质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序

质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序 质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序 一、感受态细菌制备(CaCl2法) 1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37?振荡培养过夜(200r/min，至OD=1.5左右)。 2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶(1%)中，37?条件下振荡培养2~2.5小时左右(200r/min)，使OD600达到0.2~0.4左右(100μl测600nm时OD值)。 3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min， 4. 4?条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。 5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。转移到一个离心管中，共8ml。 6. 冰上放置10min后，4?条件下，4000r/min离心10min。 7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。分装成200μl的小份，共8管(40ml变为1.6ml浓缩25倍)，-70?保存备用。 二、溶液的配置 1. LB培养基:1%蛋白胨(typtone)、0.5%酵母提取物(yeast extract)、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。高压灭菌20分钟备用。 2. 0.1mol/l的CaCl2溶液:1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4?保存。 另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份(10份)4?保存。 3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用; 4. 配置固体培养基时+(1.5g/100ml)琼脂糖，然后高压灭菌20min。取出后，稍冷却，一个60mm的培养皿中加入约20ml培养基，无菌条件下铺板。 5. 选择性培养基:培养基+(1.5g/100ml)琼脂糖，然后高压灭菌20min，取出后放于60OC水浴，保持60oc温度加入100mg/ml的氨苄青霉素(Amp)即100ml LB加入100μl Amp(Amp终浓度达到50μg/ml)，摇匀后铺板(20ml/板)上盖稍打开，37度烘箱/室温下放置干燥1-2天，封口膜包裹后贮4?保存备用。 三、质粒转化 注意:取两管感受态细胞?:为空白对照，不加质粒?:加入质粒; 每管加入量:体积<10μl，DNA<50ng; 质粒稀释成0.02μg/μl; 200μl感受态细胞中加入2μl浓度为0.02μg/μl质粒。 具体步骤: 1. 取两管感受态细胞冰上放置解冻，同时质粒冰上解冻，开启水浴锅42? 管?空白对照，不加质粒; 管?加入2μl 0.02μg/μl的质粒，混匀，冰上放置30min 2. 42?水浴90s，不摇 3. 取出，置冰上2min，加入LB 300μl，37?，200r/min振荡培养1小时，复苏细胞。同时将选择性培养基置于室温1小时。 4. 取上述转化菌液150μl涂布在相应的培养板上: ?不含Amp的培养板——不含质粒菌液 ?含Amp的培养板—a:不加质粒菌液;b:加质粒菌液 正面培养1h后，倒置培养过夜。 5. 观察菌落生长情况，取含Amp培养板上加入含质粒菌液后生长的菌落，加入到5ml LB液体培养基中(加入Amp 5ul)，37?培养12h。 6. 用含甘油30%的LB保存，-70? 备用(甘油消毒、高压灭菌)。 三、质粒提取 1. 已转化好质粒的细菌加入到含有抗生素的LB培养液总共大概150ml在37?恒温箱中摇菌过夜。 10分钟离心，倒掉上清。 2. 将细菌分装在4个50ml的离心管中，7000r/min， 同时取10mlP1溶液加入10μl的酶抑制剂，备用。 3. 在每个离心管中加入1mlP1:酶抑制剂(1:1)，吹打悬浮沉淀，然后将所有菌液集合到同一个离心管中。 4. 加入5ml的P2溶液，轻柔的颠倒20次。放置4分钟。 一旦加入P2，应立刻盖上盖子，以防酸化。Genomic DNA裂解物是粘性物，切勿将溶解时间超过5分钟。 5. 加入5ml的P3溶液，轻柔的颠倒20次。冰上孵育20分钟。 加入P3后，会产生蓬松的白色物质，沉淀物变得不粘，沉淀物包括genomic DNA,Protein,细胞碎屑和SDS 6. 13000r/min,30分钟离心，将上清倒至盖有一层纱布的吸附柱(Qiagen-tip100)中，吸附柱下放置一个装废液的饭盒。吸附柱使用前应用约4ml的QBT平衡，上清液应快速加入柱中，如果上清放置时间长则会变得混浊，系蛋白沉淀所致，须再次离心。 7. 待滴完之后，加满QC液洗去残液，滴完后再重复一次。 8. 用5mlQF液洗脱柱上的质粒至10ml离心管中。 9. 加入3.5ml异丙醇，颠倒混匀，13000r/min，30分钟。可见沉淀物，小心弃去上清。 10. 加入1ml70%的乙醇，溶解沉淀后转入1.5ml的appendorf管;再取1ml70%的乙醇，清洗管壁，转入1.5ml的appendorf管。 11. 14600r/min，20分钟，弃上清，待乙醇蒸发后加入100μlTE，再将两管集合(酌量，若质粒量比较多，可加入200μl)。 12. 取2μl质粒液至加有98μl双蒸水的0.5mlappendorf管，在紫外——分光光度计上检测质粒浓度和纯度。(纯度参照:1.8~2.0) 13. 剩余的质粒标记日期，质粒种类，浓度放在-20?冰箱保存，备用。 四、细胞转染 1. 细胞计数后按一定数量植入24孔板中，放入培养箱中培养12小时，备用。 2. 根据转染的孔数及每孔加入的质粒量算出所需的pbs量和质粒量 3. 在两个10ml的离心管中均加入pbs液，A管加入质粒，B管加入转染试剂，吹打混匀。 4. 在斡旋的条件下将转染试剂逐滴加入到质粒中，放置20分钟。 5. 将加过转染试剂的质粒均匀加到已培养12小时的孔板中。再将孔板置于培养箱培养。