临床分离产头孢菌素酶阴沟肠杆菌的耐药性研究

临床分离产头孢菌素酶阴沟肠杆菌的耐药性研究 【关键词】 临床 摘要 目的:研究我院产头孢菌素酶(AmpC酶)阴沟肠杆菌的检出率、耐药情况及ampC基因型。方法:收集临床分离的耐药阴沟肠杆菌15株;三维试验AmpC酶;NCCLS方法检测超广谱β内酰胺酶(ESBLs);琼脂二倍稀释法测定MIC值;PCR扩增检测ampC基因及序列测定。结果:15株菌中8株菌(53.3%)产AmpC酶，3株菌(20.0,)产ESBLs。产AmpC酶的菌株除对亚胺培南全敏感外，对其它抗菌药不同程度耐药。5株菌的ampC基因与阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因100,同源，3株菌与之99,同源，2株菌的AmpC酶发生了1个氨基酸残基的改变。结论:产AmpC酶是阴沟肠杆菌对β内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一。阴沟肠杆菌ECLC074 ampC基因是我院主要的阴沟肠杆菌ampC基因型。产AmpC酶的阴沟肠杆菌常呈多重耐药，亚胺培南是治疗此类菌所致感染的最有效药物。 关键词 阴沟肠杆菌;头孢菌素酶;ampC基因;耐药 阴沟肠杆菌是一种重要的条件致病菌，随着新的β内酰胺类抗生素广泛应用于临床，此类菌的耐药问题越来越受到人们的关注。细菌通过产生大量的由染色体或质粒介导的β内酰胺酶(Bla)可使抗生素失活，包括头孢菌素酶(AmpC酶)、超广谱β内酰胺酶(ESBLs)、碳青霉烯酶等。AmpC酶由ampC基因编码，常见于阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、粘质沙雷氏菌等。为明确本地区医院感染阴沟肠杆菌的耐药机制，指导临床合理使用抗菌药，本文对产AmpC酶的阴沟肠杆菌的耐药型和ampC基因进行初步研究。 1 与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株 川北医学院附属医院2003年2月至2004年1月分离的耐哌拉西林阴沟肠杆菌15株，经梅里埃vitek 32细菌鉴定系统鉴定。E. coli JM109由四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室提供。质控菌株大肠埃希氏菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603由四川抗菌素工业研究所提供。 1.1.2 主要试剂 哌拉西林(齐鲁制药厂)，哌拉西林/他唑巴坦(上海先锋药业公司)，头孢哌酮、头孢哌酮/舒巴坦(哈药集团制药总厂)，头孢他定、头孢噻肟(哈尔滨誉衡药业有限公司)，氨曲南、头孢吡肟(中美上海施贵宝制药有限公司)，亚胺培南 (美国默沙东药厂)，头孢西丁(海南轻骑海药股份有限公司)，AMK (江苏吴中实业股份有限公司)，加替沙星(南京圣和药业赠)，环丙沙星(中国药品生物制品检定所)。头孢他定/克拉维酸纸片、头孢他定纸片、头孢噻肟/克拉维酸纸片/头孢噻肟纸片、头孢西丁纸片购于北京天坛药物生物技术开发公司。DNA凝胶回收试剂盒购于Vgene生物技术有限公司。基因组小量抽提试剂盒购自上海Sangon生物工程技术有限公司。pMD 18T Vector购于TaKaRa公司。 1.1.3 主要仪器 Sakuma MITP细菌多点接种仪，MJ Research PTC150型PCR仪，GDS2000多功能凝胶成像和分析系统。 1.2 方法 1.2.1 Bla粗提液的制备及Bla的定性检测 超声破碎法制备，Nitrocefin进行酶的定性检测。 1.2.2 AmpC酶的检测 通过三维试验 ,1,判断是否持续高产AmpC酶。 1.2.3 ESBLs酶的检测 根据2002年NCCLS的规定进行。 1.2.4 药敏试验 采用琼脂二倍稀释法 。根据2002年NCCLS的标准判断。 1.2.5 基因组DNA的提取 使用基因组小量抽提试剂盒，按说明操作。 1.2.6 设计引物及PCR扩增检测ampC基因 根据已知的阴沟肠杆菌ampC基因序列，设计引物 P1: 5'gactcgctattacggaag3' P2: 5'ttactgtagcgcctcgag3' 引物由上海Sangon生物工程技术有限公司合成。以基因组DNA为扩增ampC基因。PCR扩增条件为: 94? 3 min，55? 1min，72? 1min，共30个循环，最后72?延伸 7min。扩增产物进行1,琼脂糖凝胶电泳检测。 1.2.7 ampC基因PCR产物的回收、TA克隆及重组质粒的酶切鉴定 PCR扩增产物经1,琼脂糖凝胶电泳，切下目的带，用DNA凝胶回收试剂盒回收DNA。取3μl回收DNA与含氨苄西林抗性基因的pMD 18T Vector连接，连接反应液转化至经氯化钙制备的E. coli JM109感受态细胞，经含氨苄西林的LB培养基进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，过夜培养后，提取质粒经EcoRI和 Hind?双酶切鉴定。 1.2.8 扩增产物的序列测定及同源性分析 转化菌送上海基康生物公司进行DNA测序，测序结果在GenBank上用BLAST进行同源性检索分析。 2 结果 2.1 Bla的定性检测 所试菌均产Bla。 2.2 AmpC酶的检测结果 所试菌中8株菌持续高产AmpC酶,检出率为53.3,。 2.3 ESBLs的检测结果 所试菌中3株(20.0,)产ESBLs，8株产AmpC酶的细菌均不产ESBLs。 2.4 MIC测定结果 8株产AmpC酶的细菌对第三代头孢菌素、头孢西丁及氨曲南完全耐药，对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟的耐药率分别为25.0,、50.0,、50.0,，对亚胺培南无耐药株，1株菌对阿米卡星耐药，1株菌对环丙沙星及加替沙星敏感(表1)。 表1 抗菌药对8株产AmpC酶阴沟肠杆菌的抗菌活性(略) 2.5 PCR扩增检测ampC基因 产AmpC酶的8株菌扩增出约1100bp的阳性扩增带(图1)。 图1 8株阴沟肠杆菌ampC基因PCR产物电泳图(略) 2.6 ampC基因核苷酸序列及氨基酸序列分析 扩增产物经TA克隆后测序得知，8株菌的ampC基因为1146bp，与阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因核苷酸序列(1146bp, 注册号AY536040)及氨基酸序列对比分析(图2)，5株菌与其核苷酸序列100,同源，其余3株菌与其核苷酸序列99,同源。其中，阴沟肠杆菌351的 ampC基因核苷酸序列发生了5个位点的同义突变;阴沟肠杆菌394 的ampC基因核苷酸序列在506位发生T?C的异义突变;阴沟肠杆菌3107的ampC基因核苷酸序列发生了2个位点的同义突变和1个位点的异义突变(表2)。 图2 阴沟肠杆菌ECLC074AmpC酶的氨基酸序列(略) 表2 Ecl351、Ecl394、Ecl3107与ECLC074的ampC基因及AmpC酶的差异性核苷酸(略) 3 讨论 AmpC酶属Bush1型Bla，能水解第三代头孢菌素，不被克拉维酸抑制。一般情况下，阴沟肠杆菌未接触β内酰胺类抗生素时，AmpC酶呈低水平表达，但能在具有诱导力的β内酰胺类抗生素(尤其是IMP、FOX)的作用下诱导产生;也可因调控基因ampR、ampD等高自发性突变使ampC基因去阻遏，从而持续大量的产生 ,2,。近年来法国、美国 ,3,、巴西 ,4,等西方国家报道了由产ESBLs阴沟肠杆菌引起的医院感染，从而说明产生ESBLs是造成该类菌对β内酰胺类抗生素耐药的另一重要原因。本实验中，产AmpC酶菌的高检出率(53.3,)说明产AmpC酶是本地区医院感染阴沟肠杆菌对β内酰胺类抗生素耐药的主要机制。3(20.0,)株菌产ESBLs，可见产生ESBLs是该类菌的另一耐药机制。8株产AmpC酶阴沟肠杆菌的ampC基因与阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因高度同源，说明本院产AmpC酶阴沟肠杆菌的ampC基因起源于阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因，此基因是该类菌的主要基因型，携带此基因的阴沟肠杆菌可能在院内流行。与阴沟肠杆菌ECLC074的AmpC酶氨基酸序列相比，2株阴沟肠杆菌的AmpC酶发生了1个氨基酸残基的变异，但丝氨酸Bla所共有的活性结合位点SXXK ,5,，AmpC酶的特征性结构YXN、KTG ,6,以及Thr70 ,7,均未发生变化。要明确AmpC酶氨基酸残基的变异是否影响其水解底物的活性，有待进一步探明。 药敏试验显示产AmpC酶阴沟肠杆菌对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、亚胺培南以外的β内酰胺类抗生素完全耐药。以往认为第四代头孢菌素头孢吡肟可用于治疗高产AmpC酶细菌引起的感染，但本实验发现50.0,该类菌对头孢吡肟耐药，耐药机制显然与高产AmpC酶有关。AmpC酶对β内酰胺酶抑制剂不敏感，而实验中β内酰胺酶抑制剂不同程度降低了产AmpC酶阴沟肠杆菌的耐药率，未发现此类细菌产ESBLs，说明部分细菌同时产生对β内酰胺酶抑制剂敏感的其它Bla如广谱酶、青霉素酶等。对亚胺培南无1菌株耐药提示碳青霉烯类抗生素在治疗高产AmpC酶菌引起的感染中发挥着重要的作用。阿米卡星对产AmpC酶阴沟肠杆菌的耐药率为12.5,，显示阿米卡星是治疗该类细菌所致感染的有效药物，此和国内的其它实验报道一致 ,8,9,。产AmpC酶阴沟肠杆菌对FQNS呈现高度耐药，表明该类细菌同时存在耐FQNS的机制，其机制是细菌DNA螺旋酶的改变、外膜渗透性降低或是药物的主动外排，需进一步探讨。 由此可见，多重耐药现象、多种耐药机制普遍存在于阴沟肠杆菌，给临床治疗带来了困难。因此临床医生应提高警惕合理使用抗菌 药，以有效治疗及控制耐药菌的感染并延缓新型耐药菌的出现及 扩散。 参考文献 1 Coudron PE, Moland ES, Thomson KS. 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