissues in the Sichuan white geese. (2) The increase of LPL activity induced by overfeeding differed between the two breeds. (3) overfeeding induced the icrease of the LPL mRNA expression in liver, abdominal adipose tissue, thigh muscle and pectoral muscle of both breeds, but had no effect on the LPL gene expression in the subcutaneous adipose tissue. Key words: overfeeding, goose, fatty deposition, development of tissue, lipoprotein lipase 填饲高能碳水化合物对组织脂肪沉积在 两种鹅中的差异研究 1韩春春, 王继文～许恒勇～蒋立～叶健强～卓伟华 (四川农业大学动物科技学院，雅安 625014) 摘要:本实验通过对四川白鹅和朗德鹅进行填饲高能碳水化合物，测定皮脂率、腹脂率、腿肌率、胸肌率、肝重率和肝中脂质 含量，及血浆脂蛋白酯酶(LPL)活性和各组织中LPL的基因表达情况，从而研究两种鹅组织发育规律及沉积脂肪的差异。总之， 在单位体重填饲等量配合饲料的情况下，(1)由填饲诱发的肝脂质沉积程度在朗德鹅表现得比四川白鹅更加显著，而四川白鹅 则表现出比朗德鹅较大程度的脂肪组织生长发育。(2)填饲引起的LPL活性的增加在两个品种间存在差异。(3)填饲诱导肝、 腹脂、腿肌和胸肌的LPL基因表达在两个品种都增加，但在腹脂填饲对其基因表达没有变化。 基金项目:四川省十一五育种攻关项目(2006YZGG-20);四川省教育厅重点专项(2004D001) 作者简介:韩春春(1980-)，女，博士生，研究方向:动物遗传育种与繁殖 1通讯作者:王继文(1964-)，男，教授，博导，E-mail:wjw2886166 @163.com 1 关键词:填饲，鹅，脂肪沉积，组织发育，脂蛋白酯酶 填饲不仅能诱发大量脂肪沉积于肝脏中，也能增加肝外组织的脂肪沉积，但肝脏及肝外 [1,2]组织的脂肪沉积在不同物种、品种内，甚至同品种内不同个体间都表现出明显的差异。Mourot结果朗德鹅肝重是波兰鹅的2倍，虽然肌肉组织的增重大于波兰鹅，但脂肪组织脂肪 [3]沉积量与波兰鹅相似。Davail等表明北京鸭较番鸭与骡鸭肥肝易感性弱，但肝外肌肉组织与脂肪组织的生长强度较大，Davail等研究发现填饲诱发朗德鹅肝脂肪变性较波兰鹅的程度大，但肌肉组织与皮下脂肪组织的生长强度较波兰鹅小。家禽的脂肪组织发育、脂肪沉积等 [4]主要取决于血浆中甘油三酯的水平，而肝脏脂肪变性和外周脂肪沉积之间的相对重要性由 一个平衡产生，此平衡控制着肝脏生成与分泌脂质和肝外组织对VLDL-TAG的吸收运用强度[5]。 脂蛋白酯酶(LPL)是由脂肪细胞，心肌，骨骼肌，乳腺等实质细胞合成和分泌的一种糖蛋白。肝细胞不参与LPL的合成。但LPL是降解肝脏合成、分泌的极低密度脂蛋白(VLDL)最重要的酶。LPL通过静电引力与毛细血管内皮细胞表面的多聚糖结合，肝素可以促进此结合形式的LPL释放入血。在LPL的作用下，VLDL中的TG被分解成甘油和脂酸，以供组织氧化供 [6]能和贮存。LPL是哺乳类动物肥胖基因借以调节机体脂质代谢的重要功能蛋白，通过控制其在脂肪组织与其他组织器官中的表达水平的高低直接决定脂肪组织与其他组织器官脂质底物配额的相对量，从而间接决定从食物中摄入脂类的代谢前途:以体脂形式贮备起来或作 [7]为能源底物消耗掉，并最终对机体脂质蓄积状况产生决定性影响。综上所述，填饲导致的脂肪沉积在不同组织中有很大差异，已知LPL活性起了重要作用。到目前为止，LPL基因在不同组织的基因表达情况与其脂肪沉积的关系还未见报道。 1. 材料和方法 1.1 实验动物 选用雄性朗德鹅和四川白鹅作为试验群体。两个品种都分为对照组和填饲组，14周龄开 周，根据单位体重填饲等量配合饲料(平均25g/day/100g BW)对朗德鹅与四川始填饲，填饲2 白鹅进行填饲操作。填饲期间单笼饲养，整个饲养期间自由饮水。 1.2 各组织相对重量测定及样品采集 当填饲期结束时，对填饲组与对照组的鹅称重，整夜禁食，自由饮水。第二天清早，翅静脉采血5ml，离心分离血浆，把血浆冻于-70?C冰柜中，备血浆中LPL活性，然后再进行屠宰。屠宰放血后立即剖腹，取肝脏，胸肌，腿肌，皮+皮下脂肪(以下简称皮脂)、和腹部脂肪组织(以下简称腹脂)，迅速取50,100 mg大小的组织块液氮速冻后于-70 ?冰箱保 2 存以备RNA抽提;取完样品之后再进行屠宰测定，并计算皮脂、腹脂、肝重、腿脂和胸肌分别占活体重的比率，分别记为:皮脂率、腹脂率、肝重率、腿脂率和胸肌率。 1.3 肝脂质含量测定 取约1克冻存的肝组织并在105?的温度下烘干12 h测定水分，同时取冷冻干燥1,2 g组织并用乙醚经索氏抽提器抽提测定脂质含量。 1.4 血浆LPL活性的测定 血浆中LPL(脂蛋白脂酶)活性的测定:采用酶促比色法，利用南京建成的LPL测定试剂盒进行，具体操作步骤参照试剂盒说明。 1.5 LPL基因表达分析 用Trizol reagent 提取各组织的总RNA，不同个体的相同组织的的总RNA混合后采用半定量TR-PCR方法检测LPL基因mRNA的表达情况。根据本实验室克隆得到的鹅LPL基因序列(序列号:EF620913)和Genbank中的β-actin(序列号:M26111)序列设计引物，LPL: 上游5,GGA CGG TGA CAG GAA TGT ATG A3,，下游5,CAG CAG GAT CCA GAC CAG TAA T3,;β-actin:上游5,ACC CAC ACC GTG CCC ATC TAT G3,，下游5,GTG GCC ATC TCC TGC TCG AAG T3,。PCR条件为:94 ?预变性5 min，(94 ? 30 s、55 ? 30 s、72 ? 2 min)，循环30次后再72 ?延伸10 min。反应结束后用1.0 %的普通琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带，并在紫外分析仪上进行电泳图像分析，按下式计算基因的相对表达值:LPL基因相对表达值=LPL基因条带灰度值/β-actin基因条带灰度值，作为LPL基因表达水平的指标。实验重复三次。 1.6 数据分析 利用SASv6.12软件进行分析，数据以Mean?SD表示。用T-TEST检验差异性是否显著。 2. 结果 2.1 填饲效应导致品种间的组织生长发育差异 如表1所示，在对照组，除了朗德鹅的腹脂率和肝脂肪含量较高外(p<0.05)，其它组织的相对重量在两品种间没有显著的差异(P>0.05)。在填饲组，朗德鹅的肝重率和肝脂肪含量都高于四川白鹅。与对照组相比，经填饲，肝重率极显著增加(P<0.001)，朗德鹅与四川白鹅的肝重率分别是对照组的4.5倍与3倍，皮脂率、腹脂率也显著高于对照组，但增长强度远小于肝组织的增长，皮脂率与腹脂率分别上升约50%与100%。这些数据表明，由填饲诱发的肝脂肪变性在朗德鹅表现得比四川白鹅更加显著，而四川白鹅则表现出比朗德鹅较大程度的脂肪组织生长发育。 表1. 朗德鹅和四川白鹅各组织的相对重量 对照组 填饲组 朗德鹅(n=35) 四川白鹅(n=30) 朗德鹅(n=17) 四川白鹅(n=23) 3 ???*???肝重率 1.89?0.31 2.01?0.26 8.55?1.75 6.07?1.46 *??腹脂率 3.01?0.49 1.94?0.62 4.36?0.83 4.53?1.07 ??皮脂率 16.85?2.03 14.62?1.70 21.02?2.61 21.63?2.63 ??胸肌率 10.41?1.17 9.88?1.29 8.20?0.99 7.62?0.83 ??腿肌率 9.47?0.87 11.10?1.48 7.43?0.78 8.37?0.92 肝脂肪含*???**???3.26?1.73 1.88?0.58 49.06?7.31 38.47?7.16 量 注:n= 个体数。表中数据为“平均数?差”，下同。 *、**分别表示同一处理中两基因型鹅在P,0.05、0.01、0.001水平上的差异;?、??、???同一基因型鹅不同处理间P,0.05、0.01、0.001水平上的差异。 2.2血浆中的LPL活性 如图1所示填饲后，两品种鹅的 LPL 活性均比对照组极显著地提高(P<0.001)。填饲组的四川白鹅的 LPL活性极显著地高于朗德鹅(P<0.001)。 11.4***12 10对照组 7.61填饲组8 64.984.75 4 2LPL活性(palmitate/ml.h) 0 朗德鹅 四川白鹅 图1. 朗德鹅和四川白鹅血浆中的LPL活性 2.3 LPL的基因表达分析 如表2所示，对照组中肝、皮脂、腹脂、胸肌和腿肌的 LPL mRNA 量的品种差异不显著。填饲组中皮脂和腹脂的 LPL mRNA 量的品种差异不显著，但朗德鹅胸肌中的 LPL mRNA 量极显著地高于四川白鹅，而四川白鹅腿肌中的 LPL mRNA 量显著地高于朗德鹅。填饲组的两品种鹅的腹脂、胸肌和腿肌的 LPL mRNA 量都极显著地高于对照组，但皮脂的 LPL mRNA 量和对照组差异不显著。另外填饲后胸肌和腿肌的表达量要高于其它组织。 表2. 朗德鹅和四川白鹅各组织的LPL表达丰度 朗德鹅 四川白鹅 对照组 填饲组 对照组 填饲组 ???*???肝 0.98?0.07 1.50?0.04 0.98?0.04 1.34?0.24 ??????腹脂 0.86?0.15 1.32?0.30 0.90?0.03 1.29?0.21 4 皮脂 0.99?0.11 1.09?0.13 1.01?0.13 1.05?0.16 ???**???胸肌 0.92?0.12 3.42?0.75 0.89?0.05 2.42?0.49 ???*???腿肌 0.97?0.06 2.11?0.51 1.03?0.17 2.33?0.38 注:*、**分别表示同一处理中两基因型鹅在P,0.05、0.01、0.001水平上的差异;?、??、???同一基因型鹅不同处理间P,0.05、0.01、0.001水平上的差异。 3.讨论 3.1(填饲诱导鹅体脂肪沉积差异 由于两种鹅的绝对体重差异较大，为了比较说明品种间的组织的发育情况，将组织重量表示成占体重的百分比的相对重量，这样就比较有说服力。对鹅(鸭 )填饲不仅能诱发大量脂肪沉积于肝脏中，也能导致肝外组织脂肪沉积增加，但沉积于肝脏及肝外组织的脂肪量是不 [2,5,8]同的。如表2.2所示相对对照组，填饲后朗德鹅与四川白鹅肝重率、腹脂率和皮脂率及肝脂率均极显著地提高。但与外周脂肪组织相比，填饲更能促使脂肪沉积于肝脏中:与对照组比较，填饲使得肝重率至少增长2倍，而引起脂肪组织占体重的百分比最多上升1.4倍。虽然对照组中朗德鹅的腹脂率和皮脂率极显著地高于四川白鹅，但填饲的两品种鹅之间的腹脂率、皮脂率差异不显著，说明填饲之后，四川白鹅表现出比朗德鹅更强的脂肪组织生长发育能力。对于胸肌和腿肌而言，填饲后它们占体重的百分比均低于对照组，说明填饲对两品种鹅的增重效应不是体现在肌肉的生长，而是体现在肝脏和外周脂肪组织的脂肪沉积，虽然 [9]鸟类的肝脏与脂肪组织均能贮存脂肪，但脂肪合成的主要场所是肝脏，这可能造成肝脏对于填饲效应较脂肪组织更敏感，从而增长速率较脂肪组织快。在鹅(鸭)中，填饲诱导的肝外 [10,11]组织生长和肝脏脂肪沉积与品种相关。本实验结果证实了这一点:朗德鹅显示出较大程度的肝脂肪变性，而四川白鹅表现出较大程度的脂肪组织生长。 3.2. LPL介导的脂肪沉积的品种间差异 由肝分泌进血浆中的VLDL-TAG，随着血液循环流经各个肝外组织时，由LPL催化水解， [12]生成游离脂肪酸供各组织利用或贮存，而未被LPL水解的TAG可能返回肝脏贮存。作为贮 [13]存的TAG又可能生成VLDL-TAG，再分泌进血浆，因而各组织中LPL基因的表达对于各组织的脂肪沉积的调节起着重要作用。填饲对各组织中LPL mRNA表达具有上调效应，这可能与填饲导致的各组织的脂肪沉积的增加有关，LPL基因表达的组织差异性与各组织的脂质沉积能力各不相同紧密相关，填饲引起的肝中脂质含量及脂肪组织的增加证明了这点。由LPL活性与各组织的相对重量的相关情况可以看出，填饲后LPL活性越高的朗德鹅个体，产生的脂肪肝重量越小，而皮脂和胸肌的生长发育越快; LPL活性对四川白鹅的肝外脂肪组织与腿肌的生长发育具有显著影响。 各组织生长发育所需的养分来源于血液循环的 TG 水解产物—游离脂肪酸，VLDL 所携 5 带的 TG 首先被锚定在毛细管内皮的 LPL 水解成甘油和游离脂肪酸，然后游离脂肪酸才能 [14]被脂肪组织或肌肉吸收利用，因此，LPL活性对于各组织的生长发育是非常重要的。填饲 后，四川白鹅血浆LPL的活性极显著高于朗德鹅，因此在四川白鹅的外周组织，LPL 催化 VLDL-TG 发生水解产生游离脂肪酸的反应强度显著大于朗德鹅，这就不难理解为什么填饲后 四川白鹅的脂肪组织生长发育能力比朗德鹅强了。相反，填饲后朗德鹅较低的 LPL 活性可 能是这品种鹅肝外催肥的一个限制因素，没有被 LPL 代谢的 TG 可能在特定脂蛋白的运输 [15]下返回到肝脏，并在特异的脂蛋白受体介导下被肝脏吸收和同化，促进肝脂肪变性。LPL 活性能在一定程度上控制肝脏和肝外组织之间的脂类贮存。研究发现，由于LPL活性增加可 [16,17]以引起鸡剧烈的外围脂肪沉积，这种情况在本研究的四川白鹅中同样如此。表明:未被 LPL水解的脂蛋白甘油三脂(TG)可能返回到肝脏，然后被特异的脂蛋白受体吸收和内在化， [15]从而促进肝脂肪复性，这已经在哺乳动物表现出来。高水平的LPL活性使得脂类优先贮存 在肝外脂肪组织，从而阻碍肝脏脂肪变性。 参考文献 [1] Davail S, Rideau R, Guy G, Andre J M, Hermier D, Hoo-Paris R. 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