细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤

细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤1.爬片的准备1)爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；用盖玻片时，可根据自己的需要用小砂轮或玻璃刀剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；2)将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，然后置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后高压消毒。高压消毒后取出放入烘箱中烘干，烘干后可放入超净台中备用。3)可将爬片用多聚赖氨酸处理，以使细胞与爬片结合更牢固。1mg/ml的多聚赖氨酸用的滤器过滤除菌后分装于经过无菌处理的1ml细胞冻存管内保存在4℃里，三个月内仍然可以使用。用时将高压灭菌过的爬片放到ml的多聚赖氨酸溶液内浸泡5min，无菌晾干即可（放入培养板孔内注意爬片的正反面）。或将爬片铺于培养皿中，将多聚赖氨酸溶液滴于爬片上，室温10分钟后，吸除玻片上的溶液，在超静台内晾干后使用。储存、稀释和吸取多聚赖氨酸要使用塑料制品。2.细胞爬片1)胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液，计数。2)根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内。滴加细胞悬液时，根据爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，然后将爬片置于液滴上，压紧，使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，防止加细胞悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴片。若细胞贴壁能力不强，爬片可经多聚赖氨酸浸片后放入。3.细胞的固定及免疫荧光1)在培养板中培养好细胞后，吸除培养基，一般先使用PBS轻洗细胞2×3min，然后再做固定（凋亡的TUNEL染色等可以不清洗）。2)固定：加入4%多聚甲醛(PBS配制)固定20分钟。如果暂时不能立即做组化检测，使用含%多聚甲醛的PBS浸泡细胞（注意在免疫组化检测完成前不要让细胞变干，否则细胞收缩形态不好）。3)除去多聚甲醛，使用PBS轻洗细胞3×3min。4)通透：%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上达的抗原省略此步骤）。5)除去TritonX-100，使用PBS轻洗细胞3×3min。6)内源性过氧化物酶处理：3%H2O2孵育15min（选作，二抗连HRP必需做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。7)除去H2O2，使用PBS轻洗细胞3×3min。8)封闭：用10%的与二抗同源的血清(PBS配制)封闭半小时。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。9)一抗：滴加足够量适宜浓度的一抗，4℃孵育过夜（或37℃，60min）；若有两种一抗（要是不同种属的）则同时孵育，两种二抗亦同时孵育（二抗同时使用时最好是同一种属）。10)除去一抗，使用PBS轻洗细胞3×3min。11)二抗：滴加足够量适宜浓度的二抗，37℃，30min（从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行）。12)除去二抗，使用PBS轻洗细胞3×3min。13)二氨基联苯胺（DAB）底物显色：室温下避光孵育5至10分钟，或直至样本出现棕褐色（选作，二抗连得是酶的必做，显色时间严格控制，要避免显色过度引起假阳性；二抗连的是荧光素的不用做）。14)除去显色工作液，使用PBS冲洗细胞3~4次。15)复染核：mlDAPI（或200nMHoechst33342）避光孵育5min。16)使用PBS轻洗细胞4×5min，洗去多余的DAPI。17)取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧，张力较大，可将注射器针头针尖向背面做个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出即可。18)用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。19)保存细胞爬片的时候，先在培养皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便实验时取片。并在盖子上做标记，一般-20℃可保存2-3个月。