反应性氧族介导缩血管活性物质的作用

反应性氧族介导缩血管活性物质的作用 反应性氧族介导缩血管活性物质的作用 ?624?高血压杂志2005年1O月第13卷第1O期ChinJHypertension,Oct2005,Vo1.13No10 可能与糖尿病高血压的发生发展有关n.].反过 来,高血压又会促进糖尿病患者内皮细胞损伤或功 能紊乱,因此形成恶性循环. 2型糖尿病合并高血压患者存在内皮细胞损伤 或功能紊乱,其高血压的发生发展可能与血管内皮 尽早采取降低血管内 细胞的损伤或功能紊乱相关. 皮损伤或功能紊乱的有效治疗方法,对预防或减轻 糖尿病患者高血压的发生发展和对提高糖尿病的治 疗效果及改善预后可能具有重要意义. 4参考文献 1杨秀敏,刘淑玲.糖尿病并发高血压发病机制的探讨EJ3.医学 综述,2004,11:685-686. 2OuvinaSM,LaGrecaRD,ZanaroNL,eta1.Endothelialdys— function,nitricoxideandplateletactivationinhypertensiveand diabetictype?patientsEJ3.ThrombRes,2001,102:107—114. 3高丽玲,姚光辉.高血压病患者vWF检测的临床意义[-j-]高血 压杂志,2001,9:122—124. 4NadarSK,AlYemeniE,BlannAD,eta1.Thrombomodulin, vonWillebrandfactorandE—-selectinasplasmamarkersofendo—. thelialdamage/dysfunctionandactivationinpregnancyinduced hypertension[J].ThrombRes,2004,113:123—128. 5DeedwaniaPC.Mechanismsofendothelialdysfunctioninthe metabolicsyndrome[J].CurrDiabRep,2003,3:289—292. 6刘莹,王家耀.妊高征脐动脉内皮细胞损伤与一氧化氮合酶的 变化及意义[-j-].实用医药杂志,2003,20:529—531. 7江国强,赵连友,李宏伟,等.高血压患者血浆一氧化氮浓度的变 化[-j-].高血压杂志,1998,6:105—107. 8郭风劲,彭惠民,张政,等.2型糖尿病并发高血压患者血清NO, NOS水平的研究[-j-].中国老年学杂志,2004,24:207—208. 反应性氧族介导缩血管活性物质的作用 杨泽福,冯义柏 【摘要l目的探讨反应性氧族(R0S)在致心肌细胞肥大时同时促进心肌细胞分泌内皮素的作用. 方法在原代培养的乳鼠心肌细胞中.细胞内的氧活性产物用ROS敏感的荧光探针2,7-dichlorofluores— cindictate(DCF-DA)检测.用RT—PCR的方法检测内皮素基因的表达.结果空白对照组细胞内发现极 少量氧活性产物的生成,内皮素一1基因仅少量表达;加用抗氧化剂乙酰半胱氨酸(N—acetylcysteine)的 实验组内仅有极少量氧活性产物,和对照组相比细胞内DCF—DA荧光强度:N一乙酰半胱氨酸加用ET一1组 增加4.8,N一乙酰半胱氨酸加用Ang?组增加3.O;内皮素一1基因的表达与空白对照组没有明显差 异,Prepro-ET相对量增加依次为:N一乙酰半胱氨酸加用ET一1组增加3.8,N一乙酰半胱氨酸加用Ang? 组增加2.9.单用ET-1及AnglI组均见到大量氧活性产物,细胞内DCF-DA荧光强度增加依次为 108.8,104.9%;内皮素一1基因的表达也明显增强,Prepro—ET相对量增加依次为52.4,51.1.结论 ROS在缩血管因子致心肌心细胞的肥大过程中起到信号传递作用,同时ROS也增强内皮素一1基因在 心肌细胞的表达. 【关键词】氧活性产物;缩血管活性物质;内皮素一1;基因表达 ReactiveOxygenSpeciesInducedbytheVascular-constrictionSubstancesYANGZe 一,FENGYi—baiI,z— stituteofCardiovascularDiseaseUnion,HUST,TongjiMedicalUniversity,UnionHospital,Wudan China [Abstract]ObjectiveToexploreroleofROSinhypertrophiccardiomyocytesinducedbythevaso— constrictorssuchasET一 1,AngIIetc.MethodsNeonatalcardiacmyocyteswereculturedandstimula— tedbyET一1andAng?.AntioxidantN— acetyIcysteinewasusedtoblocktheintracellularsynthesisof ROS.2,7-dichlorofluorescindictatewasusedtoexaminetheintracellularROS.WeexaminedtheexDr.ession 收稿日期:2005—01—15 作者单位:武汉市华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管病研究所,湖北武 汉430030 高血压杂志2005年10月第13卷第10期ChinJHypertension,Oct2005,Vo1. 13No10.625. ofpreproendothelin-1genebyRT—PCRassay. ResultsWefoundthatN-acetylcysteinepronouncedly blockthesynthesisofROSandtheexpressionofendothelin-1gene.Comparedwiththecontrolgroup, thefluorescenceintensityofintercellularDCF-DAisincreasedinN-acetylcysteineandAng?group(+4. 6),N-acetylcysteineandET一1group(+4.8),ET一 1alone(+108.8)andAng1Ialone(+104. 9).TheexpressionofPreproET-1increasedby3.8,2.9,52.4,51.1correspondingly.C0n. clusionItindicatesthatROSispivotalinvasoconstrictor-inducedcardiomyocytehypertrophy.whichwas associatedwithincreasesinendothelin-1geneexpressionincardiomyocytes. [Keywords]Reactiveoxygenspecies;Vasoconstrictor;Endothelin-1;Geneexpression 研究表明许多的缩血管活性物质都可以导致心 肌细胞肥大口],早期作为一个适应性的反应对保证 各个器官的血供是有益的,但是从远期效应来看心 肌肥大最终都发展为心衰和恶性心律失常,而在这 个转化过程中内皮素起到了不可忽略的作用.就新 近的研究来看缩血管活性物质可以促使心肌细胞产 生ROSl2],而ROS在这些物质所致心肌细胞的肥 大过程中起到了重要作用,同时又有实验观察到 ROS可以增强内皮素一1基因在肾脏实质细胞的表 达[4].本文主要观察抗氧化剂对缩血管因子致心肌 肥大过程中引起的心肌细胞内皮素一1基因表达增强 的影响,探讨ROS在缩血管物质增强心肌细胞内皮 素基因表达过程中所起的作用,并阐明其作用机制. 1材料和方法 1.1心肌细胞培养及鉴定_l_ 用改良的Simpson法进行心肌细胞培养.具体 过程:取1,3dWistar乳鼠心脏,祛除血液及心房 组织,PBS冲洗,用0.125胰蛋白酶消化心肌组织 成单细胞悬浮液.在37.C,5CO.,pH7.0的培 养箱1.5h,差速贴壁法去出成纤维细胞等非心肌细 胞.调节细胞浓度至1×10mL_.,分种于含20 新生牛血清(购自Gbico公司)的DMEM培养基(购 自Gbico公司)中.第4d的原代心肌细胞用于实 验.用细胞搏动和FITC标记的抗心肌细胞MHC 抗体检验细胞的纯度. 1.2实验分组 N一乙酰半胱氨酸是一种还原剂,已有实验证实 它能够将细胞内的氧活性产物还原从而降低细胞内 氧活性产物的浓度[2].设空白对照组;单纯加ET一1 实验组;单纯加Ang1I实验组;加N—acetylcysteine 和ET一1实验组;加N—acetylcysteine和Ang11实 验组.每组设4个平行孔,重复实验4次.细胞培 养96h后加入实验药物内皮素浓度为10tool/ IL1j,Ang11浓度为10mol/L[,N乙酰半胱氨酸 浓度为10,mol/I口.空白组及其他组液体体积差 均以0.9生理盐水补齐. 1.3细胞内氧活性产物的测定[2 DCF—DA是一种可以和细胞内氧活性产物发生 特异性反应并生成荧光复合物DCF,在荧光显微镜 下记录荧光的强度,以此对细胞内的氧活性产物进 行半定量.细胞培养96h后去除培养基,以含Ca. (1.3retool/L),Mg抖(0.8retool/L)的PBS冲洗两 遍,加入实验药物同时加入无水乙醇溶解的DCF— DA(1Fmol/I),于37C温育40rain到1h,然后用 上述PBS冲洗3次,于荧光显微镜下记录结果.用 图像分析软件分析结果. 1.4内皮素.1基因表达的测定 细胞培养96h后按实验设计加入实验药物,1h 后除去药物及培养基,按一步法l5提取细胞总 RNA,用于RT—PCR实验.内皮素1引物序列[6为 上游:5,-GAACTCCGAGCCCAAAGTAC一3;下 游:5"-CTTGCTAAGATCCCAGCCA一3(宝生物 工程有限公司合成),扩增长度为320bp.内参照 GAPDH的引物序列为上游:5,_AATGCACCT GCACCACCAACTGC一3;下游:5,_GGAGGC CATGTAGGCCATGAGGTC一3(宝生物工程有 限公司合成),扩增长度为555bp.反应结束后分别 取PreproET一1cDNA的PCR产物3L,GAPDH cDNA的PCR产物3L在1.5琼脂糖中进行电 泳,摄影后进行灰度扫描.以PreproET一1和GAP DH的PCR产物的DNA条带灰度比值(PreproET一 1/GAPDH)作为反应PreproET一1mRNA水平的相 对指标.所用试剂都来自Promega公司. 1.5统计学方法 所得数据均以(?)表示,组问比较用单因素 方差分析和t检验,P值小于0.05为有统计学意义. ?626?高血压杂志2005年1O月第13卷第1O期 ChinJHypertension,Oct2005,Vo1.13No10 2结果 2.1细胞培养 用细胞搏动和FITC标记的抗心肌细胞MHC 抗体检验细胞的纯度.结果显示心肌细胞的纯度大 于95%. 2.2细胞内DCF—DA荧光强度的分析(表1,图1) 表1各实验组心肌细胞内荧光强度及心肌细胞表达 内皮素1基因的参数值{?S,n=16) 组别内荧光强度内皮素1基因 对照51.44?7.44 E1+N,乙酰半胱氨酸53.89?6.38 Ang1i+N一乙酰半胱氨酸53.84?6.37 E1107.39?6.81a AngU105.32?6.04a 0.47?0.03 0.48?0.04 0.49?0.02 0.71?0.07a 160.72土0.06a a:P<0.01,与对照组比较 实验分组各组荧光强度组间比较用单因素方差 分析,P值<O.01,组间有显着性差异(与对照组相比 较),单独加用内皮素组心肌细胞内DCF—DA荧 强度增强108.8(P<0.01图2B);单独加月 Ang?组心肌细胞内DCF—DA荧光强度增强 104.9(P<O.01图2C);内皮素合用N,乙酰爿 胱氨酸组心肌细胞内DCF,DA荧光强度仅增礁 4.8(P一0.36图2D);Ang?合用N一乙酰半胱耋 酸组心肌细胞内DCF_DA荧光强度仅增强4.6%(j 一0.34图2E). 120 世80 嘎 米 411 0 1:对照组;2:ET+N一乙酰半胱氨酸;3:Ang?+N一乙酰半胱氨 酸;4:内皮素;5:血管紧张素?;a:P<O.O1,与对照组比较 图1各实验组心肌细胞内荧光强度 A:对照组;B:ET-1;C:Ang?;D:ET-1+N一乙酰半胱氨酸;E:Ang?+N_乙酰半胱氨酸 图2对照组及各实验组心肌细胞内荧光含量 2.3心肌细胞内皮素基因表达结果(表1,图3) 实验分组各组内皮素基因表达相对量组间比较 用单因素方差分析,P值<O.01,组间有显着性差 异.和对照组相比,单独加用内皮素组心肌细胞表 达Prepro—ET相对量增加52.4(P<0.01);单 独加用Ang1I组心肌细胞表达Prepro—ET相对 增加51.1%(P<O.01);内皮素合用N一乙酰半剧 氨酸组心肌细胞表达Prepro,ET相对量增加3.8 (P一0.098);Ang1I合用N,乙酰半胱氨酸组心 细胞表达Prepro—ET相对量增加2.9(P= 高血压杂志2005年1O月第13卷第1O期 ChinJHypertension,Oct2005,Vo1.13No10?627? 0.285). 1oo 25o 5oo 7oo 基T.' GAPDH ABCDEF A:Marker;B:Ang?;C:ET-1;D:Ang?+N一乙酰半胱氨酸:E: ET-1+乙酰半胱氨酸;F:对照组 图3缩血管因子及抗氯化剂对心肌细胞内皮素基因表达的影响 3讨论 缩血管因子(AngII,ET-I等)能够浓度依赖 性的促进心肌细胞内产生ROS并引起心肌细胞肥 大C:-23,而抗氧化剂如辛伐他汀],N_乙酰半胱氨 酸1可以明显的抑制缩血管因子所引起的心肌细胞 的肥大.本实验观察到ET-1和AnglI都可以诱 导心肌细胞内产生ROS,而具有抗氧化作用的N一乙 酰半胱氨酸则可以明显抑制缩血管因子所诱导的细 胞内ROS的增加.同时观察到缩血管因子可以增 强心肌细胞内皮素基因的表达,而具有抗氧化作用 的N一乙酰半胱氨酸则可以完全性的阻断缩血管因 子的这种作用,说明缩血管因子促进心肌细胞肥大 的同时增强心肌细胞内皮素基因的表达也是通过 R0S介导的,但是其具体作用的靶点目前还不太清 楚,有待今后进一步阐明. 同时有实验证实心肌局部内皮索在心肌由代偿 性肥大到充血性心力衰竭的过程中起到不可忽略的 作用],而在心衰病人血浆中的内皮素(ET一1),血 管紧张素(Ang?)L1叩等缩血管因子的水平明显增 高,ACEI类药物治疗心衰的疗效已被循证医学证 实.根据本实验所观察到的结论可以推测缩血管因 子增加心肌细胞对内皮素的旁分泌作用,而局部内皮 素的增多又加重心衰,因此形成了一个恶性循环. 在这个循环中起连接作用的是氧活性产物(Ros), 因此选用适合的药物进行抗ROS治疗可能在病理 性的心肌肥大及其向心衰转化和慢性心衰中都是有 益的. 4参考文献 1阮长武,戴闺柱.内皮素对培养大鼠心肌细胞肥大及肌球蛋白基 因表达影响的研究[J].临床心血管病杂志,1997,13. 2NakagamiH,TakemotoM,LiaoJK.NADPHoxidase-derived superoxideanionmediatesangiotensinII-inducedcardiachyper— trophy[J].JournalofMolecularandCellularCardiology,2003, 35:851-859. 3YanagisawaM,KuriharaH.KimuraS.Anovelvasoconstric— torpeptideproducedbyendothelialcells[J].Nature,1998,332: 41卜415. 4MinchenkoAG,StevensMJ,WhiteL,eta【.I)iabetes-induced overexpressionofendothelin一1andendothelinreceptorsinthe ratrenalcortexismediatedviapoly(ADP—ribose)polymerase activation[J].FASEBJ,2003,17:1514—1516. 5ChomcczynskiP,SacchiN.SinglestepmethodofRNAisola— tionbyacidguanidiniumthiocyanate_phenol—chloroformextrac— tion[J].AnalBiochem,1987,162:156—159. 6MoridairaK,NoderaM,SatoG,eta1.Detectionofprepro- ET-1mRNAinnormalratkidneybyinsituRT-PCR[J].Neph— ronExpNephto[,2003,95;E55—61. 7TakemotoM.NodeK,NakagamiH.eta1.Statinsasantioxi— danttherapyforpreventingcardiacmyocytehypertrophyEJ].J ClinInvest.2001,108:1429-1437. 8MasanoriA,MasafumiK,SeijiT,eta1.Cardiachypertrophy isinhibitedbyantagonismofADAM12processingofHB-EGF: ?【etaIloproteinaseinhibitorsasanewtherapy[J].NatureMedi— cine8.2002,35-40. 9YoshitakaI,YasukiK,KojiH,eta1.Endothelin-1playsa criticalroleinthefunctionaldeteriorationofleftventriclesdur— ingthetransitionfromcompensatoryhypertrophytocongestive heartfailureinsalt-sensitivehypertensiverats[J].Circulation, 1998,98:2065-2073. 10ZdrengheaD,PopD,BodizsG,eta1.TheacuteeffectofACEI andARBsuponendothelininheartfailurepatients[J].RomJ InternMed,2003.41,387—393.