【doc】鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原性的研究

【doc】鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原性的研究 鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多 聚蛋白DNA疫苗免疫原性的研究 l7卷6期 2001年I1月 生物I程 Chb~eseJournalofBiotedmology V0l17No.6 November2oo1 鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多聚蛋白 DNA疫苗免疫原性的研究 于涟李建荣黄耀伟粱雪芽孟松树 浙江大学动物预防医I芋研究所杭州310029 摘要鸡白细胞介素2(IL-2)基是新近被确定的1哺乳类IL-2基因.将鸡白细胞介素2(IL-2)基因和传染性法 氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白基田(VP2/VP4/VP3)分别插A真核表达载体pcI的CMV启动子下赫,制备DNA痘苗, 免疫14日龄SPF鸡,14d后二免.二免后3d攻击强毒株.结果表明共注射鸡IL-2质粒能明显增强DNA疫苗 对强毒攻击,保护率达80%;能增强DNA疫苗诱导的中和抗体效价(P<0.05);能显着促进鸡胸腺,睥脏和外周血 液T淋巴细胞及法氏囊B淋巴细胞增殖反应(P<005).这些结果提示鸡IL一2能明显增强IBDV多聚蛋白DNA疫 苗的免疫原性,是一种优良的禽娄D^疫苗住剂 关键词鸡白细胞彳r素2(IL-2),传染性法氏囊病病毒(IBDV),多聚蛋白基因DNA疫苗.免疫原性 中围分类号Q78文献标识码A文章编号1000,3061(2001】06—0652.06 白细胞介素2(IL广2)是一种极为重要的淋巴因 子,自从1983年Taniguch首次克隆了人IL一2eDNA 以来,迄今为止至少已克隆了3O种哺乳动物的IL一2 基因,并已被广泛应用于DNA疫苗的免疫试验中, 研究发现IL-2能通过不同作用环节调节和增强 DNA疫苗的免疫效果,发挥其佐剂效应.但对禽类 IL一2的分子生物学研究远远滞后于哺乳动物'!. 主要原因是长期以来对鸡细胞因子和调节基因结构 知之甚少,而且鸡IL一2与哺乳动物IL-2差异较大, 使得在哺乳动物中使用的成功技术都无法应用于鸡 IL-2的研究.直至1999年,鸡IL-2基因才正式被定 序,最近研究发现重组鸡IL-2分子有类似于哺乳动 物IL一2的活性,但是否对禽类DNA疫苗具有广 泛的调节和增强作用尚不十分清楚. 传染性法氏囊病(tBD)是目前危害世界养禽业 的三太主要传染病之一,该病的病原传染性法氏囊 病病毒(IBDV)主要侵害雏鸡的中枢免疫器官法氏 囊,造成免疫抑制和其它疫苗的免疫失败IBDV为 双股双节段RNA病毒,其基因组由A,B两个节段组 成,其中A节段包括两个部分重叠的开放阅读框架 (ORF1和0RF2).ORF2编码与病毒致病性有关的 VP5蛋白";ORF1编码多聚蛋白(VP0),经加工剪切 成3个成熟的蛋白VP2,VP4和VP3.VP2是病毒 的主要宿主保护性抗原,VP3是群特异性抗 原,VP4是病毒的蛋白酶.B节段编码VP1蛋 白,VP1具有RNA依赖的RNA聚合酶活性,并且是 A,B节段之间的连接蛋白.",A,B节段两端均存 在非编码区(NCRs),NCRs虽与病毒毒力无关,但是 病毒繁殖复制所必须的序列.".DNA疫苗预坊传 染性法氏囊病的研究尚处于起步阶段,Fordor等" (1999)初步证明IBDV多聚蛋白基因免疫能产生保 护性反应,但效果不及常规的弱毒疫苗.因此,如何 提高诱导机体免疫应答效率是今后IBDVDNA疫苗 重点研究方向.本研究旨在克隆我国地方品种鸡 (萧山鸡)的IL一2基因,构建了真核表达载体,并探 讨其对IBDVDNA疫苗免疫效果的影响 1材料与方法 1.1实验用鸡,病毒株及疫苗 SPF鸡和SPF鸡胚购自山东家禽研究所SPF鸡 试验场;萧山鸡购自萧山市某鸡场.传染性法氏囊 病病毒zJ2000株是本所从杭州某鸡场新近分离到 的强毒株.IBDV标准强毒株BC6/85株购自中国兽 药监察所. 收稿日期:2001—05-30,修回日期:2001.08一l3. 基金项目:国家"863"高科技资助(1Ol-j99~02)和国家重点科技项目资 ~(96-920—34-02). }通讯作者,Tel:86-057l-86971092:Fax:86-571—85158548;E—mail:yuli~@zju.edu肌 6期于涟等:鸡向细胞介素2增强传染什法囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原性 的研究 1.2质粒和菌株 E.cdiDH5~~菌株由本室保存,克隆载体pGEM一11 EasyYL~tor,真核表达载体pCI均购自Pmmega公司. 1.3工具酶和试剂 Superscript~eampIificationstem反转录试剂 盒,RNA抽提TdzoI试剂盒,RPMI1640培养基,MEM 培养基,Hanks等购自Gibco公司;ExpandHighFi— delityPCRSystem购自BoehringerMam~heim公司;限 制酶,dNTP,T4DNA连接酶均购自大连宝生物工程 公司;ConA,PMA,MTr为Sigma产品;Sepharose2B柱 由本校生化所提供.RPMI1640培养液和Hanks液 按说明书配制,过滤除菌,4?保存备用一ConA,PMA 以RPMI1640培养液配制成1~.g/mL的溶液,MTr以 RPMI1640培养液配制成5mg/mL的溶液,过滤除 菌,一20%保存. 1.4鸡白细胞介素2基因的克隆 鸡脾淋巴细胞悬液的制备按Sundick等报道 的方法进行.无菌分离萧山鸡的脾脏,捣碎置于无 Ca2',Mg2PBS(pH7.2)中,300g离心10rain,取上清 液50Dg离心30rain收集淋巴细胞.PBS洗涤3次.再 RPMI1640培养液洗涤1次,用RPMI1640培养液 将细胞稀释成8xl06个/mL,加入终浓度为IOp.~mL 的ConA,5%CO,培养箱40?培养6—12h.Tfizol试 剂盒,步法提取淋巴细胞总RNA.根据Sundick等 和Kaiser等"0发表的鸡IL一2基因cDNA序列.1 对引物(由上海生物工程公司合成).P1(5一3GG— GAcAcTGccATGATG-3),P2(5一AATrrATrAAATGT— CATCTAGAAG一3).预期扩增737bp片段,循环条件 为94?变性45s,48%退火1min,72?延伸1rain.共 3O个循环,72?延伸lOmin.回收目的片段克隆人T 载体并测序. 1.5传染性法氏囊病毒Z|2O00株多聚蛋白基因的 克隆 根据已发表的IBDV—CEF94株基因组A节段序 列设计I对引物,P3(5cGGAA_r|cATcA— CAAACCTGCAAGATCAA3),P4(5TAGGTACCTCACT— CAAGGTCC3"CATCAGAGAC3).IBDV基因组dsRNA 的抽提按Boot等和Akin等:报道的方法进行, 反转录按GibeoBRL的SuperscriptPreamplification System试剂盒进行,PCR按ExpandHighFidelityPCR System的操作指南进行.优化后的循环反应参数为 94%预变性2nfin,94~C变性15s,61?退火30s,68oC 延伸3min.最后72?保温3rain,共30个循环.分别 回收目的片段,克隆人T载体并测序. 1.6鸡IL-2和]flBDV多聚蛋白基因真核表达载体 的构建和DNA疫苗的制备 按常规方法进行,EcoRI和1分别从T载体 中切FIL一2和VP9基因.插人真核表达载体pCl的 CMV启动子下游,构建成pCI—IL-2和pC1VP9,进行 PCR鉴定和酶切鉴定.质粒大规模制备按常规的碱 裂解法,并经Sepharose2B柱纯化后制成DNA疫苗. 1.7动物攻毒保护试验 14日龄SPF鸡120只,共分成6组,即pC1.VP9 pCl—IL-2组,pCI—VP0组,pCl一1L.2组,pCl组,正常 对照组和攻毒对照组,每组加只.所有免疫组于 14日龄首次免疫,14d后,进行二次免疫,免疫途径 均为肌肉注射和皮内注射结合法,剂量为200p.gt只 二次免疫后14d,每组各取15只鸡分别攻击中国标 准强毒株BC6/85株,攻击后3d人工扑杀,称取鸡体 重,法氏囊重和脾重,计算平均囊体比和脾体比,检 查鸡的法氏囊,脾脏等器官的眼观病变,所有法氏囊 用10%甲醛固定 1.8血清中和抗体动态规律的测定 随机翅静脉定期采集各天组5只鸡的血液,分 离血清,56%灭活30rain.常规法制备鸡胚成纤维细 胞,采用固定病毒稀释血清法测定鸡群的中和抗体 效价. 1.9淋巴细胞增殖反应的测定 各组鸡在首免后1,2周,二免后1,2,3,4,5,6 周随机剖杀5只鸡,无菌采集外周血液,脾脏胸腺, 法氏囊等制成单淋巴细胞悬液.MTr法分别测定 法氏囊B}样巴细胞,胸腺,脾脏,外周血液T淋巴细 胞,脾脏T和B细胞的增殖反应.取5O法氏囊淋 巴细胞和50脾淋巴细胞分别加人50PMA溶液 (1itg/mL),5%CO2培养箱40?培养21h;取50btL胸 腺淋巴细胞和50脾淋巴细胞分别加入50t~LConA 溶液(4oL/mL),5%cO2培养箱40%培养48h;上述 培养物均加入10"LMYr(SnWmL),继续培养3h后 加人10%SDS—qOlmol/LHC1溶液IO0~L,混匀,培 养2h后,以对照孔调零,测定OD,.删值,每个样品 设5个重复孔. 1.10统计学分析 利用SPSS软件包按生物统计学上的方差分析 法对平均囊体比,平均脾体比,中和抗体数据,细胞 增殖反应数据进行统计学处理,显着水平为P< 0.05.某个时间的中和抗体效价以5只鸡的中和抗 体的几何平均数(GMT值)表示;某个时问内的淋巴 细胞增殖反应以5只鸡的OD平均数表示. f瓣缝趣敷j 1.11法氏囊病理组织学观察 所有试验组雏鸡的法氏囊用10%甲醛固定,常 规法石蜡包埋,切片,苏木精伊红染色,镜检,观察 法氏囊的病理组织学变化. 2结果 2.1鸡几.2cDNA的序列特征 克隆的萧山鸡IL-2cDNA全长共737个核苷酸, 编码143个氨基酸的前体蛋白,还包括l2个桉苷酸 的5非编码区和293个核苷酸的3非编码区(Gen— Bank收录号为AY029588).在3一UTR序列中包含5 个重复的不稳定基序"ATI3"A",这可能与mRNA的 快速降解有关,此外在3非编码区还含有一个多聚 腺苷酸信号.序列同源性比较发现,克隆的鸡II一基 因与C-enBank中收录的另外两条鸡IL一2基因序列 (AF000631和AF033563)仅有1,3个氨基酸的差 异,同源性高达96.6%,99.3%.与同为非哺乳类 的火鸡IIJ.2的同源性高达69.4%,与人IL.2同源性 高达29.4%,与其它哺乳动物的同源性在21.2%, 27.6%左右.二级结构预测表明鸡IL.2分子N端 存在一个长22个氨基酸的前导肽,4个半胱氨酸形 成两个链内二硫键,并存在类似人IL-2的4个n螺 旋,这些结构在维持IIJ.2生物学活性中起到重要作 用(图1). ?………IS…L_TT^…S 0 0"M%^^口a心I^T"胛1"c?T眦^ tILP…L】ILDLEIL………ELT 20 Ma^c?邮??"an"cw??r帕 PTE…cT0qTLq……vTLIItET… ?0 ^心?研a-"^c^^fI=[ EHL…TcLHT6s 'D 图1萧山鸡IL-2eDNA及编码的氨基酸序列 Fig.1Xiat~hanchickenIL-2cDNAandpredicted and.noacidsequence TheeDNAis737bpinllgLh柚disente~dinGeaBank (NoAY029588);1he_Du,chickenIL-2p~teinis 143…adThecodeandstopcodeunderlined nT^~peats-whichreducemSNAhalf-life-?boxed Thep|丑li帅sig~qalissl10硼byash~Iow 2.2ZJ2000株多聚蛋白基因的序列特征 克隆的IBDV.zJ2000株多聚蛋白基因(VP2/ 程7卷 VP4A~P3)全长3036个核苷酸(GenBank收录号为 AF321056),编码完整的多聚蛋白.与其它毒株相 比,ZJ2000株共有l4,38个氨基酸的替代,其中特 有氨基酸6个,变异太多数集中在VP2高变区,突变 率达2.9%,11%,第二个小亲水区内280位氨基酸 由S替代了N,290位M替代了L,这两个突变可能 与IBDV的抗原性有关VP2VP4剪切位点附近511 和540位氨基酸的变异可能是导致ZJ2000毒力增 强的关键系统进化树分析表明ZJ2000株与德国 强毒株Cu一1的亲缘关系最近. 2.3鸡皿.2增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗对强毒 的攻击保护效果观察 DNA疫苗于14日龄首免,2周后二免,二免后2 周攻击中国标准强毒株,结果表明(表1)pCI.VPO组 的攻击保护率仅达60%,而pCIVPO+pCl—IL.2组的 攻击保护率达80%,说明鸡IIJ.2能明显增强IBDV DNA疫苗对强毒的攻击保护.pC1.IL2对照组,pCl 对照组,攻毒对照组均出现1BD典型的临床症状,病 理变化和组织学病变.病鸡主要表现为精神萎顿, 羽毛蓬松,拉白色粪便,并出现鸡只的死亡,剖检发 现法氏囊水肿(P<0.05),内有大量干酪样物质,法 氏囊粘膜有点状出血,脾脏肿大(P<0.05).组织 病理学变化表现为法氏囊淋巴细胞城少,萎缩,坏 死,淋巴滤泡消失,呈空泡状,结缔组织大量增生. 2.4鸡n.2增强DNA疫苗诱导的体液免疫应答 效果观察 各组质粒免疫SPF鸡后的中和抗体动态变化规 律见图2.pCl—VP0组首次免疫后10d内基本检测 不到抗体,免疫后2周开始上升,至二免后14d的抗 体效价达2599,免疫后49d开始下降.pCI-VP0+ pCI.IL-2组在首次免疫后lOd便可检出中和抗体,至 二免后14d可达3057.4,至二免后56d还呈上升趋 势,整个检测过程中的抗体效价显着高于pCI.VP0 组(P<0.05)(图2),说明共注射鸡IIJ.2质粒能显着 增强DNA疫苗诱导的中和抗体水平.在整个试验 过程中,pCl对照组,pC1.IL.2对照组和正常对照组 均未检测到特异性的1BDV抗体. 2.5鸡m.2增强DNA疫苗诱导的B淋巴细胞增 殖效果观察 各组质粒DNA免疫后每隔1周剖取法氏囊,分 离B淋巴细胞,经PMA刺激后,MTT法测定B淋巴 细胞的增殖动态,结果见图3.共注射IL-2质粒组 法氏囊B细胞的增殖反应显着地高于单注射pcI. VP0组(P<0.05)+而pCI对照组均无明显反应,说 6期于蛙等:鸡白细胞介素2增强传染性法吒囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原 性的研究655 表1鸡ll__2增强IBDVDNA癌苗对强毒株的攻击保护率 Table1EnhancedprotectiveinanuneresponseofDNAvaccineby~administrationof? mooingchicken2 BursalIil?I…0…l…;1=mildcelldepictioninawfoLLMes;2=~derateatophoFeel1depletionin113to112thef oWeles;3…e …sa口datrophyinallfolli~l~"Vushowaver5for15chickensAverge.georgnn/BWe咤dingrams/totalbody?Bin一Bindicates v…】?cgmtitandiffe~ntwI1hnodal.cmtm【(P>005)bindieat~valu~a日ifleantlydlff~emwithll0Hne~trol(P<0.05) 喜 言 差 主 { 图2IL-2增强IBDVDNA疫苗诱导的中和抗体反应 Fig2EtlhancedanliboresponseofDNAvaccineby co-administrationofpX~smidencodingchickenII--2 Weekspostinoculation 图3IL-2增强法氏囊B淋巴绑胞的增殖反应动态 F3EnhancedBlymphoey~eprolifPrationresponseofbby eo—administrationnfpl~midencodingchickenIL-2 明鸡IL-2能促进DNA疫苗诱导的B细胞的生长,发 育和成熟. 2.6鸡儿.2增强DNA疫苗诱导的T淋巴细胞增 殖效果观察 各组质粒DNA免疫后每隔1周分别分离外周 血液,胸腺和脾脏T淋巴细胞,经ConA刺激后,,1lrr 法测定T淋巴细胞的增殖动态,结果分别见图4,图 5和图6.共注射IL-2质粒组的外周血液,胸腺和脾 脏T细胞的增殖反应显着地高于单注射pCl—VPO组 (P<0.05),而pCI对照组均无明显反应,说明IL一2 O7 O6 05 ? 亭 D2 Dl 0 012345678 Weekspostl0an肌 图4鸡Iio-2增强外周血液T淋巴细胞增殖反应动态 rig.4EnhancedTl~mlphocyteprolifera~onresponseofpep}|era1 bloodbyco—administrationofpX~smidencodingchickenIio-2 Weekspostmoeulatio~ 图5IL-2增强胸腺T淋巴细胞的增殖反应动态 Fig5EnhancedTlymphocyteproliferationresponseofthymus byco-administrationofplasmidencodingchickenIL-2 | 8 Weeksposlinoculation 图6lll_2增强脾脏T淋巴细胞的增殖反应动态 Fig.6EnhancedTlyrephocyleproliferationresponseofspleen hyco-administrationofplasmidermdngchickenlll_2 ;抟 . ?雌?0 l亭 ;日e 生物T程 能促进DNA疫苗诱导的T细胞生长,发育和成熟 3讨论 传染性法氏囊病病毒主要侵害雏鸡中枢免疫器 官法氏囊中的B淋巴细胞,导致免疫抑制.近年 来,由于变异株和超强毒株的流行,经常导致免疫失 败'..".基因免疫的发现为传染性法氏囊病的防 治提供了一条新思路.以多聚蛋白基因构建的真核 表达载体可在细胞中表达形成病毒性颗粒,并可正 确剪切成天然构象下的主要宿主保护性抗原VP2 蛋白.Fordor等"(1999)发现多聚蛋白基 DNA疫苗虽能产生免疫保护.但效果不及常规疫 苗,这可能与质粒DNA的给予途径,吸收,抗原表达 和提呈等诸多因素有关,另外一个重要的原因是至 今还未发现一种有效的佐剂作为禽类DNA疫苗免 疫增强剂.目前常用将抗原基因与细胞因子质粒联 合注射或融合共表达的方法来增强DNA疫苗的免 疫效果,其中IL-2的应用最为广泛,哺乳动物lI2 已被广泛用作DNA疫苗的免疫增强剂""但对 鸡IL-2的研究正处于起步阶段,虽然研究表明鸡IL一 2能增强体外诱导培养的鸡T淋巴细胞增殖.但在 体内是否也和哺乳动物IL-2,样对DNA疫苗具 广泛的调节作用尚未清楚 从研究结果来看,鸡IL一2增强了IBDV多聚蛋 白DNA疫苗的免疫原性.其一是鸡IL-2提高了 IBDVDNA疫苗诱导的T淋巴细胞增殖反应的强 度,pCI.IL.2和口cI—VPO联合免疫组的脾脏,胸腺,外 周淋巴血液的T淋巴细胞增殖强度均显着地高于单 注射pcI.VPO组(P<0.05),而T淋巴细胞的增殖强 度与细胞毒T细胞(CTL)的杀伤活性成正相关,最 终提高了鸡体的细胞免疫功能.其二是鸡II,2增 强了IBDVDNA疫苗诱导的B淋巴细胞增殖反应的 强度,联合免疫组的法氏囊B淋巴细胞增殖强度显 着高于单注射DNA疫苗组(P<0.05),而B淋巴细 胞增殖强度反应了鸡体的体液免疫功能,具体表现 为提高诱导中和抗体的能力,其结果恰与中和抗体 的检测结果相吻合,联合免疫组诱导的中和抗体水 平显着高于单注射DNA疫苗组(P<0.05).其三是 鸡IL-2增强了IBDVDNA疫苗对强毒的免疫保护. 缓减了IBDV症状,其根本是鸡IL一2增强了体液免 疫和细胞免疫功能,当然也并不排除鸡IL.2对IBDV 的感染具有免疫治疗作用的可能性. 本研究,我们得出3个主要结论:1l从经 ConA活化的鸡脾淋巴细胞中克隆到了鸡IL.2 7卷 cDNA,其基因结构和特征与国外报道的一致;2.传 染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫可诱导SPF鸡 对强毒株的免疫保护作用;3.克隆的鸡IL-2能明显 增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫原性,包括T 细胞和B细胞的增殖,特异性的抗体反应和对强毒 的攻击保护率.这为研制新一代禽类疫苗免疫增强 剂奠定了基础. 致谢:衷0感谢浙江省农业科学院顾亚仙研究员 和厦文英饲养员在动物试验中给予大力支持;感谢 宋厚辉硕士,谢荣辉硕士,陈吉刚硕士,张德勇硕士, 张晓峰硕士,卢觅佳硕士在抗体检测和淋巴细胞增 殖试验中给予走量无私的帮助:感谢杨启秀教授,鲍 美实验师在痛理切片制作中给予的指导和帮助. REFERENCES(参考文献) 【l:Sund[ckRs.Gift—DixnnCAclonedchickenlvmphokineho~logeus tob0thrnam蚰IL-2andIL-15+Jt.~ad.1997,159(2):720, 725 [2]Kai~rP.Mari~liPP~rnote;q?口:intmntn】tu,口d synten)ofgenetic[~tionshowthata,cJ=e口W1_hT?eel1Dmbf liveactivaLvis1[,-2notIL-I5m.1999,49:26,35 [3ChioKD.1illehojHSRoleofchickenIL-2oNg~delta?-.el1s andE[meria~en,ulina-inducedcba】tnint~t[naliL-2mRNA- pmssiongen~deitaT-~Uscmnu删2000, 73(3】:309,32l 【4]S.Ro~weUL,Kai~rP.Turkeyandchick~interieukin一2 …retinvLtm口mll既Btllmo~aysdespitelimiteda?L帅acid …ceidenthyJtraemtf肿Rez,2000I20<2):161一】70 [5]HJ.HuumeAAHMIH~kmanAJWH?atRevueofveJT vIen1and…cLnfecIjlbursaldise~r叫sfromcloudcONA: VP2isnotthes0kt…toftheHrimientphenot)TeJwr- of,20OO.74(】5):6701,6711 :6】T~kenMGJ,llotfi~PJM,Gielk~^LJda/hne~tions…vi betw~ntheproteinsirzfectlousbllrsal?~.Lmscapsidpro— reinVP3interacts*dthRNA—depend~tRNAlr8IVP】J fenklro1.2000.81:209—2I8 [7.OyhingJKIj~kwoodDJAnlJgeniea口dJmsmamogen[epropertiesof baculov[ms-erpressedinfeeti~hlIld…viralpmteins..4~ia D/s.i998.42:80—9】 【8]l*jslN.c0幽BD,HuetJCRoleofs既-652andLys4~.'2inthepro- $e~ttvitvofinf~tioushumaldi…virusV1"4did~lJfieafion itssttbstmtecl~vagesites.JnVim/,2000.81:983—992 9]F—deariasARj8?C,martin~SExpressi~ofORFA1 inf~tioushuTddisease……Itsinthefountionofviras-like partitas.JVwol,1998,79:1047,1054 [10]SehroderA,v?L00n^A,‰?emD#a/Chi~rasinnoneoding 0Dbel~een~typeand?ofe.men1AofI【cti0barsal diseasevires—viableandshowpathogenicpher~ypeinchiekemsJ 6期于涟等:鸡白细胞介索2增强传染什弦.乇囊病病毒多聚蛋白DN4疫苗免疫原 件的研 t:i.2000.81:533—540 Ford,orI.Ho~.alhE.Fordor】nlduetiono/prot~,tiinnnnunily inchickensimmuni~dwilhpl~midDNAen~MingintecliOllSbnrsal (1;…vinJsantige~ActaP'everinana,199947r4l48I , 492 gkinAWuCC.tinTL"f.Amptifitationandcloningoflnh,- …bu~ald—seviresgenomicRNA…bbylonga?{u【'u?t? PCRJou~l~'irologicalMetheMs.【99982:55,61 Yu1,.SongK.ZhangYefClcmingandexpressiono/theVP2 o/niaf~.tlousb,trsald…rimsAt:innD.200044(I,:I70, 【78 KimJJ.TrlvediNN,NotlinghamLKelalM~lulationotmnplitnde anddictionin……mspon~sbyc~administrationrcy- t.kinegeneexpm~ionc…tIHwl1hDNAi~unngens,lJm— ao/.【998.28【089一【093 ChowYH.HuangWIChiWKetalh,lpro*er,mnt0fhepalitisB vi?…DNAc…byplasmi&~e~xpressinghepatitisBsurf~e genmidinterleukin-2Jt:im/,L997,71:L69,L7g ChowYHChiangBI.TeYtdalOevetoptnemofThIandTh2 lx)putsti(mlhe"…f………sestohepalitisB… DNA~aceinescabemodulatedbyeodelivevro/vario~c?toki~ genesJ肌一f,1998.160:1320一【329 Gei~]erMf~sienATokushigeKEnkane*mentofceliular阴d h~nral………stohepathisCvirescoleproteinusing DNA…bm~ed…augmentedwitheytokine—exp~ssingpl~midsJ l?f.【997.158:1231,1237 EnhancedImmunogenicityofPlasmidEncodingPolyproteinGene ofInfectiousBursalDiseaseVirusbyCo?administration 0fChickenInterleukin2(IL.2) YULianL1Jian—RongHLANG"tao—WeiL1ANGXue—YaMENGSong—Shu tln.mttaeojm??…nMedc6~.zb'nitcrs~Hangzhou310029,Chi,~) Ah,straetChickeninterleukin2(II,2)isoneofimportantnonmanlmaliancytokine~isolatedrecentlyTheinfluenclngof1I:2 onimmunogenicityofDNvaccinesexaminedusinginfectiousbursaldiseasevirus丑 samodelTheII.-2eDNAofXiaoshan chickenandthepolyproteingeneofIBDV— ZJ2000wereamplifiedbyRT-PCR,cloned,sequencedandinsertedintotheeontmlof CMVpromoterandenhancerofpCIvector14一day— oldchickenswerevaccinatedintramuscularlywithDNAvaccine,tWOweeks later.theyreboostedwithDNA,andtwoweekspostboost,theyI_eehallesgedwithvirulentIBDV.Thersuhsshowedthat protectiverep0mesandneutralizationantlhodyresporlsesofDNAvaccineeD— administratedwithchickenIt-2,~teremuchhigher thanthoseofinjectedwithDNAvaccinealoneFurthermore,theTlymphocyteproliteration~esponaeofperipheralblood,thymus andspleen,andtheBlymphocyteproliferationresponseofbursainducedbyDNAvaccinecanbesignificantlyenhancedby chickenIL一 2Theseresultsobviouslyindicatedthatchicke~l11,2wasastronga~uvantwhichcansignificantlyenhancetheira— munogenicityofIBDVDNA~,accine. Keywordschickeninterleukin2(11一2),i~ffectiousbursaldiseasevirus(IBDV).polyproteingene,DNAvaccine,immuno— genicitv R~eived:Mv30.2001 l'nis,k一唧edbygl3anlfromthPNatmnal.863High—Techg~ogram(101一i994~2)NatMn一eTechnoI.KeyPr0(96-92O-34啦) *(Tep?d删Ih町.Tel:g~~571—8697L092~Fax:86—57t85158548;E-nlail:Dfli~@educn 一—?丁;