【doc】 益气活血化痰法中药对泡沫细胞基质金属蛋白酶1/2mRNA表达的影响
益气活血化痰法中药对泡沫细胞基质金属
蛋白酶1,2mRNA表达的影响
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238?
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论着?
中国中西医结合急救杂志2005主旦箜鲞笙塑』!尘!!!』!!!!:!:
益气活血化痰法
金属蛋白酶1/2
中药对泡沫细胞基质
mRNA表达的影响
张志毅,梅轶芳,赵彦萍,曹洪欣
(1.哈尔滨医科大学附属第一医院,黑龙江哈尔滨150001;2.中国中医研究院,北京100700)
【摘要】目的:探讨益气活血化痰法中药对动脉粥样硬化影响的机制.方法:将体外培养的小鼠泡沫细胞
分为空白对照组,益气组,活血组,化痰组,益气活血组,益气化痰组,活血化痰组,益气活血化痰组8个实验组.
提取RNA,用逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)法分析各组基质金
属蛋白酶组织抑制剂一1(TIMP一1)和
TIMP一2mRNA表达水平,评价益气活血化痰法中药对巨噬细胞源性泡沫细胞表达和分泌TIMPs的影响.
结果:与空白对照组相比,益气活血,益气化痰,活血化痰及益气活血化痰4组均可明显促进泡沫细胞TIMP一1
mRNA表达(P均<o.05),而益气组,活血组,化痰组与空白对照组比较差异无显着性(P均>0.05).与空白对
照组比较,益气组,活血组,化痰组可促进泡沫细胞TIMP一2mRNA表达(P均<0.05),益气活血组,益气化
痰组,活血化痰组,益气活血化痰组可明显促进泡沫细胞TIMP一2mRNA表达(P均<0.001).结论:益气活
血化痰法中药可促进泡沫细胞TIMP一1和TIMP一2mRNA表达,从而减少动脉粥样硬化的发生和发展,并
且可能起到稳定动脉粥样硬化不稳定斑块,减少和预防冠心病,脑梗死等心脑血管疾病发生的作用.
【关键词】益气活血化痰法;中药复方;基质金属蛋白酶组织抑制剂;泡沫细胞
中图分类号:R285.5;R242文献标识码:A文章编号:1008—9691(2005)04—0238—04
InfluenceoftraditionalChinesemedicinemethodofpromotingcirculationof
Qiandbloodanddispersing
phlegm(益气活血化
痰)ontissueinhibitorofmetalloproteinasemRNAexpressioninfoamcellsZHANG
Zhi—yi,MEIYi一
ping,CAOHong—xin..j.RheumatologyDepartment,theFi/ng,ZHAOYan—
rst
lliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbinl50001,Heilongjiang.Chinat2.ChineseInstitute
ofTraditionalChineseMedicine,Beijingj00700,China
[Abstract]Objective:ToinvestigatethemechanismoftraditionalChinesemedicine(TCM)ontissue
inhibitorofmetalloproteinase(TIMP)mRNAgeneexpressioninfoamcel1.Methods:Cuhuredfoamcells
weredividedintoeightgroups:controlgroup,promotingcirculationofQigroup(PCQgroup,益气组),
promotingcirculationofthebloodgroup(PCBgroup,活血
组),dispersingphlegmgroup(DPgroup,化痰
组),promotingcirculationofQiandthebloodgroup(PCQBgroup,益气活血
组),promotingcirculationofQi
anddispersingphlegmgroup(PCQDPgroup,益气化痰
组),promotingcirculationofthebloodanddispersing
phlegmgroup(PCBDPgroup,活血化痰
组),promotingcirculationofQiandthebloodanddispersingphlegm
(PCQBDPgroup,益气活血化痰组).Thesemi—quantificationofTIMP一
1andTIMP一2mRNAinfoamcell
polymerasechainreaction(RT—P wascarriedoutbyreversetranscription—
CR).TheinfluenceofTCM
methodofpromotingcirculationofQiandthebloodanddispersingphlegmonTIMPmRNAgeneexpression
andsecretionbyfoamcellsofphagocyticsourcewasestimated.Results:Comparedtothecontrolgroup,
TIMP一
1mRNAlevelsinfoamcellssignificantlyincreasedinPCQB,PCQDP,PCBDPandPCQBDPgroups
(allP<0.05),butthechangesofTIMP一
1inPCQ,PCB,DPgroupswerenotsignificant(allP>0.05).
TIMP一
2mRNAlevelsobviouslyincreasedinPCQ,PCBandDPgroups(allP<O.05),andthechangeswere
moresignificantinPCQB,PCQDP,PCBDPandPCQBDPgroups(allP<0.O01).Conclusion:TCMmethod
ofpromotingcirculationofQiandbloodanddispersingphlegmcoulddecreasetheincidenceanddevelopmentof
atherosclerosisbypromotingthegeneexpressionofTIMP一1andTIMP一
2.anditplaysanimportantrolein
stabilizingtheunstablespotofatherosclerosis,preventinganddecreasingtheincidenceofcardiocerebral
vasculardiseasesuchascoronaryheartdiseaseandcerebralinfarction.
[Keywords]methodofpromotingcirculationofQiandbloodanddispersingphlegm;traditionalChinese
medicinerecipe;tissueinhibitorofmetalloproteinase;foamcell
CLCnumber:R285.5;R242Documentcode:AArticleID:1008—9691(200
5)04—0238—04
作者简介:张志毅(1965一),男(汉族),山东省临朐县人,教授,主任医师
(Email:zhangzhiyi@medmail.com.cn).
中国中西医结合急救杂志2005年7月箍12第
4—ChinJTCM—WMCrit—Care,July200—5,Vo1.12,No.4一
临床研究表明,益气活血化痰法对于冠心病心
绞痛有良好的疗效,但是其作用机制仍不十分清
楚.近年来许多研究表明,基质金属蛋白酶(MMPs)
表达增多与炎症疾病明显相关?,其中巨噬细胞以
及巨噬细胞源性泡沫细胞表达和分泌的MMPs及
其组织抑制物(TIMPs)在动脉粥样硬化斑块破裂
中起着十分重要的作用n.丹参可减少氧化型低密
度脂蛋白(oxLDI)诱导MMP一2和MMP一9的表
达巧.关于益气活血化痰法中药对巨噬细胞源性泡
沫细胞表达和分泌TIMPs的影响,国内外尚未见报
道.首次采用逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)方
法观察益气活血化痰法中药对泡沫细胞TIMP一1
及TIMP一2的mRNA表达影响.
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器:RPMIl640培养粉(美国
GIBCO公司),TRIZOIReagent(美国生物技术联
合公司),RT—PCR试剂盒(美国CIONTECH实
验室联合公司),明胶和琼脂糖(美国Sigma公司);
引物合成由上海博亚生物公司完成.体积分数为
5的COz孵育箱,低温高速离心机,相差显微镜,生
物超净台和PCR仪.
1.2巨噬细胞培养及鉴定:取8,12周Balb/c型
雌性小鼠,脊髓离断法处死,以质量分数为0.85
的盐水冲洗小鼠腹腔,回收腹腔灌洗液,离心,重悬,
以每孔5×l0个巨噬细胞接种到6孔培养板中,加
入无血清RPMIl640培养液,谷氨酰胺4mmol/L,
青霉素100kU/L和链霉素100mg/L.贴壁2h后
以无血清培养液轻轻吹打,将没有贴壁的细胞除去,
再加入RPMI1640培养液.谷氨酰胺4mmol/L,青
霉素lOOkU/L和链霉素l00mg/I,每24h换液
1次,用相差显微镜观察细胞情况.
1.3oxLDI制备:一次性密度梯度超速离心法分
离人血清低密度脂蛋白(LDL),IDI提取液用磷酸
盐缓冲液(PBS)透析后,Lowry法测蛋白含量,以
PBS稀释LDL至1g/L,加入CuSO至终浓度为
lo>mol/I,37C,孵育24h,4C于PBS中充分透
析去Cu抖,用预染脂蛋白琼脂糖凝胶电泳观察电泳
迁移率来鉴定脂蛋白氧化程度.微孔滤膜过滤除菌,
Lowry法测蛋白含量,定量后4C保存备用.
1.4泡沫细胞的培养:巨噬细胞培养瓶内加入无血
清RPMI1640培养液,谷氨酰胺4mmol/L,青霉素
lOOkU/L,链霉素l00mg/I及oxIDLl00mg/L,
每24h换液1次,如果细胞生长良好,且在相差显
微镜下可以看到沿细胞膜排列透明的小脂滴,表明
?
239?
泡沫细胞已经形成.
1.5实验分组:空白对照组,益气组(白参,黄芪
等),活血组(赤芍,川芎等),化痰组(半夏,栝楼,薤
白等),益气活血组(白参,黄芪,赤芍,川芎等),益气
化痰组(白参,黄芪,半夏,栝楼,薤白等),活血化痰
组(赤芍,川芎,半夏,栝楼,薤白等),益气活血化痰
组(白参,薤白,半夏,桂枝,赤芍,川I芎等).各组所用
中药按0.3#l/ml培养液配制,含生药300mg/I.
1.6RT—PCR分析:采用常规分子生物学技术,
将泡沫细胞消化,离心后接种于细胞培养瓶中,待细
胞生长至亚融合状态时,分为上述8个实验组,培养
24h,提取各组RNA(按TRIZOI试剂盒内说明进
行操作),电泳鉴定RNA的质量,紫外分光光度计
定量.取RNA2g,采用RT—PCR进行cDNA合
成(严格按照逆转录试剂盒说明步骤进行操作)及逆
转录产品扩增.用8一肌动蛋白(8一actin)作为内参
照进行PCR半定量分析.参照文献C6D
引物,引
物序列为:l9一actin上游:5f_AAGCAGGAGTAT—
GACGAGGAGTCCG一3;下游:5一GCCTTCAT—
ACATCTCAAGTTGG一3;产物长度为3l4bp.
TIMP—l上游:5一CTGGCATCCTCTTGTTGC—
TA一3;下游:5GGGATCTCCAGGTGCACA—
A一3;产物长度为580bp.TIMP一2上游:5AG—
ACGTAGTGATCAGGGCCA一3;下游:5GTA—
CCACGCGCAAGAACCAT一3;产物长度为
490bp.反应体系为5o1:各组cDNA产物21,
2.5U/tdTaq酶0.25l,10×反应缓冲液5l,
dNTP4l,一actin上,下游引物各1l,TIMP一1
(或TIMP一2)上,下游引物各1l,无菌双蒸水
351.反应条件为:94C变性30S,58C退火30S,
72C延fe45S,35个循环.每一PcR重复3次.
1.7统计学处理:采用SPSS12.0软件进行分析,
数据处理用均数?标准差(z4-s)表示,采用方差分
析进行检验.P<O.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1中药对泡沫细胞TIMP—lmRNA表达的影
响(图1):与空白对照组相比,益气活血,益气化痰,
活血化痰及益气志2o生!旦箜鲞箜塑!尘!!!!:!:
A
770bp
750bp612bp
6l2bp
2345678
组别
注:A为电泳结果,1,9分别为空白对照组,益气组,活血组,化痰
组,益气活血组,益气化痰组,活血化痰组,益气活血化痰组,
Marker;B为各组TIMP一1mRNA表达相对含量分析,1,8分别
代表空白对照组,益气组,活血组,化痰组,益气活血组,益气化痰
组,活血化痰组,益气活血化痰组;与空白对照组比较:P<0.05
图1益气活血化痰法中药对泡沫细胞TIMP一1mRNA表达的影响
Figure1EffectsoftraditionalChinesemedicinemethodof
promotingcirculationofQiandbloodanddispersingphlegm
onthemRNAexpressionofTIMP一1secretedfromfoamcell
3讨论
MMPs可来源于多种细胞,在细胞外基质破坏
与降解过程中作用重要.作为金属蛋白酶天然的抑
制因子,TIMP一1可抑制MMP一9的作用,而
TIMP一2则起到抑制MMP一2的作用.研究表
明,MMPs及其抑制剂的平衡与心脑血管疾病的发
生密切相关,并且可预测心脑血管疾病的发生?.现
代药理研究证明,益气活血化痰法中药所用的白参,
薤白,川芎,半夏和栝楼等均有明显的扩张冠状动脉
(冠脉),增加冠脉血流量,改善缺氧,使损伤心肌得
以恢复,增加心肌顺应性的作用,临床上可缓解心绞
痛,同时可清除自由基,减少氧自由基对细胞膜脂质
的过氧化作用,明显降低心肌耗氧量和氧利用率,改
善心肌氧代谢,调节脂质代谢,抗动脉粥样硬化
(AS),改善患者心排血量,心脏射血分数,每搏指
数,具有正性肌力作用;而栝楼不但有抗氧化及心肌
保护作用,尚可协助当归起到抗心律失常的作用..
本实验结果表明,益气活血化痰法中药可显着
促进泡沫细胞TIMP一1和TIMP一2mRNA表达,
明显优于对照组;尤其对TIMP一2mRNA表达,其
2?5
2?0
曼
1.5
n
l0
苫
0?5
0
A
23456789
TIMP2
(490bp)
B—acti11
(314bp)
2345678
组别
注:A为电泳结果,1,9分别为Marker,益气活血化痰组,益气活血
组,益气化痰组,活血化痰组,益气组,活血组,化痰组,空白对照组;
B为各组TIMP一2mRNA表达相对含量分析.1,8分别代表益气活
血化痰组,益气活血组,益气化痰组,活血化痰组,益气组,活血组,化
痰组,空白对照组;与空白对照组比较:P<O.05,一P<0.001
图2益气活血化痰法中药对泡沫细胞TIMP一2mRNA表达的影响
Figure2EffectsoftraditionalChinesemedicinemethodof
promotingcirculationofQiandbloodanddispersingphlegm
onthemRNAexpressionofTIMP一2secretedfromfoamcell
作用优于益气组,化痰组,活血组.说明益气活血化
痰法中药可能在抗As脂质斑块形成及破裂中起一
定作用.
总之,本实验结果揭示:益气活血化痰法中药可
增加泡沫细胞TIMP一1和TIMP一2mRNA表达,
减少AS发生,且可能起到稳定AS不稳定斑块,减
少冠心病,脑梗死等心脑血管疾病的发生和预防作
用.然而,体外细胞培养的方法虽然能模拟体内环
境,单独探讨益气活血化痰法中药对泡沫细胞的作
用,但毕竟与人体内环境有差别,不能完全代替体内
实验,所以还需进一步进行动物在体实验及大规模
临床观察.
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(收稿日期:2004—12—22修回日期:2005—05—15)
(本文编辑:李银平)
大黄救治急性有机磷药物中毒疗效观察
李雪苓
(安徽中医学院第一附属医院,安徽合肥230031)
【关键词】中毒,有机磷农药;大黄;治疗
中图分类号:R278文献标识码:B文章编号:1008—9691(2005)04—0241一O1
重症急性有机磷农药中毒(A0PP)
病死率高.我院急诊科用大黄救治口服
中毒者效果显着,报告如下.
1临床资料
1.1病例:68例A0PP患者均符合陈
灏珠主编的《实用内科学》诊断标准,随
机分为治疗组36例,对照组32例.治
疗组男5例,女31例;年龄19,54岁,
平均4O岁;轻度中毒6例,中度中毒
12例,重度中毒18例;敌敌畏中毒5例,
乐果中毒22例,对硫磷中毒6例,甲胺
磷中毒3例;病程0.5,5.6h,平均
3.8h.对照组男3例,女29例;年龄
22,54岁,平均39岁;轻度中毒5例,
中度中毒12例,重度中毒15例;敌敌畏
中毒4例,乐果中毒19例,对硫磷中毒
4例,甲胺磷中毒1例,敌百虫中毒2例,
内吸磷中毒2例;病程0.3,6.0h,平均
3.5h.两组患者年龄,性别,病程,病情
程度方面差异无显着性(P均>0.05),
具有可比性.
1.2治疗方法:两组患者均采用常规综
合抢救措施,洗胃至洗出液色清且无药
味为止,在阿托品,解磷定静脉注射的同
时给予降颅压,利尿,纠正水和电解质紊
乱等对症处理.对照组洗胃后经胃管注
入质量分数为2O的硫酸镁250ml导
泻;治疗组给予大黄液200ml口服,以
后每日服1次,不能口服者用鼻饲,直至
作者简介:李雪苓(1963一),女(汉族).
安徽省合肥市人,硕士研究生,副主任医师.
?
经验交流?
表1两组患者ChE活性恢复,意识转清及首次排便时间比较(土)
注:与对照组比较:’P<0.05,一P<0.01
表2两组患者阿托品的使用及住院天数比较(?)
注:与对照组比较:’P<0.05
患者各项检查恢复正常.
1.3观察项目:观察两组患者胆碱酯酶
(ChE)活性恢复情况,昏迷患者意识转
清时间,两组阿托品使用量及住院天数.
以患者临床症状,体征消失,全血ChE
活性稳定在正常的7O%以上为治愈.
1.4统计学方法:计量资料用t检验,
计数资料用x检验.
2结果
2.1两组ChE活性恢复情况,意识转
清,首次排便时间见表1.
2.2两组阿托品化时间,阿托品化用
量,阿托品总用量及住院天数见表2.
2.3两组临床治愈率比较:治疗组治愈
35例(97.2),死亡1例;对照组治愈
27例(84.4),死亡5例(X一3.47,
P<0.05).
3讨论
临床采用大黄导泻治疗AOPP能
提高患者抢救成功率,收到满意效果.大
黄具有清热解毒,通腑泻浊,攻积导滞,
泻下之功效,配合常规综合救治AOPP,
患者首次排便时间缩短,对ChE活性的
恢复,昏迷患者意识转清,减少阿托品用
量,缩短住院时间方面均有较好的效果.
提示口服大黄能有效促进胃肠蠕动,清
除肠道内细菌及毒素,改变中毒的自然
演变过程,提高治愈率.
现代医学研究证明,大黄能活血化
瘀,改善微循环,清除肠道内细菌及毒
素,同时增加肠蠕动,泻下通便,促进新
陈代谢,对肠黏膜有显着的保护作用,这
是大黄治疗有机磷农药中毒的基础”?.
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染致早期肺损伤防治作用的机制探讨
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(收稿日期:2005一O6—06)
(本文编辑:李银平)