不同保存条件下中华哲水蚤基因组DNA提取的比较_cropped

不同保存条件下中华哲水蚤基因组DNA提取的比较_cropped 实验与技术 EXP ERIMEN T & TECHNOLO GY 不同保存条件下中华哲水蚤基因组 D NA 提取的比较方旅平 , 林元烧 , 曹文清 ()厦门大学 海洋与环境学院 ,福建 厦门 361005 ( ) 摘 要 : 以采自厦门港的中华哲水蚤 Calanus si nicus为对象 , 研究多种保存条件对中华哲水 蚤基因组 DNA 提取的影响 。结果表明 , 除 5 %福尔马林保存的样品没有提取到 DNA 之外 , 其 余样品均能成功提取出基因组 DNA ; 以该 DNA 为通过相应引物成功扩增出线粒体 DNA COI 基因片段 。其中无水乙醇保存样品提取可靠的基因组 DNA 方法的建立 , 为野外样品保存 工作提供了一个简便 ,经济的途径 。 ( ) 关键词 : 中华哲水蚤 Calanus si nicus; 基因组 DNA 提取 ;保存方法 ( ) 文章编号 : 1000 - 3096 200502 - 中图分类号 : Q33 ; Q959. 223. 31 文献标识码 : A 0001 - 04 进入 20 世纪 90 年代以来 , 分子生物学技术引入 : 首先将中华哲水蚤在解剖镜下清洁体 样品保存 浮游动物遗传学的研究已受到广泛关注 ,此类研究对 表附着物 ,再利用多种方法对样品进行保存 。值得注 DNA 质量的要求较高 。已有的以 DNA 为对象的研究 意的是固定的样品特别是单只冷冻保存的样品 ,在保 中大多数所采用的样品为活体样品或冷冻样品 ,但是 存之前用灭菌纯水进行多次充分的洗涤 。 在野外工作尤其在海上这两者样品保存很难实现 ,因 1. 3 DNA 基因组提取此一种简便可行 , 且又能满足 DNA 水平研究分析的 取出保存的样品 , 若是无水乙醇保存的样品首 样品保存方法相当重要 。针对该问题 ,作者以中华哲 () 先利用梯度稀释浸泡 每个梯度浸泡 1h的方法基本 ( ) 水蚤 Calanus si nicus为研究对象 , 采用 95 %乙醇 去除样品中的乙醇 , 其稀释梯度为 60 % , 30 % , 10 % ( ) ( ) ( ) 4 ?、100 %乙醇 4 ?、5 %福尔马林 4 ?、TE 溶液 和灭菌纯水 , 4 ?过夜 , 再将样品吸干 , 加入 TE 溶液 () H 8. 0100L ; 若为福尔马林保存样品 , 首先通过 p ( ) (μ- 80 ?4 种保存方法对其进行处理 其中 95 %乙醇 梯度稀释浸泡的方法去除样品中的福尔马林 ,其稀释 ) 与 100 %乙醇保存 时 间 相 差 约 为 1a, 提 取 基 因 组 () 梯度同上 , 再将样品吸干 , 加入 TE 溶液 H 8. 0100 p DNA , 通过凝胶电泳 , EB 染色对所提取的基因组 DNA L ; 若为直接单只无溶液冷冻的样品 ,则直接加入 TE μ进行检测 , 探讨了不同样品处理方法及保存时间对 () () 溶液 H 8. 0100L ; 若为单只 TE 溶液 冷冻保存 p μDNA 提取的影响 。本研究结果对于其它浮游小型甲 则无需此过程 。 壳类动物的分子遗传学的研究奠定了良好基础 。 1 材料与方法 1. 1 样品采集 样品采集地点 : 厦门港 , 2001 年 12 月,2003 年 1 月 。采集方法 :采用浮游生物大型网水平拖取 。 收稿日期 : 2003 - 09 - 26 ;修回日期 : 2004 - 02 - 26 1. 2 样品处理及保存 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 础 研 究 重 大 课 题 资 助 项 目室内处理 : 从采集到的海洋动物样品中分选出 ( )G1999043708 ( ) 作者简介 : 方旅平 1978 - , 女 , 浙江衢州人 , 硕士 , 助理工 () 中华哲水蚤 ,置于过滤海水 砂滤中暂养过夜 。 程师 , 研究方向 : 海洋浮游动物生理生态 、海洋分子生态学 , 种类鉴定 : 以形态学为依据 , 利用解剖镜进行整 电话 : 0592 - 2189433 , E - mail :lfan@xmu. edu. cnpg 体鉴定 。 ( ) 破碎样品 ,加入 10 %SD S 溶液 1 : 10,蛋白酶 K ) (?水浴消化 3,4h 。用 T E 溶液 终浓度为 1/ L ,55 g 补至总体积至 350L , 再加入等体积的酚 : 氯仿 : 异 μ ( ) 戊醇 25 : 24 : 1混合溶液 ,混匀 。11000 r / mi n 离心 6 mi n , 吸取上清 。加入等体积异丙醇 , 1/ 10 体积 N aA C ,混匀 。- 80 ?沉淀 1h 。12000 r / mi n 离心 15mi n , 倒出上清液 。加入 70 %乙醇 500 L , 12000 r /μ mi n 离心 5 mi n ,倒出上清液 。晾干 ,加入 30 LT E μ () 溶液 H 8. 0溶解 D N A ,取出 5L 进行琼脂糖凝胶p μ ( ) 0. 8 %电泳 , EB 溶液染色 , 凝胶成像系统拍照以确 定提取是否成功 。提取的 D N A 基因组或进行 PCR 扩增 ,或置 - 20 ?下保存备用 。 () 1. 4 目的基因片段 mt DN A CO I的扩增及纯 化 引物 : 5’ - GGT CAA 正向 : L CO - 1490 CAA A TC A TA AA G A TA T T G G - 3’ 5’ - TAA A C T 反向 : HCO - 2198 TCA GGG T GA CCA AAA AA T CA - 3’ PCR 扩增程序 : ( ) ( ) ( ) 194 ?: 5 mi n ; 294 ?: 1 mi n ; 342 ?: ( ) ( ) 2 mi n ; 472 ?: 3 mi n ; 572 ?: 10 mi n ; ( ) ( ) 其中 4至 2共循环 40 次 PCR 反应体系 :总体积为 25L ,具体如下 :μ ( ) 缓冲液 10 ×: L2. 5 μ品无法提取出 D N A 或者极难以提取出 D N A , 而其 2 + 1. 0Lμ ( ) M 25m mol / L :它保存方法下的中华哲水蚤均可提取出所需 D N A g 0. 5Lμ ( ) L CO - 1490 60mol / L : μ只是提取量有所差异 ,特别是通过高浓度乙醇固定的 0. 5Lμ ( ) HCO - 2198 60mol / L : 样本虽然固定时间达到一年以上但对 D N A 提取量 μ0. 25 Lμ () dN T P 各 2. 5m mol / L : 的影响很小 。 0. 15Lμ ( ) T aD N A 聚合酶 5U / L : q μ2. 2 PCR 扩增结果( )2 L 20n g μD N A 模板 : 以提取出 D N A 的 9 个个体的基因组 D N A 为 18. 1 Lμ H2O : 模 板 进 行 PCR 扩 增 , 并 将 其 产 物 进 行 回 收 纯 化 , () 1. 0 %琼脂糖凝胶电泳 , EB 染色 ,拍照 图 2。() PCR 产物使用小量胶回收试剂盒 华粤公司进 从图 2 中可看出 ,以本实验方法所提取出的 3 种 行纯化 。1 %琼脂糖凝胶电泳 , EB 染色 ,取象 。 不同保存条件下中华哲水蚤基因组 D N A 为模板可 成功扩增出所需的目的基因片段 。 2 结果 3 讨论 2. 1 DN A 提取结果 图 1 为不同保存方法中华哲水蚤 D N A 提取后 以本实验的提取方法无法从福尔马林保存的样品 的检测图 ,其中 ,取模板母液 5L ,加入 1L lo a di n g μμ中提取出 D N A , 结果如图 1 所示 ; 4,6 泳道无法观察 ( ) buff e r 6 ×。0. 8 %琼脂糖电泳 , EB 染色 , 全自动凝 ( 到 D N A 的条带 。这与刘保忠等人的对海湾扇贝 A r 聚成像分析系统拍照 。 实验与技术 EXP ERIMEN T & TECHNOLO GY 24h 。依次进行梯度乙醇中处理 : 80 %乙醇 ,2h ,重复一 次 ; 90 %乙醇 , 2h ,重复一次 ; 95 %乙醇 , 2h ,重复一次 ; 100 %乙醇 , 1h , 重复一次 。然后将材料放入 1/ 2 倍的 PBS 溶液中浸泡 12h ,其间更换一次溶液 。此外在消化 过程中还提到视样品的消化效果可以重复加入标准 量的 1/ 2 倍蛋白酶 K进行消化 。不过 , 提高蛋白酶 K 3 的浓度是否有效还有待研究 , 因为在王义权等 对蛇 的研究中曾尝试延长浸泡时间和采用双倍蛋白酶 K 的用量 , 都没有取得满意结果 。由于本实验及刘保忠 等 、王义权等的实验中在浸泡时所采取的都仅是利用 灭菌纯水浸泡 , 且只通过将浸泡时间延长等方法 , 因 此刘来祥等人的实验中所采取的特别的预处理方法 值得注意及采纳应用 。通过较好的预处理后 , 徐来祥 等的基因组 DNA 的提取方法为参考 Sambroock 等人 4 的方法的一种改进的酚氯仿抽提法 , 酚氯仿抽提最 后一次的上清液移入透析袋中透析 ; - 20 ?环境中 沉淀 DNA 基因组 20 mi n 为宜 。但是由于实验对象不 () 同 如个体大小差异 , 样品生化组成差异 , 等等, 因 此 , 刘来祥等人的实验方法还有待于进一步的探索应 用 , 以达到在海洋浮游动物特别是桡足类研究中获得 满意的实验效果 。 此外 ,另两种固定液保存方法TE 溶液保存 , - 80 ? ( ) 存放 ; 高浓度乙醇 95 % , 100 %保存, 4 ?存放 ] 如 果单从条带的亮度来判断 , 通过 TE 溶液保存和高浓 素有以下几种可能 : 一是没有将样品中的甲醛去除干 DNA 的量相差不多 , 但其中 度乙醇保存后所提取的 以 95 %乙醇 4 ?保存的效果最好 。而同种保存方法提 净 , 甲醛抑制了蛋白酶 K的活性 ; 二是由于该样品已 取出来的 DNA 条带的亮度也并不完全一致 , 如泳道 被福尔马林固定 1a 以上 , 固定样品的 DNA 分子产生 交联作用 , DNA 抽提时与蛋白质等产生共沉淀进入 1,3 为 TE 溶液浸泡 , - 80 ?保存 , 2 号明显比其他 酚相 ; 三是甲醛氧化后形成的甲酸对 DNA 有较强的 的亮 , 这是因为样品保存时有多种不确定的干扰因 1 降解作用 。 素 ,如个体大小 ,个体是否完整 ,每单位固定液体中存 采用一般的方法难以有效地提取福尔马林保存 有的样本个体数量等等 , 并且在提取过程中也不可避 样本的基因组 DNA ,因此在以后的实验中应针对其干 免的存在操作上的误差 。 () 扰因素改进 DNA 提取方法特别是固定后样品提取前 再以同种固定液 高浓度乙醇两种保存时间长 度来看 , 固定 1a 以上的样本与短期固定的样本所提 的处理方法及破壁消化方法尤为重要 。例如徐来祥等 2 取的 DNA 量相差不多 , 而且固定一年以上的样本提 人 成 功 提 取 了 福 尔 马 林 保 存 的 动 物 标 本 基 因 组 取量反而稍多一些 。这种结果的出现除了上述的影响 DNA 认为 : 提取标本基因组 DNA 之前的预处理 ,目的 因素以外 , 95 %的乙醇是否较之 100 %乙醇更适合于 在于去除标本组织中的福尔马林的各种成分 , 该步骤 固定样本及后续实验的进行还有待于进一步的实验 是提取标本 DNA 成败的关键 。因此该文作者先取浸 证明 。高浓度乙醇保存作为野外工作最方便 、最常用 泡于福尔马林中的大仓鼠肝脏或日本鳗鲡肌肉适量 , 的较为经济的保存方法 ,是适合于本实验的一种保 存用 PBS 溶液冲洗 , 放在灭菌的吸水纸上将其揩干 , 在 1 方法 。刘保忠等人 的实验结果中也提出乙醇固定 的超净工作台中用无菌剪刀将材料剪成小块 , 放入 PBS 样品完全可以得到质量很好的 DNA 样品 。关键在 液浸泡 12, 24h ; 然后转入 70 %的乙醇中处理 12, ( ) 2001 , 25 3: 51 - 52. 于固定样品时要小心操作 , 不要使桡足类个体破损 , 徐来祥 , 张知彬 , 宋铭晶 , 等 . 福尔马林保存的动物 保证足够的乙醇用量 ,并要定期更换固定液 。这样有 2 标本基因组 DNA 的提取方法J . 动物学报 , 2002 , 利于之后 DNA 的提取 。 总的来说 , 除了福尔马林保存 , 其余三种保存方 ( ) 48 2: 264 - 269. 法对 DNA 基因组的提取影响差异不大 , 均能通过相 王义权 , 周开亚 , 徐珞珊 , 等 . 不同固定剂保存动物 3 应引物扩增出所需的目的基因片段 。有关该基因片 组织标本对 RAPD 反应的影响J . 动物学杂志 , 段序列及其分析将另文报道 。 ( ) 1999 , 34 1: 33 - 37. 参考文献 : 4 Sambrook J , Fritsch E F , Mai niatis T. 金冬雁 , 黎孟枫 ( ) 译 . 分子克隆实验指南 第二版M. 北京 : 科学 出版社 , 1999.1 刘保忠 , 宋林生 , 相建海 . 海湾扇贝样品不同保存条 件下 DNA 的提取及 RAPD 扩增比较J . 海洋科学 , Genomic D NA extraction of Cala n us si nic usi n different reser2 pvations FANG Lu - i n, L IN Yuan - shao , CAO Wen - i npg qg ( )Collee of Oceanorahand Envi ronment Science , Xiamen Universit, Xiamen 361005 , Chi naggp y y Received : Sep . ,26 ,2003 Kewords : Calanus si nicus ; enomic DNA extraction ;reservationy gp Abstract : Extraction of enomic DNA from reserved seci men i s a kesteto studhloenand molecular e2 gp py p y p ygy gnetics of zoolankton. Thi s aer comared the effect of different reservations on extraction of enomic DNA adoted a ppppp gpsmall crustacean coeod , Calanus si nicus , collected from Xiamen waters. Excet the seci men fi xed i n 5 % of formali n pppp sol ution , enomic DNA was well extracted busi nthe seci men fi xed i n 95 % ethanol and laced at 4 ?, 100 % ethanolgy g pp at 4 ?and TE sol ution at - 80 ?. The enomic DNA can be used as a temlate for PCR rocess of mtCOI ene frament.gppgg ()本文编辑 :刘珊珊