重组甘精胰岛素药效学和药代动力学研究(可编辑)

重组甘精胰岛素药效学和药代动力学研究(可编辑) 重组甘精胰岛素药效学和药代动力学研究 重庆医科大学 硕士学位论文 重组甘精胰岛素药效学和药代动力学研究 姓名:曾敏莉 学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:周远大 20050501重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果.据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料,与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意. 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任. 御譬.譬. 学位论文作者签名:熏塑萱】日期 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后,发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅.学校可以公布学 位论文的全部或部分内容保密内容除外,可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文。 青獬? 论文作者签名: 国欧 指导教师签名: 日 期:丝茎: :重庆医科大学碰士研究生学位论文 符号说明 英文缩写 英文全称 中文译名 . 血清白蛋白 血尿素氮 . 糖尿病 心电图 糖化血红蛋白 心率 平均动脉压 丙二醛 中效胰岛素 氧自由基放免测定法 稳态葡萄糖输注速率 超氧化物歧化酶 链脲佐菌素胆固醇 甘油三酯血清总蛋白 血清黄嘌呤氧化酶重庆医科大学硕士研究 生学位论文 重组甘精胰岛素的药效学和药代动力学研究 摘要 研究背景和目的: 糖尿病作为一种慢性病已广为人知,伴随着人们寿命的延 长和生活水平进一步的提高,糖尿病将成为世纪对人类健康造成 主 要危害的疾病之’。控制血糖浓度是糖尿病治疗和防止糖尿病并发 症的关键‘。外源性的胰岛素主要应用于型糖尿病患者和用饮食、药 物疗法治疗无效的型糖尿病患者。在胰岛素治疗中,中、长效胰岛 素制剂存在变异性高、作用峰值明显及夜间低血糖危险性高的缺点【~ 。每天注射一次,大多数糖尿病患者不能维持小时基础胰岛素水 平,因此需要一种长效的胰岛素使患者每天只需要注射一次就能有效 控制血糖。现研制出了长效重组甘精胰岛素,重组甘精胰 岛素与人胰岛紊区别在于:胰岛素且链末端加上个精氨酸残 基,改变了胰岛素的等电点,由.升至.,使重组甘精胰岛素经 注射后在皮下条件下形成沉淀,可延长吸收及作用时间。将 的天门冬氨酸替换为甘氨酸使其六聚体结构更稳定,更适用于临 床瓢】。目前有关重组甘精胰岛素注射液毒理学安全性评价,药代动力 学、药效学研究国内尚无文献报道。本课旨在对国产重组甘精胰岛 素进行一般药理学,毒理学,药代动力学,药效学,毒代动力学,免 重庆医科大学硕二研究生学位论文 疫刺激等方面研究。为临床合理应用该药提供理论和实验的依据。并 进一步研究其缓释机理。 方法: 本实验通过急性毒性实验、一般药理学研究、局部刺激实验、药 代动力学实验、长期毒性试验和毒代动力学实验、药效学研究、免疫 毒性/免疫原性实验来探讨重组甘精胰岛素是否能作为临床有效的治 疗糖尿病药物。 结果: 急性毒性试验试验结果:重组甘精胰岛素注射液小鼠皮下注 射为./,%可信限为.~./。重组甘精胰 岛素注射液小鼠静脉注射为./,%可信限为 .~./。 一般药理学实验结果:重组甘精胰岛素注射液组与溶媒对照 组相比,组间动物步态活动、激怒次数、爬竿时间、自主活动次数有 显著差异.。重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量组皮下注 射给药后对血压、心电图无明显影响,与溶媒对照组比较无显著差异 .,对麻醉犬的呼吸幅度无明显影响但对呼吸频率有减慢作 用,各用药组问无显著差异.,但与溶媒对照组问有显著差异 .。 局部刺激实验和免疫原性实验结果:重组甘精胰岛素用药后 用法未能检测到给药后动物血清有抗抗体。病理组 织学未见明显异常。重组甘精胰岛素注射液皮下注射局部组织有慢重庆医科大学硕士研究生学位论文 性炎症细胞浸润,恢复期结束后注射部位皮下组织炎症细胞浸润逐渐恢 复正常。 长期毒性实验结果:重组甘精胰岛素注射液犬连续用药 周。犬一般体征、神经精神活动、体重、肝、肾功能、血液生化、脏 器系数、组织病理均未见明显损害,各用药组间无显著差异,与溶媒 对照组间亦无显著差异。 药效学实验结果:重组甘精胰岛素注射液较模型组能明显降 低血糖水平.,对血清甘油三酯的含量有降低作用但 .,对总胆固醇也有降低作用.,对糖尿病血清总蛋 白耶水平、血清白蛋白水平的降低有控制作用。重组甘精 胰岛素注射液对糖尿病大鼠血清活性的降低有显著升高作用伊 .。重组甘精胰岛素注射液对促氧化酶活性的升高有降 低作用.,重组甘精胰岛素大剂量组和阳性对照组对脂质过氧 化产物丙二醛含量的增加有明显降低作用.。对糖尿 病大鼠血尿素氮的含量、糖化血红蛋白的含量有降低作用.。 结果表明,受试药物重组甘精胰岛素注射液对所 致糖尿病大鼠脂肪、蛋白质、自由基代谢紊乱及对机体氧化损伤有明 显的治疗作用。通过建立犬高胰岛素一正常血糖钳夹技术结果表明, 重组甘精胰岛素注射液小剂量组与阳性对照组注射组组间 比较稳态葡萄糖输注速率无明显差异.,重组甘精胰岛素注射 液大剂量组与小剂量组相比,稳态葡萄糖输注速率明显高于小剂量组 .。表明两药具有相同的药物效价,且重组甘精胰岛素注射液重庆医科大学硕士研究生学位论文 呈剂量依赖性。 生物等效性研究试验结果:选用德国作为对 照。和皮下给药后有关药动学参数如下:消除半衰期 ,分别为..,.?.;为..,. ?./ 为.?.,.?.:~为. ?.,.?. /.,相对生物利用度为.%?.,各 药动学参数经方差分析,同时进行单双侧检验,结果表明和 之间无显著性差异。 毒代动力学实验结果:重组甘精胰岛素注射液对犬分 别给药周末和周末药动学表明,各剂量组给药后两次药动学参数 。删。,。。。, 。一,基本一致,尤其是变化不大,表明 所给药物剂量在机体代谢能力适合的范围内,对机体未产生超负 荷现 象。 缓释机理研究结果:和皮下给药后有关药动 学参数如下:消除半衰期/分别为..,..: 为.?.,.?./;为.?.,.?.。 结论: 重组甘精胰岛素注射液大剂量对动物神经精神系统和呼吸频 率有一定的抑制作用,但对心血管系统无明显影响。 未发现重组甘精胰岛素有免疫原性,皮下注射局部组织 有慢性炎症细胞浸润,停药后可恢复正常。 重组甘精胰岛素注射液能通过其降脂降糖作用达到治疗糖尿重 庆医科大学硕士研究生学位论文 病的目的。 重庆富进公司生产的重组甘精胰岛素注射液具有与德国 相同的药物效价,且重组甘精胰岛素注射液呈剂量依赖性。 重组甘精胰岛素注射液犬连续皮下注射给药无明显毒性发 生。 和皮下给药比较药代动力学特点为:皮下注 射后吸收缓慢,作用时间长,持续作用达 ,吸收后无明显的峰值 出现,表明有缓释作用。 关键词:重组甘精胰岛素,一般药理学,药效学,药代动力学, , 生物等效性,毒代动力学重庆医科大学硕士研究生学位论文 . 烈: 唔: . , 、., ,, , . , , , . 【~. , . ,重庆医科大学硕士研究生学位论文. . .. , . 【‘. , , ’ , . : ,, , , , , .:: % ./, ../. .~./. % ./,: , , 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ., ,. . . :,.:. . :, .: . :,,,重庆医科大学磺士研究生学位论文 .., . ? ,. , ? : . .. ,.士. /. ..,..,/ ..,.:. ..,.. ./.,? .%.. . :, . . . 重庆医科大学碗士研究生学位论文 : .: . ./; .,. ., .,. .. . ... , ,. . . .. . . , , , , 重庆医科大学硕士研究生学位论文 . , :, ,, ..重庆医科大学硕士研究生学位论文 重组甘精胰岛素的药效学和药代动力学研究 刖 吾 糖尿病是一种慢性疾病。由于胰岛细胞不能正常分泌胰岛素,因 而胰岛素 相对或绝对不足,以及靶细胞对胰岛素敏感性的降低,而引起糖、蛋白质、脂肪 和水、电解质代谢紊乱,使肝糖原和肌糖原不能合成。临床表现为血糖升高尿糖 阳性及糖耐量降低,典型症状为“三多一少”,即多饮、多尿、多食和体重减少; 随着病程延长,容易并发全身神经、微血管、大血管病变,并可导致心、脑、肾、 神经及眼等组织器官的慢性进行性病变,诸多并发症日趋增多,程度加重,成为 严重危害患者健康和生命的内分泌代谢性失调。糖尿病作为一种高发病率及危害 较大的全球性慢性疾病,已引起世界各国的普遍关注。 现有中、长效胰岛素制剂存在变异性高、作用峰值明显及夜间低血糖危险性 高的缺点。合成人胰岛素的出现是胰岛素发展史上具有划时代意义的里程碑。这 种合成人胰岛素与人体提取的胰岛素的化学组成和结构完全一样,是通过生物工 程,在基因重组的生物体内合成生产的。它没有异体抗原性,不会产生耐药,使 用非常安全。重组甘精胰岛素就是一种长效作用的合成人胰岛素。重组甘精胰岛 素 将人胰岛索链上天然排列在第位的氨基酸残基一天冬氨酸 置换为甘氨酸;在链上第位的氨基酸残基一苏氨酸上添加个精氨酸而合成 的胰岛素类似物。该制剂虽在.的酸性环境下溶解,但于.的中性条件 下呈结晶状态。注射到皮下组织中性环境后,可形成微沉淀物。这种沉淀物的形 成使胰岛素的分解、吸收及作用时间延长,可发挥长效作用【““。 目前有关重组甘精胰岛素注射液毒理学安全性评价,药代动力学研究药效学 研究国内尚无文献报道。本课题旨在对国产重组甘精胰岛素进行一般药理学,毒 理学。药代动力学,药效学,毒代动力学,免疫刺激等方面研究。为临床合理应 用该药提供理论和实验的依据。并进一步研究其缓释机理。重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一部分 重组甘精胰岛素注射液一般药理及安全性试验 重组甘精胰岛素是一种新的长效胰岛素制剂,为了评价该药的安 全性、观察重组甘精胰岛素对神经精神系统、心血管系统、呼吸 系统、 免疫毒性/免疫原性、局部刺激和长期用药对全身情况的影响特 进行本试验。 材料和方法 .动物: 健康合格一级种小鼠,体重,雌雄各半。平均体重..,由 重庆医科大学实验动物中心提供,许可证号:渝,环境设篪合 格证医动字第号。健康合格一级犬只,雌雄兼用,体重.~ .蚝,由四川省养麝研究所提供,动物实验设施合格证为川实动管 质第号, 实验动物质量合格证为川实动管质第号。 、受试药物及其配制: 受试药物 药品名称:重组甘精胰岛素注射液 提供单位:重庆富进生物医药有限公司。 生产批号: 标示量:./,含重组甘精胰岛素注射液,溶媒为.%间甲苯 酚,%甘油,值为.。 保存条件:冰箱保存 阳性对照药 药物名称: . 提供单位: 生产批号: 标示量:./,含重组甘精胰岛素注射液,溶媒为.%甲苯 ..重庆医科大学硕士研究生学位论文 酚,%甘油,值为.。 保存条件:冰箱内度保存。 .实验方法: .重组甘精胰岛素注射液急性毒性实验 ..参照文献【’】在室温。实验室中,将禁食种小鼠只,雌雄各 半,随机分为组,每组只;各试验组动物均行双侧大腿皮下给药,每侧./ 体重。参照预初试验结果,最高剂量组为./。最低剂量组为./。 组问剂量之比为:.。给药后观察天,自由饮水和觅食,记录各组动物服药 后的症状、体征及其死亡时间和数目。分组统计,按’法统计处理。 ..参照文献在室温实验室中,将禁食种小鼠只,雌雄各半, 随机分为组,每组只;各试验组动物均行尾静脉注射给药,每侧./ 体重。参照预初试验结果,最高剂量组为./。最低剂量组为./。 组间剂量之比为:.。给药后观察天,自由饮水和觅食,记录各组动物服药 后的疰状、体征及其死亡时间和数耳。分组统计,按’法统计处 理。 .重组甘耪胰岛素注射液对小鼠神经精神系统的影响 在室温?实验室中,选取小鼠只,雌雄各半,随机分为重组甘精胰岛素 注射液大剂量组./剂量为的/、中剂量组./剂量为小鼠 的/、小剂量组./剂量为小鼠的/和溶媒对照组,共 组,每组只。本实验各试验组动物行皮下注射给药,给药后观察小鼠不同时 间走完.所需时间、步态活动、翻正反射、逃避反应和对攻击活动的防御 能力等行为活动。 .重组甘精胰岛素注射液对小鼠激怒反应的影响 在室温实验室中,用药理生理多用仅一型,选定时间为连续, 频率为,刺激.秒,电压伏为阈电压,两两配对选取只雄性小鼠. 随机将选取的小鼠分为重组甘精胰岛素注射液大剂量组./、中剂量组 ./、小剂量组./和溶媒对照组等容量溶媒,共组,每组 对只小鼠。分别测试各组每对动物给药前激怒时所需刺激次数,然后休息 ,各试验组动物行皮下注射给药。于给药后,,和分别测试各 组每对动物激怒时刺激次数。分组统计各试验组用药前后激怒时刺激次数,与溶重庆医科大学硕士研究生学位论文 媒对照组检验,判断重组甘精胰岛素对中枢神经系统有无抑制作用。 .重组甘精胰岛素注射液对小鼠爬竿运动的影响 在室温实验室中,选取小鼠只,雌雄各半,随机将选取的小鼠分为重 组甘精胰岛素注射液大剂量组./、中剂量组./、小剂量组 ./和溶媒对照组等容量溶媒,共组,每组只小鼠。各组试验动 物均行皮下注射给药。选取直径、长 竹竿一根,竹竿外表包裹一层纱布, 放置于与地面成度倾斜位置。将动物置于药理生理多用仪?型电激怒盒 内,刺激电压为伏,连续,频率为,刺激.秒,使动物受电刺激后 沿竹竿最低处爬向顶端,记录各试验组动物走完竹竿所需时间。记录各试验组动 物于灌服相应药物前和后,,和爬完 所需时间。分组统计,每 组均行用药组与溶媒对照组间检验,判断重组甘精胰岛素注射液对中枢神经系统 无兴奋作用。 .重组甘精胰岛素注射液对小鼠自主活动的影响 在室温?实验室中,选取小鼠只,雌雄兼用,随机将选取的小鼠分为重 组甘精胰岛素注射液大剂量组./、中剂量组./、小剂量组 ./和溶媒对照组等容量溶媒,共组,每组只小鼠。各组试验动 物均行皮下注射给药。用电脑程控?型小鼠自主活动仪中国医学科学院药 物研究所出品记录小鼠活动次数,于各试验组动物给药前和给药后,, 和分别测试内小鼠的活动次数,分组统计各试验组用药前后活动次数, 各用药组间以及与溶媒对照组间检验,判断重组甘精胰岛素注射液对中枢神经系 统有无抑制作用。 .重组甘精胰岛素注射液对麻醉犬血压、心电图、呼吸频率和幅度的影响 给药及分组:参照《化学药品和治疗用生物制品研究指导原则》的要求, 选择出合格的犬只,按性别和体重均衡原则及随机原则分组,雌雄各半, 每组只。本实验设溶媒对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。 剂量设置:参照文献【】,取小鼠 /的/、/、/换算成犬的 剂量为./、./、./。则高、中、低剂量分别为./、 ./、./ ..重组甘精胰岛素注射液对麻醉犬血压、心电图的影响 雌雄兼用,随机将选取的犬分为 选取健康合格一级犬只 一重庆医科大学硕士研究生学位论文 重组甘精胰岛素注射液大剂量组./、中剂量组./、小剂量组 ./和溶媒对照组等容量溶媒,共组,每组只犬。各组试验动物均 行皮下注射给药。用%戊巴比妥钠溶液/静脉注射麻醉后,右股动脉插入 塑料导管,连接于.型多导生物信号分析系统第二军医大学生产,管内 用./肝素溶媒抗凝,记录血压。先记录给药前基础血压,观察,待血 压无明显变化后,各组动物再皮下注射给相应药物,于给药后分别记录、、 和动脉血压平均动脉压,分组统计各组动物变化,行给药组 与溶媒对照组间检验,判断药物对的影响。同时,用型心电图机 上海光电医用电子仪器有限公司生产测定给药前后导联心电图变化,分组 统计各组动物心率、波群时间、波电压、偏移幅度、 波电压、心率和心律变化。 ..重组甘精胰岛素注射液对麻醉犬呼吸频率和幅度的影响 选取健康合格一级犬只,雌雄兼用,随机将选取的犬分为 重组甘精胰岛素注射液大剂量组。/、中剂量组,/、小齐量组 ./和溶媒对照组等容量溶媒,共组,每组只犬。各组试验动物均 行皮下注射给药。用%戊巴比妥钠溶液/体重静脉注射麻醉后,用蛙心夹 夹住犬剑突处皮肤,垂直连接于?二道生理记录仪张力传感器,记录给药 前和给药后、、和呼吸频率和幅度变化,分组统计各组动物呼吸 频率和幅度的变化。 .重组甘精胰岛素注射液犬长期毒性试验 在实验室中,将只犬随机分为组,重组甘精胰岛素注射液大、中、 小剂量组,剂量依照《化学药品和治疗用生物制剂品研究指导原则》的有关 要求【,低剂量属基本安全剂量,应高于临床或整体动物最佳有效剂量。取小鼠 /的/、/、/换算成犬的剂量为./、./、 溶 ./。则高、中、低剂量分别为./、./、./ 媒对照组,每组只,雌雄各半,各组动物均行单笼喂养。给药前两周,观察各试 验组动物活动,神经精神状况,进食,大、小便,记录每只犬的体重,并检测血 液学、血液生化、肝功能、肾功能与心电图,各试验组动物均无 异常后,开始给 药。每天上午时按每只动物体重皮下注射药物一次,自由饮水,定量喂食,连 续给药周。每周量体重一次,并观察动物毛发、粪便等情况。于给药周末,重庆医科大学硕士研究生学位论文 检测各试验组犬心电图,并分别活杀各组只犬,收集各组动物血样,测肝功、 肾功以及血液生化和血常规。在裸眼下,对各组活杀犬进行解剖,观察心、肝、 脾、肺、肾、肾上腺、胰腺、垂体、前列腺、大脑、小脑、脊髓、胸骨、淋巴结、 膀胱、卵巢、甲状腺、胸腺、睾丸、附睾和视神经,并称重,计算心、肝、脾、 肺、肾、肾上腺、甲状腺、睾丸、子宫一卵巢、脑、前列腺等脏器系数,然后将上 述各组织器官用%福尔马林固定,脱水,石蜡包埋,切片,行病理诊断。余下 存活动物继续给药喂养,直至给药周为止。 .熏组甘精胰岛素注射液在犬的免疫毒性/免疫原性研究和局 部刺激试验 ..给药方案 在实验室中,将只犬随机分为组,重组甘精胰岛素注射液大、中、 小剂量组,剂量设计依照《化学药品和治疗用生物制剂品研究指导原则》的有关 要求【”,低剂量属基本安全剂量,应高于临床或整体动物最佳有效剂量。取小鼠 /的/、/、/换算成犬的剂量为./、./、 ./。则高、中、低剂量分别为./、 /、./。溶 媒对照组,临床上采用皮下注射。本研究采用,每天次。给药时间为每日 上午:,注射药液容量为每体重.。溶媒对照组注射相应容积的溶媒对照。 本制剂同类产品在国外已上市,因需长期控制血糖,在临床上的用药周期 不定,给药次,日。故本试验的给药期定为个月。 ..观测指标和方法 外周血淋巴细胞数、白细胞总数经用.一全血细胞计数仪检 测。犬血清中抗体。采用方法。稀释成适当浓度/ 的无保护剂包被孔酶标板,。过夜。用?洗板次,% 封闭。加稀释好的血清:,放置小时。用.洗板次。加酶标兔 ,。放置小时。用?洗板次,显色、终止 抗犬的,: 反应和测量,波长为。设阴性对照孔。值超过阴性对照孔.倍的样品 最大稀释倍数为抗体滴度。如有抗体出现,进一步检测其对活性的影响。 免疫器官病理组织学检查,受检脏器和组织包括脾、胸腺、肠系膜淋巴结。 取脏器和组织的标本,用中性福尔马林固定,石蜡切片和..染色后光镜下观察。 注射药物部位的一般药物反应和病理组织学检查。局部一般药物反应包括红重庆医科大学硕士研究生学位论文 肿、水肿、皮疹和皮肤增厚等,记录开始出现时间、程度、各剂量组反应动物数 等。注射药物局部病理组织学检查方法如下:给药结束和恢复期结束后,取组织 标本,用中性福尔马林固定,石蜡切片和染色后光镜下观察。 结果 重组甘精胰岛素注射液小鼠皮下急性毒性试验结果 .重组甘精胰岛素注射液小鼠皮下注射给药急性毒性试验 小鼠皮下给重组甘精胰岛素注射液后.分钟大剂量组动物开始全身肌肉痉 挛、四肢抽搐、运动困难、嗜睡、呼吸抑制死亡。多数动物于给药.左右死 亡,约占死亡动物总数的%。幸存动物于给药后左右恢复正常,一周内无 死亡现象发生,结果经法统计处理如表一所示。死亡动物经解剖,裸眼下 心、肝、脾、肺、肾、脑等器官无明显异常发现。 表重组甘精胰岛素注射液小鼠皮下注射 死亡动物经解剖,裸眼下心、肝、脾、肺、。肾、脑等重要器官无明显异常发现。 死亡动物于给药后有全身肌肉痉挛、抽搐、震颤、嗜睡、呼吸抑制死亡,多数动 物于给药后~死亡,推测动物死亡原因可能低血糖休克衰竭所致。重庆医科大学硕士研究生学位论文 .重组甘精胰岛素注射液小鼠静脉注射给药急性毒性试验 小鼠静脉给重组甘精胰岛素注射液后.分钟大剂量组动物开始全身肌肉痉 挛、四肢抽搐、全身无力、运动困难、嗜睡、呼吸抑制死亡。多数动物于给药~ 左右死亡,约占死亡动物总数的%。幸存动物于给药后左右恢复正常, 一周内无死亡现象发生,结果经法统计处理如表.所示。死亡动物经解剖, 裸眼下心、肝、脾、肺、肾、脑等器官无明显异常发现。 表重组甘精胰岛素注射液小鼠静脉注射 死亡动物经解剖,裸眼下心、肝、脾、肺、肾、脑等重要器官无 明显异常发现。 死亡动物于给药后有全身肌肉痉挛、抽搐、震颤、嗜睡、呼吸抑制死亡,多数动 物于给药后~死亡,推测动物死亡原因可能低血糖休克衰竭所致。 重组甘精胰岛素注射液对小鼠神经精神系统的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量小鼠皮下注射给药后,动物步态活动 每分钟在实验台上活动距离有明显改变,给药后.小时,小时动物步态活 动减慢,翻正反射降低,攻击和逃避反应差,与溶媒对照组问有明显区别。不同 时间走完.所需时间如表?所示,经统计处理,组间检验,结果表明重组 甘精胰岛素注射液与溶媒对照组间有显著差异.。重庆医科大学硕士研究生学位论文 表重组甘精胰岛素注射液舛小鼠步态活动的影响?, ?。,’. 重组甘精胰岛素注射液对小鼠激怒反应的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、量皮下注射给药后,分别测试,, 和小鼠激怒次数,各剂量组给药后.小时,小时与溶媒对照组问有明显差 异.,如表所示。试验结果表明重组甘精胰岛素对中枢神经系统有 抑 制作用。 表重妇甘精胰岛素注射液对小鼠激怒反应的影响土, 妯?, 壮 .士?? .:..?. ./ , ” ?. ? .:. ?,/ ??. .?. . /‘ / .?. “.?: / . / 啦叩 .’.重庆医科大学硕士研究生学位论文 重组甘精胰岛素注射液对小鼠爬竿运动的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量皮下注射给药后,分别测 试,, 和小鼠爬竿时间,结果用药组小时与溶媒对照组间有明显差异., 如 表.所示。 表重组甘精胰岛素注射液对小鼠爬竿运动影响土, 士/ .? .? .?. .?. .? ./“. . .? .士. .?. / . .士 .?. “. ?. /’ . ?. .?. .?. .?. /’ “,.‘. 重组甘精胰岛素注射液对小鼠自主活动的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量组小鼠皮下注射给药后, 分别测试, ,和小鼠内自主活动次数,结果表明各用药组间以及与溶媒对照 组间有显著差异.。结果如表所示。兰鏖墨坚量堡圭塑墅生堂竺 笙苎 表重组甘精胰岛素注射浇对小鼠自主活动的影响?,?, .. .?. .?. .?. .?. ./ . .??. .? .? ? ?. .?. .?. .? ?. . .?? .?. ?. .? “,’.’. 重组甘精胰岛素注射液对麻醉犬、心电图皿的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量皮下注射给药后.、、和 与溶媒对照组间无显著差异.。如表.所示。 表.重组甘精胰岛素注射液对麻醉天血压的影响士, 。 重组甘精胰岛素注射液各剂量组皮下注射给药后、、和对麻醉 犬心率、心律、心电图波群时间、波电压、偏移幅度与波均无明显影 响,与溶媒对照组比较亦无显著差异.,如表.、、、所示.重庆医科大学硕士研究生学位论文 表溶媒姐对麻醉犬电图、。率、律的影响 . %?. .?. ? .士. .?..:. .?. ? ‘士. ?..?. .士. .?. .. ?.雠 ? ? .:. : ?. .?. .士 : .?. :.表 重组甘精胰岛素注射液小剂量对麻醉犬电图、心率、心律的影响?, 一 ..?. .:?. .:?. .?. .:..士. .?.? .?. .:. ? .?. .: . ?. .女. .?. .:?. .? .?.脏 : . .?. ? .?. .: . ?.?重庆医科大学硬士研究生学位论文 ? , 表? 重姐甘精胰岛素注射液中剂量对麻醉犬心电图、率、心律的 影响缶 ” 士一一一????一一??~?????一??一? . .?. .. .?. .?. ?. .?士. .. .?. .?. .?. .?. ?. .?. 士. . .?. .?. 趾 .:. ?. .?. .. .? ?????一???一????????一一??一???一一 表. 重组甘精胰岛素注射液大剂量对麻醉犬心电图、率、心律的 影响?, :,苟 ??一一??一?????一??一?一????一一??一?一一?? .?一????~??一~?一??一???????.? .?. ?. .?. .?.?. ?. .?. ,?..? ?. .?. .??. .?. ?. .士. .仕. . .士. .? .?. ?. .? ..重庆医科大学硕士研究生学位论文 重组甘精胰岛素注射液对麻醉犬呼吸频率和幅度的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量皮下注射给药后、、和 对麻醉犬的呼吸频率有减慢作用对呼吸幅度无明显影响,各用药 组间无显著差异 .,与溶媒对照组间亦有显著差异.,如表.,.所示。 表.重组甘精胰岛素注射液对麻醉犬呼吸频率的影响土, 士,: 肚. .: . .?. .?. ::. .?. . ?. .土. .? .?. ?’ . ?. .?. .?. ?. ?.? .::. . 士. .? ’.表.重组甘精胰岛素注射液对麻醉犬呼吸幅度的影响?, 一 , 一一~一?‘‘‘。‘。?。一?‘?一一?‘‘?。‘‘。’。’’’?’?‘。。/ 一?????一???一~??一??~?一?一?????? .?. .? .: . .?. .?.士. .: .. .?. . ?. .士 士. .? .::..? .? ?. .:. .?. . .士. . 重庆医科大学硕士研究生学位论文 重组甘精胰岛素注射液长期毒性试验结果 .重组甘精胰岛素注射液对试验动物食欲、外观等的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量动物连续皮下给药周,有一例动物 死亡,该死亡动物为小剂量组动物,雌性,给药后一月死亡,死亡前一天觅食正 常,粪尿正常,精神状态良好,无明显病症。死亡后解剖记录:肺、肝、脾、胰、 胃肠外观无肉眼可见病变,心脏肉眼可见心包积液,心肌无出血点,‘肾脏肉眼可 见轻微肿胀,诊为病毒感染死亡而非药物所致。各试验组动物给药前后外观、神 经精神、行为未见明显改变,食欲正常,皮肤.眼、鼻、口腔粘膜,毛发均无明 显病变,各剂量组间无明显差别,与溶媒对照组间亦无差异。 .重组甘精胰岛素注射液对试验动物体重增长的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量组和溶媒对照组动物用药前和用药后 各试验组动物体重均呈持续增长趋势。经组间检验统计处理,各剂量组间体重改 变无显著差异.,各剂量组与溶媒对照组问亦无显著差异.。 . 重组甘精胰岛素注射液对试验动物肾功能的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量组与溶媒对照组动物给药前和给药, 周停药周后血清;肌酐,用 全自动生 化分析仪测定结果,经组间检验统计处理,各试验组问无显著差异., 各用药组与溶媒对照组间亦无显著差异.,表明重组甘精胰岛素注射液无 论大小剂量连续给药周对试验动物肾功能无明显影响。 .重组甘精胰岛素注射液对试验动物血液学的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、齐量组和溶媒对照组动物于给药前和给药 周,周,停药周后进行血液学、、和血小板以及细胞分类与凝 血时间检查,经用一全血细胞计数仪检测,结果经组间检验统 计学处理,各试验组间无显著差异,,各用药组与溶媒对照组间亦无显著 差异.,表明重组甘精胰岛素注射液连续服药周对血液学无明显影响。 .重组甘精胰岛素注射液对试验动物血液生化的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量组和溶媒对照组动物于给药前和给药 周,周停药后周后进行血液生化检测。用 全自动生化分析仪测定。结果经组间检验统计处理,各试验组间无显著差异 .,各用药组与溶媒对照组间无显著差异.,连续皮下注射给药重庆医科大学硕士研究生学位论文 周对试验动物血液生化无明显影响。 .重组甘精胰岛素注射液对试验动物心电图的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量组和溶媒对照组动物连续给药物周, 周,停药周末,对清醒犬心率、波幅、.间期、波宽、波幅、 段、波幅均无明显影响,结果经组间检验统计处理,各试验组间无显著差异 .,各用药组与溶媒对照组间无显著差异.,结果表明重组甘精胰 岛素注射液连续服药周对试验动物心电图无明显影响。 .重组甘精胰岛素注射液对试验动物主要脏器系数的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量组和溶媒对照组动物于给药周末 周末,分别将各试验组动物活杀/,停药后恢复观察动物周再杀余下动物。 取出各试验动物心、肝、脾、肺、肾、脑、甲状腺、胸腺、前列腺、睾丸、子宫、 卵巢、肾上腺等器官称重,计算出各器官脏器系数。结果表明,重组甘精胰岛素 注射液连续皮下给药周,各试验组动物脏器系数与溶媒对照组比较,无显著差 异。与停药恢复周后动物比较也无显著差异。 .重组甘精胰岛素注射液连续用药周对试验动物组织病理学的影响 重组甘精胰岛素注射液大、中、小剂量组和溶媒对照组动物于连续用药周 末,周末,各试验组动物活杀/,停药后观察恢复周末再杀余下/动物, 行大体解剖,一、肝、脾、肺、肾、脑、甲状腺、胸腺、前列腺、睾丸、子宫、 卵巢、肾上腺等器官裸眼下观察未见明显病变,各用药组动物与溶媒对照组间无 显著差异。经病理学切片检查,用药组大、中、小剂量组与溶媒 对照组之间 各脏器均未见明显病理改变。试验结果说明重组甘精胰岛素注射液连续用药周 对试验动物主要脏器无明显损害。但注射部位局部组织有慢性炎性反应和纤维组 织增生。停药后反应消失。 重组甘精胰岛素注射液在犬的免疫毒性/免疫原性研究试验结果 .外周血淋巴细胞 给药前及给药后不同时间各组的淋巴细胞分类百分数、淋巴细胞绝对值分别 见表.和?。重庆医科大学硕士研究生学位论文 表 犬皮下注射后外周血淋巴细胞数百分数的变化?% 阻 鼍 【, 表? 犬皮下注射后外周血淋巴细胞绝对值的变化%/酗啦 浊, .觑清抗体 采用法测定给药个月及停药周恢复期结束时犬血 清抗的抗体。结果未检测到抗体。 .给药周停药后周后免疫器官病理组织学检查 受检的免疫器官脾脏、胸腺、淋巴结未见明显异常。 重组甘精胰岛素注射液在犬局部刺激试验结果 .一般症状 首次给药后小时,给药组和溶媒对照组动物注射药物局部无异常发现。在 以后的给药和停药期间,溶媒对照组和用药组动物,注射部位无红肿、无血、皮 疹和增厚等异常反应。重庆医科大学硕士研究生学位论文 .病理组织学观察 溶媒对照组注射部位皮下组织无明显异常,底剂量组、中剂量组和高剂量组 注射部位皮下组织有少量炎症细胞,炎细胞反应程度与给药剂量似无关联。恢复 期结束后注射部位皮下组织炎症细胞浸润不明显。见附图,?,?,. 小结 %信限为 重组甘精胰岛素注射液小鼠皮下注射为./, ../。重组甘精胰岛素注射液小鼠静脉注射为./, %可信限为.~./。 重组甘精胰岛索注射液对动物神经精神系统有抑制作用、对心血管系统无明 显影响,对呼吸频率有一定的抑制作用。 重组甘精胰岛素注射液犬连续用药周。犬一般体征、神经精神活动、体 重肝、肾功能、血液生化、脏器系数、组织病理均未见明显损害,各用药组间无 显著差异,与溶媒对照组间亦无显著差异。但注射部位局部组织有慢性炎性反应 和纤维组织增生。停药后反应消失。 未见受试药对免疫器官的刺激性。未发现受试品有免疫原性。 重组胰岛素注射液皮下注射局部组织有慢性炎症细胞浸润,停药后反应消失 ?眭。重庆医科大学硕士研究生学位论文 第二部分 重组甘精胰岛素注射液药效学研究 利用链脲佐菌素建立大鼠糖尿病模型,研究了重组甘精胰岛素注射液 对糖尿病大鼠脂肪、蛋白质代谢紊乱的调节作用及对机体氧化损伤的保护作用。 通过建立犬高胰岛素一正常血糖钳夹技术评价重组甘精胰岛素注射液的药物效 价。 一重组甘精胰岛素注射液对糖尿病大鼠代谢紊乱的调节作用 材料和方法 材料 动物和饲料 健康合格清洁级大鼠,雌雄兼用,体重~,由重庆医科大学实 验动物中心提供,许可证号渝,环境设施合格证医动字第 号。饲料:蛋白质占%,碳水化合物占%,脂肪占%;高脂 饲料:在标准饲料中加入猪油,白糖,奶粉,鸡蛋,蛋 白质占%,碳水化合物占%,脂肪占% 药品、试剂 受试药物 药品名称:重组甘精胰岛素注射液 提供单位:重庆富进生物医药有限公司。 生产批号: 标示量:./,含重组甘精胰岛素注射液,溶媒为./甲苯 酚,%甘油,值为.。 保存条件:冰箱保存。 阳性对照药重庆医科大学硕士研究生学位论文 药物名称:【 撇 提供单位: 生产批号: 标示量:./,含重组甘精胰岛索注射液,溶媒为.%间甲苯酚, %甘油,值为.。 保存条件:冰箱内度保存 试剂 链脲佐菌素:‘公司出品。血糖试剂盒,甘油三酯.试剂盒 总胆固醇试剂盒,总蛋白试剂盒,血清白蛋:试剂盒,超氧化物 ,、脂质过氧化产物,、 歧化酶 黄嘌呤氧化酶试剂盒,血糖试剂盒,由南京建成生物工程研究所提供。批号 仪器.型紫外分光光度计,日本;型离心 机,广州会城无线电厂;..高速台式离心机,上海医疗器械六厂;电子 分析天平,德国;;电热恒温水浴箱,北京西城区医疗器械厂; .微型旋涡混合器,上海跃进医疗器械厂;低温医用冰箱,日本。 方法 .实验分组、剂量确定和给药方案 分组:按性别,体重,血糖值均衡的原则,将糖尿病模型大鼠只随机分为 组,每组只,雌雄各半。分为模型对照组,重组胰岛素注射液大,中,小剂量组, 和阳性对照组。 剂量确定:依照《化学药品和治疗用生物制剂品研究指导原则》 的有关要求, 低剂量属基本安全剂量,应高于临床或整体动物最佳有效剂量。依据动物急性毒 性试验结果,给予糖尿病大鼠胰岛素治疗按小鼠.的/,/,/给 药,则重组甘精胰岛素注射液大剂量组..蚧/,中剂量组./,小剂量组 ,/。阳性对照组为德国?,。 给药方法:模型成功后皮下注射胰岛素,注射部位为大鼠后肢外侧。 等容生理盐水 模型对照组. . 小剂量组. .眺 中剂量组. ..重庆医科大学硕士研究生学位论文 大剂量组. ./ 德. ./ . 等容生理盐水 正常对照组 .糖尿病模型的建立 采用高脂诱导腹腔内注射链厥佐菌素建立糖尿瘸大鼠模型【讥。大 鼠,适应性饲养周,随机抽出只,为正常组,喂以标准饲料,余下大鼠喂以高 脂饲料,后,按/体重的剂量一次性腹腔注射溶于.几柠檬 酸缓冲液。.,小时后测定尾静脉血糖,血糖水平./,持续天, 确认为糖尿病动物模型建立成功【”。 .检测的指标及方法 观察实验动物的一般临床表现,主要观察精神、进食、尿量、体重等。测 量初始给药时每组大鼠的体重,治疗结束时测每组大鼠的体重。 糖尿病大鼠治疗周后,禁食小时, 试验大鼠血糖、糖化血红蛋白测定 自由饮水。断头取血,其中一部分分离血清,采用葡萄糖氧化法试剂盒测定血糖 值。沉淀红细胞测定糖化血红蛋白值。 血清中、、、含量的测定糖尿病大鼠,治疗周,按上述方法 断食,取血,迅速以/离,分离血清,按试剂盒方法测定。 血清中、酶活性、含量的测定糖尿病大鼠,治疗周,按上 述方法断食,取血,迅速以/离,分离血清,按试剂盒方法测定。 .统计与分析 各组剂量资料的结果用算术平均数标准差表示。根据于《新药西药临 床前研究指导原则汇编》【】的有关新药药效学研究中统计处理的指导原则,选择 检验进行各组均数差异显著性检验。 结果 一般临床表现 模型组大鼠血糖维持在较高水平,并且明显多饮,多食、多尿、毛发灰暗、 生长缓慢,每笼均饲养只大鼠模型组饮水量为/只/天。重组甘精胰岛素注射重庆医科大学硕士研究生学位论文 液大、中、小剂量组,阳性对照组多饮,多食、多尿症状明显好于模型组,饮水 量约/只/天。 胰岛素治疗周内,正常对照组大鼠平均体重明显升高,这是正常的生理表现 模型组大鼠平均体重明显降低,表现出糖尿病多饮,多食,多尿体症;重组甘精 胰岛素注射液治疗组及阳性对照组大鼠平均体重也有上升趋势,说明通过胰岛素 治疗控制了糖尿病的发展进程见表.、图.、图. 表 重组甘精胰岛素注射液连续用药用对糖尿病大鼠体重的影响 【士,给药前和给药后周 ?浊 巷.;. ;. 重庆医科大学硕士研究生学位论文 图重组甘精胰岛素注射液连续用药周对 糖尿病大鼠体重的影响 一重组甘精胰岛素注射液连续用药周对糖尿病太鼠体薰的影 响. 舶 暑羔紫? 血糖 采用高脂诱导腹腔内注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型后,实验大 鼠血糖浓度有非常显著的升高,与正常对照组相比有显著性差异.重组甘 精胰岛素注射液连续用药周,大、中、小剂量,及阳性对照组大鼠血糖浓度较 模型组血糖浓度均有降低.。大剂量,中剂量及阳性对照组血糖浓度较治 疗前有所降低,小剂量降低不明显。表、图?重庆医科大学硕士研究生学位论文 表 重组甘精胰岛素注射液连续用药周对糖尿病大鼠血糖的影响 土,给药前和给药后周., /“. ” :‘. 图 重组甘精胰岛素注射液连续用药周对糖尿病 大鼠血糖的影响 醇 / ..重庆医科大学硕士研究生学位论文 重组甘精胰岛素注射液对糖尿病大鼠血清甘油三酯含量口、胆固醇含量、 总蛋白口、白蛋白含量的影响 重组甘精胰岛索注射液大、中、小剂量组,及阳性对照组与模型组相比对糖 尿病大鼠血清甘油三酯的含量有降低作用.,对总胆固醇的升高有降低作用 .,对糖尿病血清总蛋白水平、血清白蛋白水平的降低有控制作用表., 图?、?、?。 表 重组甘精胰岛素注射液连续用药周对糖尿病大鼠 血清甘油三酯含量、胆固醇含量、总蛋白、白蛋白含量的影响 ’给药前和给药后周?、、、 山 彤 妊, 。 ’ / // .?. .?. .?. .?, .?. .. .?. .. ..? .. .. .?. .. .. .?.? .?.? . .?. ,?. .?. . .?. .?.’ ..‘ .?.. :。. .?